本發(fā)明涉及一種高效分離制備單一分子量透明質(zhì)酸寡糖的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，簡稱HA)，俗稱玻璃尿酸，是一種由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖為重復雙糖單位，通過β(1-3)和β(1-4)糖苷鍵交替連接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人從牛玻璃球眼中首次提取獲得，廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領域。研究表明，分子量對透明質(zhì)酸的活性有很大影響，不同分子量的透明質(zhì)酸甚至表現(xiàn)出截然相反的活性。

透明質(zhì)酸以其獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤滑關節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴散及運轉(zhuǎn)，促進創(chuàng)傷愈合等。尤為重要的是，透明質(zhì)酸具有特殊的保水作用，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保濕性最好的物質(zhì)，被稱為理想的天然保濕因子，由于HA具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛應用于化妝品、食品和醫(yī)藥等行業(yè)領域。

根據(jù)文獻研究表明，分子量大小對HA的生物活性影響較大，不同分子量范圍的HA表現(xiàn)出截然不同的生理學功能。高分子量的HA(Mr>2×10⁶)由于具有較好的粘彈性、保濕性、抑制炎性反應、潤滑等功能，可應用于高端化妝品行業(yè)、眼科手術黏彈劑和關節(jié)腔內(nèi)注射治療。中等分子量的HA(介于1×10⁵-10⁶)具有良好的保濕性、潤滑和藥物緩釋作用，可廣泛用于化妝品、滴眼液、皮膚燒傷愈合及術后防粘連。低分子量的HA和寡聚透明質(zhì)酸，表現(xiàn)出非常強的生物活性，具有抑制腫瘤擴散、促進創(chuàng)傷愈合、促進骨和血管生成、免疫調(diào)節(jié)等作用，且易于滲透到真皮中，免疫細胞、細胞因子的激活劑。因此，小分子透明質(zhì)酸在食品保健、化妝品以及臨床醫(yī)療領域具有廣闊的應用前景。

透明質(zhì)酸經(jīng)過酶解得到的產(chǎn)物一般為多種O-HA的混合物，如果要制備不同糖殘基數(shù)的O-HA，必須經(jīng)過分離。Tawada等用陰離子交換色譜柱進行分離，將凍干的樣品溶于蒸餾水，通過陰離子交換色譜柱將不同殘基數(shù)的寡糖分離開，不同的O-HA片段用凝膠過濾脫鹽，然后用離心超濾裝置除菌除熱原，得到不同大小的O-HA。Ikegami-Kawai等用聚丙烯酰胺凝膠色譜進行分離，此外還有凝膠滲透色譜法(GPC)、HPLC法等分離方法。O-HA經(jīng)凝膠層析分離只能得到一定Mr范圍的混合物，不能制得單一分子量的O-HA。O-HA經(jīng)Bio-gel P6凝膠層析分離只能夠?qū)⒋蠓肿親A分離出來。Dowex1×2強陰離子交換層析不能完全將不同Mr的O-HA分離出來。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種利用離子交換柱實現(xiàn)單一分子量透明質(zhì)酸寡糖的制備方法。

所述方法包括以下步驟：

(1)以透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸得到透明質(zhì)酸寡糖混合物；

(2)使用離子交換柱HiPrep Q FF 16/10對透明質(zhì)酸寡糖混合物進行分離純化；

所述步驟(2)中，先使用10倍柱體積的緩沖液A沖洗柱子，再通過10倍柱體積的洗脫劑，以2mL/min的流速對色譜柱進行線性洗脫，；所述洗脫劑由緩沖液A、緩沖液B組成，其中NaCl濃度于100min內(nèi)從0提高到0.2mol/L，收集、合并同一峰對應的洗脫液；所述緩沖液A是50mmol/L的pH 8.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，所述緩沖液B是pH 8.5的0.5mol/L的NaCl緩沖液。

在本發(fā)明的一種實施方式中，緩沖液A的制備是稱取3.75g甘氨酸溶解于500mL去離子水，用5MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.5,加去離子水定容至1L；緩沖液B的制備是稱取29.22gNaCl溶于緩沖液A中，并定容至1L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟(1)是在發(fā)酵罐中加入900mL的水，并加入透明質(zhì)酸酶3.5×10⁷U和透明質(zhì)酸40g，并加水至1L，在45℃、轉(zhuǎn)速為700rpm條件下反應，反應11小時后高溫滅活。

本發(fā)明為解決規(guī)模化制備單一分子量透明質(zhì)酸寡糖的的問題，采用生物酶法催化降解HA，將制備的寡糖規(guī)模化分離和純化，實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)制備單一分子量的透明質(zhì)酸寡糖。本發(fā)明將單一分子量的透明質(zhì)酸寡聚糖進行分離，在工業(yè)上用于制備單一寡聚透明質(zhì)酸及其衍生體具有潛在而非常廣泛的價值。

