本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程領(lǐng)域，具體涉及煙草腺毛分泌特性相關(guān)基因Nt-te分子標(biāo)記定位及獲得方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物表皮毛(trichomes)是廣泛存在于高等植物表面的一種特化器官，盡管形態(tài)各異，但通?？杀环殖上倜?glandulartrichomes)和非腺毛(non-glandulartrichomes)2大類。植物腺毛由基部細(xì)胞、柄部細(xì)胞和頂端細(xì)胞3個部分組成(Maffeietal,2010；McDowelletal,2011)，包括分泌型腺毛和非分泌型腺毛(Wagneretal,1991)。分泌型腺毛具有很強(qiáng)的合成、儲存或分泌大量次生代謝產(chǎn)物的能力，分泌物作為天然的殺蟲劑、食品添加劑在制藥工業(yè)中起著重要作用(McDowelletal,2011)。例如，唇形科植物薄荷、白花羅勒、薰衣草、百里香等腺毛分泌物富含多種芳香油，其中不少芳香油成分可供藥用(Schilmilleretal,2008)；青蒿的分泌型腺毛具有合成倍半萜烯內(nèi)酯等多種化合物的能力，是重要抗瘧疾藥物青蒿素合成和分泌的重要場所(Weathersetal,2011)；棉花腺毛分泌的棉子酚和其它相關(guān)化合物具有很強(qiáng)的抗真菌作用，而且是天然的殺蟲劑(Dayanetal,2003)；煙葉腺毛主要分泌物西柏三烯二醇對烤后煙葉的香氣有重要的作用(Johnsonetal.,1985)，并具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性、抑菌和調(diào)節(jié)植物生長等生物活性，對于尼古丁上癮也有一定的抑制作用(韓錦峰等，2013)。研究認(rèn)為腺毛不同分泌物合成場所不同。研究發(fā)現(xiàn)，高爾基體是多糖類物質(zhì)的合成場所(Amelunxenetal,1968；Danilovaetal,1987；Schnepfetal,1968)。親脂類物質(zhì)在分泌細(xì)胞內(nèi)合成的場所一直存在爭議。Werker等(1981)認(rèn)為旋復(fù)花屬(Inula)植物最初由頭部細(xì)胞分泌的脂類物質(zhì)是由管狀光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生的。Hammond等(1987)研究大麻腺毛的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，質(zhì)體數(shù)目隨著分泌過程而急劇增多，因此認(rèn)為質(zhì)體與脂類分泌物的合成有關(guān)。質(zhì)體是腺毛萜烯類分泌物合成的場所(Turneretal,2000；Gersbachetal,2002)。張華等(2008)證明了葉綠體的存在和煙草腺毛的分泌活性密切相關(guān)。Nielsen等(1991)年對煙草腺毛具有分泌能力的栽培品種TI1068和不具有分泌能力的突變體材料TI1406進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)分泌型腺毛具有完整的葉綠體和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，而非分泌型煙葉腺毛缺失葉綠體結(jié)構(gòu)，揭示了煙草腺毛葉綠體對分泌物質(zhì)合成是不可或缺的。目前已經(jīng)鑒出一些參與腺毛次生代謝物質(zhì)合成的功能基因。薄荷單萜薄荷烷合成基因GPPS和單加氧酶基因P450參與腺毛萜類物質(zhì)合成。青蒿的紫穗槐二烯合成酶ADS催化紫穗槐二烯生成青蒿酸。Bleeker等(2011)在番茄的腺毛中發(fā)現(xiàn)參與短萜類合成的順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶NDPS1和參與單萜α-水芹烯合成的萜類合成酶PHS1。啤酒花腺毛中異戊烯基轉(zhuǎn)移酶HlPT1L和HlPT2參與苦味酸合成(Xuetal,2013；Lietal,2015)。Schilmiller等(2012)在栽培番茄Ⅳ型腺毛的頂端細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一個酰基轉(zhuǎn)移酶SlAT2參與四?；崽堑暮铣?。擬南芥AtMYB103基因控制腺毛分枝的發(fā)生(Higginsonetal,2003)。棉花表皮腺毛中特異表達(dá)基因GaMYB2與棉纖維起始和發(fā)育密切相關(guān)(Shangguanetal,2008)。煙草中CYP71D16基因可調(diào)控?zé)熑~葉表面分泌代謝物的種類及數(shù)量(Wangetal,2002)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測煙草腺毛分泌表型的方法。