本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種土壤類(lèi)芽孢桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微生物胞外多糖因其特殊的流變性質(zhì)，可作為增稠劑、懸浮劑或穩(wěn)定劑，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)。具有典型流變特征的微生物胞外多糖如黃原膠(Xanthan gum)能夠增加溶液的粘度，并且具有一定的耐溫性能，適度增加溫度后粘度基本保持穩(wěn)定；結(jié)冷膠(Gelan gum)水溶液在Ca²⁺存在條件下能夠形成不可逆的脆性凝膠；熱凝膠(Curdlan gum)不溶于水，但其懸浮液加熱至55℃后能夠形成熱可逆的彈性凝膠，加熱至80℃后可以形成熱不可逆的脆性凝膠；威蘭膠(Welan gum)具有良好的耐熱性質(zhì)，具有作為石油開(kāi)采用驅(qū)油劑的潛力。另一方面，相比于植物多糖和海洋藻類(lèi)多糖，微生物胞外多糖具有不受氣候影響、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便、成本低、便于大量制備等優(yōu)點(diǎn)(Williams P A,Phillips D L.Introduction to food hydrocolloids[M].WILLIAMS P A,PHILLIPS D L.Handbook of hydrocolloids.Woodhead publishing Ltd.2009.)。由此可見(jiàn)，性能優(yōu)良的微生物胞外多糖對(duì)民生相關(guān)行業(yè)發(fā)展具有促進(jìn)作用。

目前微生物胞外多糖在應(yīng)用中存在一定的限制因素。比如，為增加黃原膠溶液粘度只能通過(guò)提高黃原膠的添加量而無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單的后處理工藝實(shí)現(xiàn)；溶液中存在Ca²⁺或Mg²⁺限制了結(jié)冷膠的使用量；具有較高溫度的熱處理過(guò)程則會(huì)受到熱凝膠的影響。因此，對(duì)傳統(tǒng)微生物胞外多糖進(jìn)行化學(xué)改性或發(fā)現(xiàn)新型微生物胞外多糖顯得尤為必要。

研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)芽孢桿菌屬微生物具有產(chǎn)生新型胞外多糖的能力。土壤類(lèi)芽孢桿菌最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被歸類(lèi)為芽孢桿菌屬，后被重新命名為土壤類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus edaphicus)。土壤類(lèi)芽孢桿菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，其主要原因可能是因?yàn)樵摼軌蚪到獠⒐潭ㄍ寥乐须y利用的鉀，進(jìn)而促進(jìn)植物對(duì)鉀的利用(Sheng X F.Growth promotion and increased potassium uptake of cotton and rape by a potassium releasing strain of Bacillus edaphicus[J].Soil Biology&Biochemistry,2005,37(10):1918-1922.)。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)土壤類(lèi)芽孢桿菌能夠產(chǎn)生厚的胞外莢膜(何琳燕等.一株硅酸鹽細(xì)菌的鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[J].微生物學(xué)報(bào),2003,43(2):162-168.)。已經(jīng)證實(shí)與土壤類(lèi)芽孢桿菌親緣關(guān)系非常近的膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌同樣具有產(chǎn)生莢膜的能力，并且該莢膜為胞外多糖，并具有較好的生物絮凝作用(Tang J Y,et al.Production,purification and application of polysaccharide-based bioflocculant by Paenibacillus mucilaginosus[J].Carbohydrate Polymers,2014,113:463-470.)。因此可以推測(cè)，土壤類(lèi)芽孢桿菌具有產(chǎn)生新型胞外多糖的能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種土壤類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus edaphicus NUST16，能夠生產(chǎn)具有特殊流變性質(zhì)的水溶性胞外多糖。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案為：

一種土壤類(lèi)芽孢桿菌，為Paenibacillus edaphicus NUST16，保藏編號(hào)為CCTCC No.M2016542，已于2016年10月08日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心。

本發(fā)明的目的之二在于提供上述土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16的培養(yǎng)方法，具體步驟如下：將土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16接種到滅菌后、pH為6.0-9.0的培養(yǎng)基中，25-35℃下培養(yǎng)。

本發(fā)明的目的之三在于提供上述土壤類(lèi)芽孢桿菌在生產(chǎn)水溶性胞外多糖中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供上述土壤類(lèi)芽孢桿菌在生產(chǎn)水溶性胞外多糖的方法，具體步驟如下：

步驟1，將土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16接種到滅菌后的培養(yǎng)基中，25-35℃搖床震蕩培養(yǎng)形成種子培養(yǎng)液；