附圖說明

圖1是罐中酶活3.5×10⁴U/mL的分子量變化趨勢圖；

圖2是水解產(chǎn)物的分離圖；

圖3是純化出的HA4的質(zhì)譜圖；

圖4是純化出的HA6的質(zhì)譜圖；

圖5是純化出的HA8的質(zhì)譜圖；

圖6是純化出的HA10的質(zhì)譜圖；

圖7是純化出的HA12的質(zhì)譜圖；

圖8是純化出的HA14的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

水解產(chǎn)物分離方法：

水解產(chǎn)物15000r/min離心20min后取上清，緩沖液A：50mmol/L，pH 8.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(稱取3.75g甘氨酸溶解于500mL去離子水，用5M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.5,加去離子水定容至1L)；緩沖液B：pH 8.5，0.5mol/LNaCl緩沖液(稱取29.22gNaCl溶于800mL緩沖液A中，并定容至1L)，使用柱子HiPrep 16/10Q FF(柱體積：20mL)美國GE公司。通過10倍色譜柱體積(CV)的洗脫劑，以2mL/min的流速對色譜柱進行線性洗脫，洗脫劑由緩沖液A、緩沖液B組成，其中NaCl濃度于100min內(nèi)從0提高到0.2mol/L，AKTA蛋白純化系統(tǒng)美國Amersham Biosciences公司。AKTA蛋白純化系統(tǒng)配備有96孔板收集裝置，每個孔收集1mL的洗脫液。分離結(jié)束后，將96孔板從AKTA中取出，將收集的溶液放入冰中保存。

水解產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測方法：

洗脫樣品15000r/min離心20min后取上清，稀釋至1mg/mL上樣。BEHAmide(100mm×2.1mm，1.7μm)美國Waters公司；Waters Maldi synpat Q-TOF MS美國Waters公司，色譜條件：ESI-MS條件；色譜儀：Waters Acquity UPLC；分析色譜柱：BEHAmide 2.1×100mm1.7μm，柱溫：45℃，流速0.3mL/min，進樣量1μL，流動相：A：甲酸銨，B：乙腈，離子方式：ESI。質(zhì)譜條件：離子源參數(shù)ESI，霧化器壓力：30psi；脫溶劑氣體流速50L/hour；溫度400℃；負離子模式。可檢測出分離產(chǎn)物的成分。

實施例1規(guī)?；苽涮囟ǚ肿恿客该髻|(zhì)酸寡糖

以水蛭來源的透明質(zhì)酸酶對大分子量透明質(zhì)酸進行水解，大分子量透明質(zhì)酸的起始分子量大小為1.21×10⁶Da。在發(fā)酵罐中加入900mL的水，并加入透明質(zhì)酸酶3.5×10⁷U和透明質(zhì)酸40g，最后加水至1L，在45℃、轉(zhuǎn)速為700rpm條件下反應。每隔1小時取樣并將樣品在沸水中煮沸10分鐘以將酶滅活，然后采用0.22μm的濾膜過濾，使用凝膠柱進行分子量測定，繪制出分子量變化趨勢圖。如圖1所示的是，發(fā)酵罐中初始酶活3.5×10⁴U/mL條件下透明質(zhì)酸分子量隨時間的變化趨勢圖。

發(fā)酵罐在11小時高溫滅活，水解產(chǎn)物進行分離純化。將發(fā)酵罐中的水解樣品離心15000rpm、20min，并通過0.22μm的水系膜過濾，取10ml樣品，待緩沖液A將柱子沖洗10倍柱體積后，將樣品注入AKTA系統(tǒng)。通過10倍色譜柱體積(CV)的洗脫劑，以2mL/min的流速對色譜柱進行線性洗脫，洗脫劑由緩沖液A、緩沖液B組成，其中NaCl濃度于100min內(nèi)從0提高到0.2mol/L，AKTA蛋白純化系統(tǒng)配備有96孔板收集裝置，每個孔收集1mL的洗脫液。分離結(jié)束后，將96孔板從AKTA收集器中取出，如圖2所示水解產(chǎn)物的離子交換圖，將每個峰對應的96孔板中的洗脫液收集起來。將96孔板中收集的同一峰的洗脫液進行合并，合并后每一個峰的樣品通過透析袋進行脫鹽，之后將收集的樣品在-80℃進行冷凍，在冷凍干燥機中進行凍干。

凍干后的樣品使用咪唑硫酸法測定寡糖的純度，其中HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的產(chǎn)物得率分別為75％、64.5％、55％、43.5％、43％、40.5％。HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的產(chǎn)物得率分別為94％、91％、88％、87.5％、85％、82％、80.5％。對純化的樣品進行質(zhì)譜檢測，如圖3所示，是純化出HA4的質(zhì)譜圖；如圖4所示，是純化出HA6的質(zhì)譜圖；如圖5所示，是純化出HA8的質(zhì)譜圖；如圖6所示，是純化出HA10的質(zhì)譜圖；如圖7所示，是純化出HA12的質(zhì)譜圖；如圖8所示，是純化出HA14的質(zhì)譜圖。