本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測煙草腺毛分泌表型的方法是檢測煙草個體的基因型是AA基因型還是GG基因型，根據(jù)所述煙草個體的基因型確定所述煙草個體腺毛分泌表型：若所述煙草個體的基因型為GG基因型，則所述煙草為或候選為腺毛分泌型；若所述煙草個體的基因型為AA基因型，則所述煙草為或候選為腺毛非分泌型；所述GG基因型為DNA片段甲第331位脫氧核糖核苷酸為G的純合體；所述AA基因型為DNA片段甲第331位脫氧核糖核苷酸為A的純合體；所述DNA片段甲的核苷酸序列如序列3所示。上述方法中，所述檢測煙草個體的基因型是AA基因型還是GG基因型方法為如下A)或B)：A)直接測序；B)測序含有DNA片段甲第331位脫氧核糖核苷酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所用的引物為1)或2)：1)由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對A；2)由序列A所示的單鏈DNA分子和序列B所示的單鏈DNA分子組成的引物對B；所述序列A為將序列1刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列1具有相同功能的核苷酸；所述序列B為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸。本發(fā)明的第二個目的是提供檢測DNA片段甲第331位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)的新用途。本發(fā)明提供了檢測DNA片段甲第331位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)在如下1)-6)中任一種中的應(yīng)用：1)鑒定或輔助鑒定待測煙草腺毛分泌表型；2)制備鑒定或輔助鑒定待測煙草腺毛分泌表型的產(chǎn)品；3)鑒定或輔助鑒定待測煙草為腺毛分泌型還是腺毛非分泌型；4)制備鑒定或輔助鑒定待測煙草為腺毛分泌型還是腺毛非分泌型的產(chǎn)品；5)選育腺毛分泌型煙草或腺毛非分泌型煙草；6)制備選育腺毛分泌型煙草或腺毛非分泌型煙草的產(chǎn)品；所述DNA片段甲的核苷酸序列如序列3所示。本發(fā)明的第三個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測煙草腺毛分泌表型的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測煙草腺毛分泌表型的產(chǎn)品為檢測DNA片段甲第331位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)；所述DNA片段甲的核苷酸序列如序列3所示。上述應(yīng)用或產(chǎn)品中，所述檢測DNA片段甲第331位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)為如下1)或2)或3)或4)：1)由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對A；2)由序列A所示的單鏈DNA分子和序列B所示的單鏈DNA分子組成的引物對B；所述序列A為將序列1刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列1具有相同功能的核苷酸；所述序列B為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸；3)含有1)所述引物對A或2)所述引物對B的PCR試劑；4)含有1)所述引物對A或2)所述引物對B或3)所述PCR試劑的試劑盒。上述應(yīng)用或產(chǎn)品中，3)中所述的引物對A或引物對B中的各條引物在所述PCR試劑中的終濃度均為10M。本發(fā)明的第四個目的是提供一種選育腺毛分泌型煙草的方法。本發(fā)明提供的選育腺毛分泌型煙草的方法包括選擇GG基因型的煙草進(jìn)行育種；所述GG基因型為DNA片段甲第331位脫氧核糖核苷酸為G的純合體；所述DNA片段甲的核苷酸序列如序列3所示。本發(fā)明的第五個目的是提供一種選育腺毛非分泌型煙草的方法。本發(fā)明提供的選育腺毛非分泌型煙草的方法包括選擇AA基因型的煙草進(jìn)行育種；所述AA基因型為DNA片段甲第331位脫氧核糖核苷酸為A的純合體；所述DNA片段甲的核苷酸序列如序列3所示。上述方法或上述應(yīng)用或上述產(chǎn)品中，所述腺毛分泌型煙草為腺毛具有分泌物的煙草；所述腺毛非分泌型煙草為腺毛不具有分泌物的煙草。本發(fā)明的有效效果如下：1、本發(fā)明首次在煙草第14號染色體上定位了一個煙草腺毛分泌特性相關(guān)基因Nt-te。該基因是利用煙草非分泌突變體TI1406獲得的。