步驟2，按0.5％-20％接種量將種子培養(yǎng)液接種到滅菌后的培養(yǎng)基中，25-35℃搖床震蕩培養(yǎng)，獲得產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵液；

步驟3，在發(fā)酵液中加入沉淀劑A，發(fā)酵液中的沉淀經(jīng)過(guò)濾或離心，干燥后即得固體粗多糖，所述的沉淀劑A為95％-100％乙醇、95％-100％甲醇、95％-100％異丙醇和95％-100％丙酮中的一種或者多種。

步驟1中，所述的培養(yǎng)時(shí)間為12-48h。

步驟2中，所述的培養(yǎng)時(shí)間為48-96h。

步驟3中，所述的沉淀劑A與發(fā)酵液的體積比為2～4:1，所述的沉淀劑A為95％-100％乙醇、95％-100％甲醇、95％-100％異丙醇和95％-100％丙酮中的兩種以上溶劑按等體積混合而成的混合溶液。

本發(fā)明中，所述的培養(yǎng)基的組成為蔗糖5-50g/L，蛋白胨0.5-5g/L，NaH₂PO₄ 0.1-5.0g/L，CaCl₂ 0.01-0.5g/L，MgCl₂ 0.01-0.5g/L，KCl 0.01-0.5g/L，F(xiàn)eCl₂ 0.001-0.05g/L，CuSO₄ 0.001-0.05g/L，MnSO₄ 0.001-0.05g/L，ZnCl₂ 0.001-0.05g/L，CoCl₂ 0.001-0.05g/L，pH為6.0-9.0。

優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)基的pH為7.0-9.0。

更進(jìn)一步地，上述土壤類(lèi)芽孢桿菌在生產(chǎn)水溶性胞外多糖的方法，還包括如下步驟：

步驟4，將固體粗多糖溶于水中形成粗多糖溶液，加入處理液B并劇烈震蕩，靜置或離心分離有機(jī)相和水相，收集水相，并重新加入處理液B，重復(fù)3～10次，可得純化多糖，所述的處理液B為三氯甲烷、苯酚和正丁醇的混合溶液。

步驟4中，所述的粗多糖溶液的濃度為0.25～20g/L，所述的粗多糖溶液與處理液B的體積比1:(1～2)。

步驟4中，所述的處理液B中，三氯甲烷、苯酚和正丁醇的體積比為1:(0.5～1):(0.05～0.5)。

本發(fā)明的土壤類(lèi)芽孢桿菌菌株性質(zhì)獨(dú)特，能夠生產(chǎn)胞外多糖，產(chǎn)量可達(dá)15g/L，所產(chǎn)的胞外多糖易于分離和純化且性質(zhì)獨(dú)特，可直接溶于冷水，并且具有顯著的增加溶液粘度的作用，能夠耐受溶液中高濃度的Na⁺、K⁺、Ca²⁺和Mg²⁺，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的加熱-冷卻處理即可使溶液粘度數(shù)倍增加，且性質(zhì)穩(wěn)定，形成熱可逆凝膠。

附圖說(shuō)明

圖1是土壤類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus edaphicus NUST16菌株的平板菌落和顯微形貌圖。

圖2是胞外多糖組分測(cè)定的高效液相色譜圖。

圖3是4種無(wú)機(jī)鹽對(duì)胞外多糖粘度的影響結(jié)果圖。

圖4是重復(fù)加熱-冷卻處理對(duì)1g/L胞外多糖溶液粘度的影響結(jié)果圖。

圖5是重復(fù)加熱-冷卻處理對(duì)5g/L胞外多糖溶液粘度的影響結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。

實(shí)施例1

土壤類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus edaphicus NUST16的分離和鑒定。

(1)土壤類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus edaphicus NUST16的分離

本發(fā)明的土壤類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus edaphicus NUST16是在江蘇鹽城的濱海棕色土壤中分離得到。其中分離的方法為：

①菌株篩選：將土壤樣品分為10組，各組分別稱(chēng)取1g土樣加入到配制好的液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中在200rpm，30℃條件下培養(yǎng)2d進(jìn)行富集，然后從各組錐形瓶中取1mL菌液再次接入新的液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)2d再富集一次。再?gòu)母鹘M各取1mL富集后菌液加入到9mL無(wú)菌水中，混勻制成菌懸液，采用10倍梯度稀釋?zhuān)?0^-6-10^-4稀釋度的菌懸液涂布于固體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)。

