本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及影響加系杜洛克日增重性狀的SNP位點及其在種豬遺傳改良中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

杜洛克原產(chǎn)于美國東部的新澤西州和紐約州等地，主要親本用紐約州的杜洛克和新澤西州的澤西紅雜交育成，原稱杜洛克澤西，后統(tǒng)稱杜洛克，分為美系和加系杜洛克；產(chǎn)于我國臺灣的杜洛克經(jīng)過培育自成風(fēng)格，因而稱臺灣杜洛克或臺系杜洛克。

由于杜洛克豬適應(yīng)性好，無應(yīng)激敏感現(xiàn)象，易飼養(yǎng)管理成功，具有增重快，飼料報酬高(料肉比為2.8～3.2∶1)，胴體品質(zhì)好、瘦肉率高等優(yōu)點，廣泛適合于工廠化養(yǎng)豬和農(nóng)戶飼養(yǎng)。

豬的日增重是一個重要的經(jīng)濟性狀。日增重與豬出欄時間正相關(guān)，越高的日增重代表更快的出欄速度。在常規(guī)選育中針對日增重的選育主要是在出生階段、24日齡、30kg、60kg、100kg階段稱重，然后挑選出日增重高的個體。但這個工作費時費力，因此開發(fā)一種快速，簡單，高效的分子選育方法，在生產(chǎn)中有很大的必要，將加快加系杜洛克日增重的遺傳進(jìn)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種與杜洛克日增重性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，所述SNP標(biāo)記的序列位于豬13號染色體，ASGA0056780，該位點上的堿基為G或A。

所述的SNP位點在杜洛克選擇育種中的應(yīng)用。

所述的SNP位點在鑒定杜洛克日增重中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供用于檢測前述的與杜洛克日增重性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的序列，包括：

引物序列

正向引物 AATAAGACACTGTTCTGAGGATGTAACAC

反向引物 TCATGGATCTGTGCGCTAAAGA

探針 ATGGAGAAAGGGCATAC。

本發(fā)明優(yōu)點如下：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個影響杜洛克日增重的SNP位點，本發(fā)明提供的SNP標(biāo)記不受杜洛克年齡、性別的影響，可用于杜洛克的日增重早期育種選擇，促進(jìn)育種過程。

附圖說明

圖1為83頭杜洛克表性質(zhì)分布圖；注：X軸代表表型值分布，Y軸代表密度分布，

ADGEBV：日增重估計育種值；Density:頻率分布。

圖2為加系杜洛克日增重全基因組關(guān)聯(lián)分析；

X軸為染色體名稱，Y軸為-logP值，Chromosome：染色體名稱

圖3為ASGA0056780基因型與表型的對應(yīng)值；

X軸代表基因型，Y軸代表日增重型值，Genotype：基因型，Phenotype：表型

具體實施方式

為了探究加系杜洛克日增重的遺傳機理，并開發(fā)一種快速、高效的與日增重選育相關(guān)的分子育種技術(shù)，本發(fā)明利用83頭杜洛克群體，通過全基因組關(guān)聯(lián)(GWAS)分析等方法，發(fā)現(xiàn)并鑒別了一個影響加系杜洛克日增重的SNP位點，在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還構(gòu)建一種快速、高效的分子判型技術(shù)。通過深入研究了不同基因型對應(yīng)的表型，確定了與日增重有關(guān)的基因型，通過對基因型的選擇，可以加快加系杜洛克日增重的遺傳進(jìn)展。

1、實驗動物 83頭加系杜洛克實驗群體，來源于杜洛克國家核心原種場。

83頭加系杜洛克日增重表型值如圖1所示，從圖1可知表型值符合正態(tài)分布。

2、實驗方法

DNA的提取/豬全基因組60K SNP判型

每頭豬均采集一小塊耳樣，用標(biāo)準(zhǔn)苯酚-氯仿法提取全基因組DNA，其具體步驟如下：

1、將耳樣剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul蛋白酶K和0.9ul RNaseA，混勻。

2、在熱孵育器中，55℃過夜。(剛開始可每隔30min搖晃一次)

