本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種具有降解有機(jī)磷和抑菌雙重功能的解淀粉芽孢桿菌，以及含有該解淀粉芽孢桿菌的微生物菌劑，還涉及它們?cè)诖龠M(jìn)作物生長(zhǎng)和防病方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：磷是維持作物正常發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，是組成植物體內(nèi)核酸、多種酶和ATP等的重要成分，并且在參與植物呼吸作用和光合作用等新陳代謝活動(dòng)中起著其他元素不可替代的作用。作物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的磷主要來(lái)自肥料和土壤的供應(yīng)。土壤中的磷素是以無(wú)機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)兩種形式存在的，土壤中有機(jī)磷約占全磷量的40％-50％，它們?cè)谕寥乐兄饕灾菜猁}、磷脂、有機(jī)磷酸鹽等形式存在，其中植酸約占有機(jī)磷的10％-50％，是土壤有機(jī)磷的重要存在形式，磷脂占1％-5％，核苷酸占0.2％-2.5％，它們不能被植物直接吸收利用，它們必須在微生物的作用下轉(zhuǎn)變成可利用的無(wú)機(jī)態(tài)形式才能被吸收利用，而解有機(jī)磷微生物的解磷機(jī)理多為酶解，土壤中的植酸類有機(jī)磷可以通過(guò)有機(jī)磷細(xì)菌產(chǎn)生的植酸酶將其分解并釋放出磷酸，從而被作物吸收利用；另外土壤中的磷細(xì)菌可將核酸類有機(jī)磷通過(guò)自身產(chǎn)生磷酸酶水解為磷酸和糖類物質(zhì)，磷酸提供作物磷素營(yíng)養(yǎng)，而糖類物質(zhì)可以作為作物能量物質(zhì)。土壤中解有機(jī)磷的微生物有芽胞桿菌，如巨大芽胞桿菌(B.megatherium)、蠟狀芽胞胞桿菌(B.cereus)等；變形菌屬的一些種(Proteussp.)；沙雷氏菌屬的一些種(Serratiasp.)。芽孢桿菌(Bacilliussp)是一種受到廣泛關(guān)注的植物根際促生菌。具有分布廣、易分離培養(yǎng)、能產(chǎn)生抗逆性較強(qiáng)的芽胞、貯藏期長(zhǎng)和使用方便等特點(diǎn)，是一種理想的微生物肥料。因芽孢桿菌能產(chǎn)生內(nèi)生芽胞，有極強(qiáng)的抗逆能力，更有利于菌劑的生產(chǎn)，在劑型加工環(huán)境中存活、定殖與繁殖。因此，篩選對(duì)作物具有促生功能和對(duì)病原菌具有抑制作用的芽孢桿菌是實(shí)現(xiàn)“雙減”最有效方法之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種具有降解有機(jī)磷和抑菌雙重作用的解淀粉芽孢桿菌菌株，該菌株降解有機(jī)磷能力強(qiáng)，并且具有高效抑菌和抑菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明另一目的在于提供一種微生物菌劑。本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本發(fā)明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌在降解有機(jī)磷上的用途。本發(fā)明第五目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌促進(jìn)作物生長(zhǎng)的用途。本發(fā)明第五目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌防治棉花病害的用途。本發(fā)明第六目的在于提供上述微生物菌劑在降解有機(jī)磷上的用途。本發(fā)明第七目的在于提供上述微生物菌劑在促進(jìn)作物生長(zhǎng)上的用途。本發(fā)明第八目的在于提供上述微生物菌劑在防治棉花病害上的用途。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株P(guān)HYDL125，己于2016年9月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13036。本發(fā)明還提供了利用上述解淀粉芽孢桿菌PHYDL125生產(chǎn)的微生物菌劑，其活性成分為解淀粉芽孢桿菌PHYDL125菌體。上述微生物菌劑可以為液體制劑。上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：(1)菌種活化：將低溫保存的PHYDL125菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上，在25～35℃培養(yǎng)10～16小時(shí)，得活化的菌株；(2)種子液制備：用無(wú)菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟(1)活化的菌株接種到100mLLB液體培養(yǎng)基中，在25～35℃、搖床轉(zhuǎn)速為150～220rpm的條件下培養(yǎng)10～16小時(shí)，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：按照體積比為1～3％的比例將步驟(2)的種子液接入到玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基(pH值為7.2)中，在溫度為25～35℃、搖床轉(zhuǎn)速為150～220rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)40～50h，得發(fā)酵液；(4)檢測(cè)發(fā)酵液中菌體和芽胞數(shù)量，待發(fā)酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌體總數(shù)的90％時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為PHYDL125菌株的液體制劑。所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均按照常規(guī)方法制備。上述制備方法步驟(1)中所述的LB平板培養(yǎng)基或LB斜面培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，瓊脂粉12～18g，水1000mL。