②菌株純化：涂布好的平板培養(yǎng)2d，待長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取單一菌落在新的固體培養(yǎng)基上劃線，30℃下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后再挑選單一菌落劃線，此過(guò)程重復(fù)3-4次，直到培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的菌落均為單一形態(tài)的菌落使得菌株純化完全。然后挑選具有無(wú)色透明或半透明、有粘性等產(chǎn)胞外多糖特征的菌落編號(hào)后，分別接種至液體培養(yǎng)基中，200rpm，30℃條件下培養(yǎng)2-4d，若發(fā)酵液變粘，則鑒定胞外發(fā)酵產(chǎn)物是否屬于多糖。經(jīng)鑒定后發(fā)酵產(chǎn)物為多糖的菌株則是需要的產(chǎn)胞外多糖菌株，命名為NUST16。

(2)菌株的鑒定

a.形態(tài)特征：在無(wú)機(jī)鹽瓊脂固體培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)本菌株2-3天后觀察，菌落呈圓形，無(wú)色、半透明，表面有光澤，粘稠，不易挑起。菌株長(zhǎng)棒桿狀、分泌大量的胞外多糖。

b.生理生化特征：菌株革蘭氏陽(yáng)性，好氧，接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性，以葡萄糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)酸，培養(yǎng)基中含有1％NaCl時(shí)生長(zhǎng)良好。菌株可利用的碳源有蔗糖、淀粉、葡萄糖、乳糖，果糖利用能力弱，以乳糖為碳源時(shí)菌體生長(zhǎng)最好，蔗糖次之，在有機(jī)氮源蛋白胨中生長(zhǎng)好，在pH7-9的堿性條件下胞外多糖產(chǎn)量較高，發(fā)酵48h后胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)到15g/L。高濃度NaCl會(huì)抑制菌株生長(zhǎng)并降低胞外多糖產(chǎn)量，菌株不分泌色素。圖1中，A為固體平板培養(yǎng)基上的菌落，B為菌體在光學(xué)顯微鏡下的照片。

c.以菌株NUST16的基因組DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定其全序列，該菌株的16S rDNA基因序列見(jiàn)序列表。將菌株的16S rDNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank登陸號(hào)為KX962167)，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行網(wǎng)上同源性比較，結(jié)果表明，菌株NUST16與土壤類(lèi)芽孢桿菌AB045093的序列相似度高達(dá)99％。

根據(jù)菌株NUST16的形態(tài)學(xué)、生理生化測(cè)試以及分子生物學(xué)分析，該菌株NUST16鑒定為土壤類(lèi)芽孢桿菌，命名為土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16。

實(shí)施例2

土壤類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus edaphicus NUST16的培養(yǎng)及在生產(chǎn)水溶性胞外多糖中的應(yīng)用。

配制培養(yǎng)基，蔗糖5g，蛋白胨0.5g，NaH₂PO₄ 0.1g，CaCl₂ 0.01g，MgCl₂ 0.01g，KCl 0.01g，F(xiàn)eCl₂ 0.001g，CuSO₄ 0.001g，MnSO₄ 0.001g，ZnCl₂ 0.001g，CoCl₂ 0.001g溶于1L去離子水中，pH為6.0，加入1％營(yíng)養(yǎng)瓊脂121℃滅菌15min后冷卻得到固體培養(yǎng)基。在瓊脂固體培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)本菌株48h后可看到有菌落長(zhǎng)出，菌落呈圓形，半透明，表面有光澤，粘稠，不易挑起，菌株分泌大量的胞外多糖。刮取每只9cm平板上的菌落用30mL去離子水溶解，然后經(jīng)5000×g離心20min，上清中加入60mL乙醇-異丙醇混合液(體積比1:1)室溫沉淀，經(jīng)過(guò)濾收集沉淀并于40℃干燥后即得粗多糖。

圖2為胞外多糖組成的高效液相色譜圖，同一組分保留時(shí)間相同。其中圖2A為10種標(biāo)準(zhǔn)單糖及其衍生物經(jīng)PMP衍生化后在高效液相中的洗脫曲線；圖2B為土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16產(chǎn)胞外多糖經(jīng)三氟乙酸完全水解后的水解產(chǎn)物經(jīng)PMP衍生化在高效液相中的洗脫曲線，各洗脫峰之間不存在重疊。經(jīng)過(guò)比較可以發(fā)現(xiàn)，D-甘露糖(D-Man)、D-葡萄糖醛酸(D-GlcUA)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)和L-巖藻糖(L-Fuc)在A圖和B圖中保留時(shí)間完全一致。經(jīng)定量計(jì)算可得土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16產(chǎn)胞外多糖中D-葡萄糖、D-甘露糖、L-巖藻糖、D-半乳糖和D-葡萄糖醛酸摩爾比為3:3:2:1:1，另一種表述為：Glc:Man:Fuc:Gal:GlcUA＝3:3:2:1:1。該多糖為雜多糖。