3、取出EP管，加入等體積Tris平衡苯酚，用力搖晃3min；12000g，離心10分鐘。

4、輕輕吸取上清至一新的1.5mlEP管中。

5、向上清中加入等體積苯酚/氯仿，用力搖晃2分鐘；12000g，離心2分鐘。

6、吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10體積的醋酸鈉溶液和2.5倍體積的無水乙醇，搖勻。

7、12000g，離心1分鐘，盡可能吸除上層乙醇。

8、加入1ml，70％乙醇漂洗DNA，用力搖勻，以去除殘留的SDS和苯酚；

9、12000g，離心1分鐘，去除乙醇。

10、將EP管倒置在吸水紙上，以吸干乙醇。(9、10可重復(fù)一次)

11、用65℃預(yù)熱的無菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。

經(jīng)Nanodrop-NDIOOO分光光度計檢測質(zhì)量后統(tǒng)一將濃度稀釋至50ng/μI,在Illumina Beadstation平臺上根據(jù)公司標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行豬全基因組60K SNP芯片(Illumina，美國)基因型判定。利用plink_1.09軟件對所有樣本60K芯片掃描分型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除檢出個體率低于95％、家系孟德爾錯誤率高于0.1、最小等位基因頻率小于0.05且哈代-溫伯格平衡顯著性水平高于10-6的SNP，最終得到約4萬個SNP的有效基因型數(shù)據(jù)。

全基因組關(guān)聯(lián)(GWAS)分析

本實驗的采用的83頭杜洛克母豬均為加系杜洛克且來自一個場，因此不存在群體層化效應(yīng)，用PLINK進(jìn)行GWAS分析，基因組水平的顯著區(qū)域采用保守的Bonferrini校正方法確定，即基因組顯著水平閾值為＝0.05/40000(有效SNP數(shù)量)。

實驗結(jié)果

GWAS分析結(jié)果(圖2)。從圖2可知，在83頭杜洛克群體中，在豬13號染色體存在與加系杜洛克日增重相關(guān)的SNP位點：ASGA0056780(位于SSC13:27347572bp處)。GG基因型個體有更高的日增重。詳見圖3。表明ASGA0056780位點可以作為分子標(biāo)記對加系杜洛克日增重進(jìn)行選擇。

該突變穩(wěn)點可用以下序列檢測：

引物序列

正向引物 AATAAGACACTGTTCTGAGGATGTAACAC

反向引物 TCATGGATCTGTGCGCTAAAGA

探針 ATGGAGAAAGGGCATAC。

引物和探針進(jìn)行檢測SNP的實驗過程

實時定量Taqman PCR基因分型擴增體系：10μl反應(yīng)體系含3.4μl水，5μl 2×Taqman Genotyping Master Mix，0.2μl 10mM正向引物，0.2μl 10mM反向引物，0.1μl 10mM探針1(5′-FAM,3′-TAMRA)，0.1μl 10mM探針2(5′-VIC,3′-TAMRA)，1μl DNA。

實時定量Taqman PCR反應(yīng)程序：1、AD-pre read讀取初始背景(本底)熒光信號。2、AQ-PCR擴增：50℃，2min；95℃，10min；(95℃，15sec，各引物退火及延伸溫度60℃，1min)，40個循環(huán)。3、AD-post read讀取PCR反應(yīng)結(jié)束后熒光信號(終點讀法)，除去本底信號，分析后自動分簇得到判型結(jié)果。

<110>1/廣西柯新源原種豬有限責(zé)任公司，

2/漳州傲農(nóng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，

3/福建傲農(nóng)生物科技集團股份有限公司，

4/井岡山市傲新華富育種有限公司，

5/樂山傲農(nóng)康瑞牧業(yè)有限公司，

6/湖北三匹畜牧科技有限公司，

7/德州傲新育種有限公司

<120>一種與加系杜洛克豬日增重相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<160>3

210>1

<211>13

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>1

AATAAGACACTGTTCTGAGGATGTAACAC 13

<210>2

<211>11

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>2

TCATGGATCTGTGCGCTAAAGA 11

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>3

ATGGAGAAAGGGCATAC 16