上述制備方法步驟(2)中所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，水1000mL。上述制備方法步驟(3)中所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分比為：玉米粉1.0～3.0％，黃豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～1.0％，MnSO4·H2O0.5～1.0％，其余為水。所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的制備方法，按照重量百分比將玉米粉、黃豆粉、NaCl和MnSO4·H2O混合，再加水，調(diào)節(jié)pH攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，所述的解淀粉芽孢桿菌PHODG36的活菌數(shù)大于1.8×108cfu/mL。上述解淀粉芽孢桿菌PHYDL125在降解有機(jī)磷上的應(yīng)用。上述解淀粉芽孢桿菌PHYDL125在促進(jìn)作物生長(zhǎng)上的應(yīng)用。上述解淀粉芽孢桿菌PHYDL125在防治棉花病害上的應(yīng)用。上述應(yīng)用中所述的棉花病害是指棉花黃萎菌(V.dahliae)、棉花枯萎菌(F.oxysporum)或棉花立枯菌(R.solani)等。上述微生物菌劑在降解有機(jī)磷上的應(yīng)用。上述微生物菌劑在促進(jìn)作物生長(zhǎng)上的應(yīng)用。上述微生物菌劑在防治棉花病害上的應(yīng)用。上述應(yīng)用中所述的棉花病害是指棉花黃萎菌(V.dahliae)、棉花枯萎菌(F.oxysporum)或棉花立枯菌(R.solani)等。上述微生物菌劑的使用方法：用水將上述所得微生物菌劑稀釋至活菌體數(shù)為107CFU/mL，于番茄移栽定植后進(jìn)行灌根即可。PHYDL125菌株的篩選分離過(guò)程2014年7月河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從河北省石家莊市駝梁山中五點(diǎn)采集土樣，稱取1.0g風(fēng)干土樣加入帶滅菌玻璃珠的三角瓶中，再加入99mL無(wú)菌水，靜置20min，在搖床上30℃、180r/min充分振蕩30min后，然后按10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-3，10-4，10-5的稀釋液100μL，涂布于解有機(jī)磷培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。涂好后在潔凈臺(tái)中靜置5-10min，待菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基內(nèi)，于35℃恒溫培養(yǎng)5-7d。并以透明圈法、鉬銻抗比色法、平板對(duì)峙法、盆栽試驗(yàn)法進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終篩選出具有解磷功能和抑菌功能的菌株，定名為PHYDL125。PHYDL125菌株的分類鑒定：(1)形態(tài)特征鑒定在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體為桿狀，培養(yǎng)10h后產(chǎn)生芽胞，芽胞中生，橢圓形，胞囊不膨大，抗酸染色陰性，無(wú)伴胞晶體，能運(yùn)動(dòng)，鞭毛周生。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤(rùn)；培養(yǎng)后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上劃線培養(yǎng)，呈直線形；在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)，表面形成白色菌膜。這些形態(tài)特征與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等編著.科學(xué)出版社.2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株P(guān)HYDL125屬于芽孢桿菌。(2)利用16SrDNA序列鑒定分類以PHYDL125的基因組DNA為模板，以27F和1492R為引物對(duì)16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；所述的引物序列為：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQIDNo:1)；1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'(SEQIDNo:2)。16SrDNA的PCR反應(yīng)體系為50μL：10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；rTaqDNA聚合酶(0.5U/μL)1μL，F(xiàn)27(10μmol/L)1μL，R1492(10μmol/L)1μL；PHYDL125的基因組DNA50ng；ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR的反應(yīng)條件為95℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序，得到PHYDL125的16SrDNA序列(見(jiàn)SEQIDNo:3)。將PHYDL125的16SrDNA序列在Genbank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果菌株與芽孢桿菌屬的16SrDNA同源性達(dá)到100％；同時(shí)利用MEGA軟件(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，分子進(jìn)化遺傳分析)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見(jiàn)圖1)，PHYDL125與芽孢桿菌屬聚合到一起，說(shuō)明PHYDL125屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。