實(shí)施例3

土壤類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus edaphicus NUST16的培養(yǎng)及在生產(chǎn)水溶性胞外多糖中的應(yīng)用。

配制培養(yǎng)基，蔗糖50g，蛋白胨5g，NaH₂PO₄ 5g，CaCl₂ 0.5g，MgCl₂ 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eCl₂ 0.05g，CuSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.05g，ZnCl₂ 0.05g，CoCl₂ 0.05g溶于1L去離子水中，pH為7.0，121℃滅菌20min后冷卻備用，加入1％營(yíng)養(yǎng)瓊脂121℃滅菌15min后冷卻得到相應(yīng)固體培養(yǎng)基。挑取瓊脂固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16單菌落至滅菌后的培養(yǎng)基中，25℃震蕩培養(yǎng)24h形成種子培養(yǎng)液，再將7％的種子培養(yǎng)液加入到此備用培養(yǎng)基中35℃震蕩培養(yǎng)48h，獲得發(fā)酵液。向發(fā)酵液加入3.5倍體積的95％乙醇-丙酮混合液(體積比1:1)，室溫振蕩，然后經(jīng)5000×g離心20min收集沉淀，50℃干燥后即得粗多糖10.08g。

實(shí)施例4

土壤類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus edaphicus NUST16的培養(yǎng)及水溶性胞外多糖的生產(chǎn)和純化。

配制培養(yǎng)基，蔗糖20g，蛋白胨3g，NaH₂PO₄ 3g，CaCl₂ 0.05g，MgCl₂ 0.15g，KCl 0.15g，F(xiàn)eCl₂ 0.03g，CuSO₄ 0.003g，MnSO₄ 0.05g，ZnCl₂ 0.005g，CoCl₂ 0.01g溶于1L去離子水中，pH為9.0，121℃滅菌20min后冷卻備用；挑取固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16單菌落至滅菌后的培養(yǎng)基中，35℃震蕩培養(yǎng)36h形成種子培養(yǎng)液，再將5％的種子培養(yǎng)液加入到滅菌后的培養(yǎng)基中32℃震蕩培養(yǎng)72h，獲得發(fā)酵液。向發(fā)酵液加入3倍體積的95％乙醇-100％甲醇-異丙醇混合液(體積比1:1:1)，沉淀并過(guò)濾，45℃干燥后即得粗多糖14.83g。將粗多糖10g重新溶于去離子水中至終濃度15g/L，然后加入1.1倍體積的氯仿-苯酚-正丁醇混合液(體積比1:0.85:0.15)振蕩然后靜置分層，收集水相重新加入上述混合液，重復(fù)操作5次，可以得到去蛋白的胞外多糖。所得的去蛋白多糖用30倍體積的去離子水經(jīng)截留分子量3000Da半透膜透析48h，然后向透析后的多糖中加入4倍體積95％乙醇-丙酮混合液(體積比1:1)，經(jīng)沉淀并過(guò)濾后，50℃干燥可得純化的胞外多糖6.47g。

實(shí)施例5

土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16產(chǎn)生的胞外多糖在調(diào)節(jié)水溶液流變性質(zhì)中的應(yīng)用。

按實(shí)施例4制備純化的胞外多糖，然后室溫下，用去離子水溶解該多糖至終濃度為6.5g/L，經(jīng)測(cè)定溶液粘度為3755mPa.s，記為初始粘度。依次配制濃度分別為20g/L KCl、40g/L NaCl、80g/L MgCl₂和100g/L CaCl₂溶液，室溫條件下用4種溶液分別溶解胞外多糖至終濃度6.5g/L并測(cè)定粘度，粘度依次為3525mPa.s，3645mPa.s，3042mPa.s和3160mPa.s，粘度均超過(guò)初始粘度的80％。此外，配制混合無(wú)機(jī)鹽溶液，其中KCl、NaCl、MgCl₂和CaCl₂濃度均為25g/L，室溫下溶解胞外多糖至終濃度6.5g/L，測(cè)定粘度值為3055mPa.s，為初始濃度的81.4％。