該基因?qū)θ媪私庵参锵倜置诘臋C(jī)理及促進(jìn)其在植物抗蟲、增香以及代謝產(chǎn)物新品種的培育中的利用價值都具有重要的指導(dǎo)意義。2、本發(fā)明采用分子標(biāo)記方法，確定一個煙草腺毛分泌特性相關(guān)基因定位，并開發(fā)了1個緊密連鎖的SNP標(biāo)記。3、本發(fā)明的與Nt-te基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，是在表型穩(wěn)定的雜交后代家系中獲得的新的標(biāo)記，可以用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。本發(fā)明利用腺毛分泌型烤煙K326與白肋煙突變體腺毛非分泌型TI1406構(gòu)建K326×TI1406F2雜交群體、F2:3家系和BC1F1回交群體，首次在煙草第14號染色體上發(fā)現(xiàn)和定位了一個與腺毛分泌特性相關(guān)的基因，并開發(fā)了與腺毛非分泌基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。通過遺傳分析表明，煙葉腺毛非分泌性受隱性單基因的調(diào)控，將該基因暫命名為Nt-te。用SNP標(biāo)記分析表明，Nt-te被定位在第14號染色體上，并且分子標(biāo)記SNP930887與該基因緊密連鎖。該分子標(biāo)記SNP930887不僅可用于鑒定或輔助鑒定待測煙草腺毛分泌表型，還可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種(MAS)，不僅為克隆該基因和序列分析以及對該基因進(jìn)行精細(xì)定位奠定了基礎(chǔ)，也為許多植物腺毛分泌產(chǎn)物、香氣品質(zhì)和抗蟲性優(yōu)異新品種的培育提供理論基礎(chǔ)。附圖說明圖1為突變體TI1406和K326煙葉腺毛分泌情況。圖1A為腺毛分泌型烤煙K326的腺毛分泌情況，圖1B為白肋煙腺毛非分泌型突變體TI1406的腺毛分泌情況。圖2為標(biāo)記SNP930887測序后的峰值圖譜。圖3為煙草腺毛分泌相關(guān)基因Nt-te定位圖譜。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。下述實施例中的親本材料腺毛分泌型烤煙K326與白肋煙腺毛非分泌型突變體TI1406均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所種質(zhì)資源庫提供，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所種質(zhì)資源庫(網(wǎng)址為http://www.ycsjk.com.cn/)獲得。實施例1、煙草腺毛分泌特性相關(guān)基因定位及其緊密連鎖的SNP標(biāo)記開發(fā)一、群體構(gòu)建利用腺毛分泌型烤煙K326與白肋煙腺毛非分泌型突變體TI1406，雜交獲得F1代種子，由雜交F1代自花授粉獲得F2代，通過單粒傳法獲得F2:3種子，F(xiàn)1與突變體TI1406回交獲得BC1F1群體。將親本TI1406和K326、F1、F2、F2:3和BC1F1群體煙草種子播種于育苗盤中。30天后，選取100株F1植株，705株F2單株，300株BC1F1群體單株。153個F2:3家系每個家系播種21株，50株突變體TI1406，50株K326幼苗假植到穴盤中，約60天后移栽至大田。利用153個F2:3家系進(jìn)行表型遺傳分析；選擇性的利用隱性純合單株(F2群體中的115株和BC1F1代114株)作為腺毛分泌基因定位群體，減少試驗誤差，加速定位進(jìn)程。二、腺毛表型遺傳分析在播種后，煙葉長至約15cm時，分別采取TI1406和親本K326、F1、F2和F2:3家系群體單株的新鮮葉片，并利用立體顯微鏡觀察腺毛是否具有分泌物，進(jìn)而判斷腺毛分泌表型。具體檢測步驟參照文獻(xiàn)“Nielsenetal,CropScience,1982,22(5):1051-1053”中的方法。結(jié)果表明，煙草品種K326腺毛頭表面包括大量的分泌物(圖1A)，而突變體TI1406表面褶皺，沒有或只有少量的分泌物(圖1B)。每個F2:3家系選取21株單株進(jìn)行觀察。21株煙葉腺毛全表現(xiàn)為分泌型，對應(yīng)F2單株為純合顯性基因型TeTe；21株煙葉腺毛全表現(xiàn)為非分泌型，對應(yīng)F2單株為純合隱性基因型tete；21株煙葉腺毛表現(xiàn)為分泌型和非分泌型，對應(yīng)F2單株為雜合顯性基因型Tete。雜交后代表型分離明顯，經(jīng)典遺傳學(xué)分析F2代分離群體的非分泌型和分泌型分離比接近1:3；由F2:3家系表型推測發(fā)現(xiàn)對應(yīng)F2代基因型(純合顯性基因:雜合顯性基因:純合隱性基因)分離比符合1:2:1，明確煙葉腺毛分泌性受隱性單基因的調(diào)控，將該基因暫命名為Nt-te(表1)。