(3)利用gyrB基因序列鑒定分類以PHYDL125基因組DNA為模板，以芽孢桿菌gyrB基因兼并引物gyrB-F和gyrB-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列為：gyrB-F：5'-GAAGCACGGACAATCACC-3'(SEQIDNo:4)；gyrB-R：5'-TCCAAAGCACTCTTACGG-3'(SEQIDNo:5)；gyrB的PCR反應(yīng)體系為50μL：10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；rTaqDNA聚合酶(0.5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)2μL，gyrB-R(10μmol/L)2μL；PHYDL125基因組DNA50ng；ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR的反應(yīng)條件為95℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工生物工程有限公司測(cè)序，得PHYDL125菌株的gyrB基因序列(見(jiàn)SEQIDNo:6)。將獲得的PHYDL125菌株的gyrB基因序列在Genbank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHYDL125與解淀粉芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性最高，達(dá)到99％；同時(shí)利用MEGA軟件(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，分子進(jìn)化遺傳分析)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見(jiàn)圖2)，結(jié)果PHYDL125菌株與解淀粉芽孢桿菌聚合到一起，說(shuō)明PHYDL125為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且是一個(gè)新菌株。綜合以上形態(tài)特征、16SrDNA和gyrB基因序列同源性對(duì)比分析的結(jié)果，可知PHYDL125屬于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且和現(xiàn)有的芽孢桿菌菌株不同，是一個(gè)新的解淀粉芽孢桿菌菌株。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)本發(fā)明PHYDL125菌株降解有機(jī)磷效果好，為作物生長(zhǎng)提供肥效；同時(shí)對(duì)棉花黃萎病、枯萎病和立枯病的病原菌有很好的抑制作用，抑菌譜廣，為促進(jìn)作物生長(zhǎng)和病害防治提供了一個(gè)高效的微生物，開辟了一個(gè)有效促生防病途徑；(2)本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌PHYDL125肥效高，促進(jìn)作物生長(zhǎng)效果顯著，經(jīng)過(guò)菌株P(guān)HYDL125處理，番茄株高、地上鮮重、地下鮮重、基質(zhì)和植株磷含量比對(duì)照分別增加20.9％、18.8％、44.5％、43.5％和115.7％；(3)本發(fā)明微生物菌肥對(duì)人、畜安全，沒(méi)有環(huán)境污染問(wèn)題；(4)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、成本低、使用簡(jiǎn)單。附圖說(shuō)明圖1為根據(jù)16SrDNA序列獲得的PHYDL125菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2為根據(jù)gyrB基因序列獲得的PHYDL125菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。具體實(shí)施方式下面以具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步清楚地解釋本發(fā)明，但是不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1解淀粉芽孢桿菌PHYDL125微生物菌劑的制備按照如下步驟進(jìn)行：(1)菌種活化：將保存于-80℃的菌株P(guān)HYDL125(解淀粉芽孢桿菌菌株P(guān)HYDL125己于2016年9月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13036)在LB平板培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000mL)上進(jìn)行活化(30℃)，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培養(yǎng)12小時(shí)，得活化的菌株；(2)種子液的制備：按常規(guī)方法制作LB液體培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，水1000mL)，在250mL三角瓶中裝入LB培養(yǎng)液100mL，高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入一接種環(huán)步驟(1)中活化好的菌株，在30℃、搖床轉(zhuǎn)速190rpm的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得種子液；(3)玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的制備：按照重量百分比將玉米粉1.5％，黃豆粉2.0％，NaCl0.5％，MnSO4·H2O0.6％加入水中，攪拌混合均勻，即得玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基；分裝于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃對(duì)玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌30分鐘，再降溫到30℃?zhèn)溆茫?4)發(fā)酵培養(yǎng)：向步驟(3)所得每瓶玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基200mL中接種步驟(2)所得種子液2mL；在30℃、搖床轉(zhuǎn)速180rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進(jìn)行鏡檢，對(duì)視野中的芽胞和總菌體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞數(shù)/(成熟芽胞數(shù)+菌體數(shù))×100)；芽胞率達(dá)到90％時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；共發(fā)酵培養(yǎng)36小時(shí)，得解淀粉芽孢桿菌PHYDL125的液體制劑。