圖3為室溫條件下向溶液中分別添加不同濃度的NaCl、KCl、CaCl₂和MgCl₂時(shí)胞外多糖溶液粘度變化情況?？梢钥闯?，當(dāng)鹽濃度高達(dá)100g/L時(shí)多糖溶液粘度仍然能夠保持初始粘度的80％以上，并且Ca²⁺和Mg²⁺不會(huì)使溶液形成凝膠，這對(duì)高鹽條件下的單元操作有極大幫助。可知，土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16產(chǎn)生的胞外多糖在調(diào)節(jié)水溶液流變性質(zhì)上具有較好作用，特別是當(dāng)溶液中含有高濃度鹽離子時(shí)，仍能夠顯著增加溶液粘度并保持穩(wěn)定。

實(shí)施例6

土壤類(lèi)芽孢桿菌NUST16產(chǎn)生的胞外多糖在調(diào)節(jié)水溶液流變性質(zhì)中的應(yīng)用。

按實(shí)施例4制備純化的固體胞外多糖，室溫下用去離子水溶解胞外多糖至終濃度5g/L，并測(cè)定粘度為2760mPa.s，并記為初始粘度。取500mL多糖溶液置于沸水浴中10min，然后迅速取出并冷卻至室溫(25℃)，冷卻后多糖溶液具有流動(dòng)性，未形成凝膠，經(jīng)測(cè)量粘度為19640mPa.s，為初始粘度的7.08倍。將該溶液重新置于沸水浴中10min溶液粘度下降，然后冷卻至室溫測(cè)定粘度為20100mPa.s，繼續(xù)重復(fù)3次，所觀察到的現(xiàn)象一致，粘度依次為19950mPa.s，19970mPa.s和20550mPa.s。經(jīng)5次加熱-冷卻循環(huán)操作，多糖溶液粘度保持穩(wěn)定，溶液澄清透明，無(wú)顏色變化，并且始終未形成熱不可逆凝膠。

圖4為1g/L的胞外多糖溶液經(jīng)95℃熱處理10min后冷卻至室溫的粘度變化情況?？梢钥闯?，經(jīng)簡(jiǎn)單的熱處理后，溶液粘度由235mPa.s提高至850mPa.s,粘度為處理前的3.62倍。經(jīng)過(guò)5次重復(fù)操作后，粘度保持穩(wěn)定。圖5為5g/L的胞外多糖溶液經(jīng)100℃熱處理10min后冷卻至室溫的粘度變化情況。可以看出，經(jīng)簡(jiǎn)單的熱處理后，溶液粘度由2760mPa.s提高至19640mPa.s，粘度為處理前的7.08倍。經(jīng)過(guò)5次重復(fù)操作后，粘度仍然保持穩(wěn)定。這一特性可極大地降低多糖使用量，或者降低前處理時(shí)的單元操作難度?？芍寥李?lèi)芽孢桿菌NUST16產(chǎn)生的胞外多糖加入到溶液中，通過(guò)簡(jiǎn)單的加熱-冷卻操作能進(jìn)一步成倍的提高溶液粘度，并且經(jīng)過(guò)多次重復(fù)粘度保持穩(wěn)定，不會(huì)形成熱不可逆凝膠，說(shuō)明該胞外多糖性質(zhì)穩(wěn)定，具有較為廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京理工大學(xué)

<120> 一種土壤類(lèi)芽孢桿菌及其應(yīng)用

<130> 666

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1241

<212> DNA

<213> Paenibacillus edaphicus

<400> 1

gggtgagtaa cacgtaggca acctgcctga aggatcggga taactaccgg aaacggtagc 60

taagaccgga tagctggctc tggtgcatgc cggagtcatg aaacacggag caatctgtgg 120

cctttggatg ggcctgcggt gcattagcta gttggtgggg taacggctca ccaaggcgac 180

gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 240

cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg caagtctgac ggagcaacgc 300

cgcgtgagtg atgaaggttc tcggatcgta aagctctgtt gccagggaag aacgtcgtgg 360

ggagtaactg ccctgcgaat gacggtacct gagaagaaag ccccggctaa ctacgtgcca 420

gcagccgcgg taatacgtag ggggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc 480

gcaggcggtt cattaagttt ggtgtttaag cccggggctc aaccccggtt cgcactgaaa 540

actggtgaac ttgagtgcag gagaggaaag cggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt 600

agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cggctttctg gactgtaact gacgctgagg 660

cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 720

agtgctaggt gttaggggtt tcgataccct tggtgccgaa gtaaacacaa taagcactcc 780

gcctggggag tacgctcgca agagtgaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc 840

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