實(shí)施例2解淀粉芽孢桿菌PHYDL125降解有機(jī)磷能力定性測(cè)定試驗(yàn)按照如下方法進(jìn)行：用滅菌牙簽將實(shí)施例1步驟(1)活化好的菌株P(guān)HYDL125點(diǎn)接接種在解有機(jī)磷平板培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.2g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.1g，MgCl2·6H2O5.0g，植酸鈣2.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH：7.0-8.0)上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，然后測(cè)量透明圈直徑及菌落的直徑。結(jié)果(見(jiàn)表1)解淀粉芽孢桿菌PHYDL125在含有植酸鈣的有機(jī)磷平板培養(yǎng)基上產(chǎn)生直徑22.0毫米的透明圈，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌PHYDL125能夠很好降解有機(jī)磷植酸鈣，具有降解土壤中有機(jī)磷的潛力。實(shí)施例3解淀粉芽孢桿菌PHYDL125降解有機(jī)磷能力定量測(cè)定試驗(yàn)本試驗(yàn)于2015年8月上旬在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。按照如下方法進(jìn)行：(1)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：按照重量比例將葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.2g、MgSO4·7H2O0.5g、KCl0.1g、MgCl2·6H2O5.0g、植酸鈣2.0g、瓊脂20.0g加入到蒸餾水1000mL中，混合均勻，既得發(fā)酵培養(yǎng)基，(2)發(fā)酵液制備：將步驟(1)中配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基按50mL/300mL裝量裝入錐形瓶中，高溫高壓滅菌；將實(shí)施例1步驟(2)制備的PHYDL125菌株種子液和空白對(duì)照培養(yǎng)液(不接種PHYDL125菌株的LB培養(yǎng)液)分別按照4％接種量接種在發(fā)酵液中，每組3個(gè)重復(fù)，在30℃、180r/min培養(yǎng)6d。(3)繪制OD720nm-磷標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別準(zhǔn)確吸取5mg/L的KH2PO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于50mL比色管中，加1～2滴2，4-二硝基苯酚作指示劑，用10％的NaOH和5％稀硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值，加水使各比色管的總體積達(dá)到30mL，搖勻；最后加入鉬銻抗試劑5.0mL混勻顯色，定容。30min后，在720nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，以磷濃度值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。獲得磷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y＝0.3951x-0.00133(R2＝0.99989，y＝OD值，x＝磷濃度)。(4)發(fā)酵液處理：將培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的離心杯中，采用KQ5200DE型數(shù)控超生波清洗器進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎條件：200-240V，2A，50/60Hz，時(shí)間20min。使之釋放出細(xì)胞內(nèi)的有效磷。以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min后取2.5mL上清液于50mL比色管中，加2滴2，4-二硝基苯酚作指示劑，用10％NaOH和5％稀硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值至溶液剛呈微黃色，加鉬銻抗顯色劑5mL，定容，反應(yīng)30min后。用T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液在720nm處的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出上清液中的有效磷含量。(5)結(jié)果計(jì)算：由樣品溶液比色所得吸收值在工作曲線上(y＝0.3951x-0.00133(R2＝0.99989，y＝OD值，x＝磷濃度)。算出相應(yīng)的比色溶液的含磷量(mg/L)，再按下式計(jì)算發(fā)酵液中有效磷含量：有效磷(mg/L)＝比色液的磷(mg/L)×稀釋倍數(shù)。表1解淀粉芽孢桿菌PHYDL125降解有機(jī)磷定量測(cè)定結(jié)果菌株名稱OD720(nm)可溶性磷含量(mg/L)PHYDL1251.20661.12結(jié)果(見(jiàn)表1)接種解淀粉芽孢桿菌PHYDL125的發(fā)酵培養(yǎng)液中可溶性磷含量與空白對(duì)照相比增加到61.12mg/L，表明解淀粉芽孢桿菌PHYDL125菌株具有降解有機(jī)磷植酸鈣的能力。實(shí)施例4解淀粉芽孢桿菌PHYDL125對(duì)促進(jìn)番茄生長(zhǎng)作用試驗(yàn)(一)試驗(yàn)處理：(1)處理1；植酸鈣+PHYDL125發(fā)酵液+缺磷營(yíng)養(yǎng)液；(2)處理2：植酸鈣+原發(fā)酵培養(yǎng)基+缺磷營(yíng)養(yǎng)液。(二)盆栽設(shè)計(jì)基質(zhì)為沙子，用水沖洗3遍，風(fēng)干備用，pH：6.4左右，有效磷：0.96mg/kg，底物(植酸鈣)1g/kg基質(zhì)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理1盆，每盆含有3棵番茄苗。(二)試驗(yàn)方法：本試驗(yàn)于2015年12月上旬在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行?；ㄅ?高：21cm、盆口直徑：22cm、盆底直徑：15cm)裝沙量4kg/盆(沙子用清水沖洗3遍，風(fēng)干備用)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄幼苗移栽于花盆中，每盆3株，置于溫室中培養(yǎng)，緩苗后開始試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理，處理1將實(shí)施例3步驟(2)制備的PHYDL125菌株發(fā)酵液稀釋液(濃度為1×107CFU/mL)300mL/盆澆灌于作物根部，處理2以澆灌等量的實(shí)施例3步驟(1)制備的原培養(yǎng)基稀釋液為對(duì)照。期間加強(qiáng)番茄病蟲害管理，適時(shí)補(bǔ)充水分，每次500mL/盆。5d澆一次缺磷營(yíng)養(yǎng)液(缺磷營(yíng)養(yǎng)液的組成成分見(jiàn)專利申請(qǐng)201110107663X)，每次300mL/盆。40d后測(cè)定番茄的株高、地上部鮮重和地下部鮮重、基質(zhì)中的有效磷以及番茄植株體內(nèi)磷含量等指標(biāo)。結(jié)果(見(jiàn)表2)與空白對(duì)照相比，接種菌株P(guān)HYDL125發(fā)酵液的番茄株高增長(zhǎng)率為20.91％，地上部鮮重增長(zhǎng)率為18.82％，地下部鮮重增長(zhǎng)率為44.55％，即接種菌株P(guān)HYDL125發(fā)酵液的番茄株高、地上部鮮重、地下部鮮重均與空白對(duì)照之間存在顯著差異，說(shuō)明本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌PHYDL125對(duì)番茄植株促生長(zhǎng)效果顯著。表2PHYDL125菌株對(duì)盆茄株高和鮮重的影響試驗(yàn)結(jié)果從表3中可以看出，經(jīng)過(guò)解淀粉芽孢桿菌PHYDL125處理后的土壤中有效磷增長(zhǎng)率為43.48％，說(shuō)明本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌PHYDL125對(duì)土壤中的難溶性植酸鈣具有很好的降解效果，另外，經(jīng)過(guò)菌株P(guān)HYDL125處理后的番茄植株中有效磷增長(zhǎng)率為115.71％。上述結(jié)果說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌PHYDL125菌株能夠有效降解土壤中的有機(jī)磷并促進(jìn)番茄植株對(duì)降解后的有效磷的吸收。表3PHYDL125菌株對(duì)基質(zhì)、番茄植株有效磷的影響試驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例5解淀粉芽孢桿菌PHYDL125對(duì)三種病害病原菌的抑制作用試驗(yàn)(一)供試病害病原真菌來(lái)源：(1)棉花黃萎菌WX-1：分離自河北省邢臺(tái)市威縣棉花黃萎病病株，經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)鑒定為大麗輪枝菌(Verticilliumdahaliae)。(2)棉花枯萎菌FOV-1分離自河北省邯鄲市曲周縣棉花枯萎病病株，經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)鑒定為尖孢鐮刀菌棉花?；?Fusariumoxyporiumf.sp.vasinfectum)。(3)棉花立枯菌RHS-1分離自河北省保定市高陽(yáng)縣棉花苗期立枯病病株，經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)鑒定立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，上述菌株致病力測(cè)定均表現(xiàn)為強(qiáng)致病力。(二)試驗(yàn)方法：2015年11月上旬在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。首先將供試的病原真菌在PDA平板上活化培養(yǎng)3-7天，然后用打孔器在菌落邊緣區(qū)域打孔制成菌片，接著將供試病原真菌菌片轉(zhuǎn)接在另一個(gè)PDA平板中央，再將實(shí)施例1步驟(1)活化后的解淀粉芽孢桿菌PHYDL125點(diǎn)接在距指示菌菌片2.0厘米處，設(shè)空白對(duì)照(不點(diǎn)接PHYDL125菌株)。在25℃恒溫培養(yǎng)3-10天，逐日觀察PHYDL125菌株和供試病原真菌的生長(zhǎng)情況，待空白對(duì)照病原菌長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，測(cè)量三種病原菌的對(duì)照生長(zhǎng)量(菌落半徑)和處理生長(zhǎng)量(接種PHYDL125后的抑制生長(zhǎng)半徑)，拮抗作用用抑菌率表示。抑制率的計(jì)算公式為：抑菌率(％)＝(對(duì)照生長(zhǎng)量-處理生長(zhǎng)量)/對(duì)照生長(zhǎng)量×100。結(jié)果(見(jiàn)表4)本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌PHYDL125對(duì)棉花黃萎菌抑制率為60.29％，對(duì)棉花枯萎菌的抑制率為72.11％，對(duì)棉花立枯菌的抑制率為76.58％，上述結(jié)果說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌PHYDL125對(duì)這三種病原菌具有明顯的抑制作用，具有防治棉花黃萎病、棉花枯萎病、棉花立枯病的生防潛力。表4PHYDL125菌株對(duì)三種病原菌的抑菌作用試驗(yàn)結(jié)果病原菌正常生長(zhǎng)(mm)抑制生長(zhǎng)(mm)抑菌率(％)棉花黃萎菌(V.dahliae)35.013.960.29棉花枯萎菌(F.oxysporum)38.010.672.11棉花立枯菌(R.solani)38.08.976.58當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3