表1、親本和群體煙葉腺毛分泌特性遺傳分析親本或雜交后代分泌型單株數(shù)非分泌型單株數(shù)總株數(shù)P值突變體Te03030K32630030F2群體5351707050.59F2:3家系38(TeTe)81(Tete)34(tete)1530.74三、腺毛分泌基因定位及分子標(biāo)記的開發(fā)1、基因DNA的提取和抗感池構(gòu)建采取親本TI1406和K326、115個F2群體中的隱性純合單株和114個BC1F1代隱性純合單株煙草葉片，采用CTAB方法提取DNA。將新鮮的葉片置于液氮中研磨成粉末狀，向離心管中加入800μL65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，混勻后于65℃水浴中保溫30-50min，不時搖動以免成團(tuán)；取出離心管，冷卻至室溫，加入800μL酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，抽提10min，期間每隔一段時間輕輕顛倒，使其充分混勻，12000rpm離心10min；取上清液到另一1.5mL離心管中，加入等體積氯仿:異戊醇(24:1)，充分混勻10min后，12000rpm離心10min；取上清液到另一1.5mL離心管中，加入0.8倍體積預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，于-20℃下放置30-60min，使DNA以沉淀析出；挑出DNA沉淀轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，用75％酒精洗滌2次，最后用無水乙醇脫水，吹干，加入適量滅菌的超純水，37℃溶解，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和紫外分光光度法檢測DNA樣品的濃度，將DNA濃度調(diào)整至25ng/μL。按照Michelmore(1991)等方法分別選取10個純合腺毛非分泌型單株、10個純合腺毛分泌型單株構(gòu)建用于分離群體分組分析(BulkSegregatingAnalysis，BSA)的分離池。2、基于BSA混合池進(jìn)行RAD測序定位提取兩種表型的樣品個體基因組DNA各50份混合，采用相應(yīng)酶酶切后并隨機(jī)打斷，電泳回收所需長度的DNA片段，并加上接頭進(jìn)行cluster制備，最后上機(jī)測序。測序總量超過80G，其中兩個親本各10G，混合池各30G。將過濾后得到的數(shù)據(jù)用BWA軟件與參考基因組序列進(jìn)行比對，使用Picart-tools對比對結(jié)果合并，使用SOAPsnp軟件檢測SNP(表2)。表2、SNP檢測和注釋結(jié)果統(tǒng)計以野生型親本K326為參考基因型，分別對野生型子代和突變型子代進(jìn)行基因型頻率分析；將每一個位點支持突變型的reads深度除以該位點總的reads深度，獲得所有位點突變型基因型的頻率index。對兩個混合池中位點突變型基因型的頻率index在染色體上的分布作圖，發(fā)現(xiàn)14號染色體的后半段部分整體偏高，推測該區(qū)段應(yīng)該和突變表型緊密連鎖。針對該區(qū)段的SNP位點，利用軟件Premier5.0(PremierBiosoftInternational,PaloAlto,CA)設(shè)計了30對SNP引物。3、SNP930887分子標(biāo)記的開發(fā)利用BSA混合池RAD測序開發(fā)的30對SNP引物對表型為非分泌型115個F2單株和114個BC1F1單株進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μl，含有2×DreamTaqTMGreenDNAPolymerase10μl，10M上下游引物分別為1μl，25ng/μLDNA3μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序，95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，53-58℃退火45s，72℃延伸45s-55s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。SNP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測后進(jìn)行測序分析。產(chǎn)物測序后比對分析結(jié)果如圖3所示。發(fā)現(xiàn)SNP930887與目標(biāo)基因Nt-Te緊密連鎖，并將目的基因Nt-Te鎖定在14號染色體約5.4Mb區(qū)段內(nèi)。SNP930887的引物序列：SNP930887F：5'-TCTAAACGACAGCGGTAAT-3'(序列1)和SNP930887R5'-TGGATACGAACCTGGAAA-3'(序列2)。用Mapmanger4.0軟件分析標(biāo)記與基因的遺傳距離分別為2.6cM。四、分子標(biāo)記SNP930887的驗證分別以親本腺毛分泌型烤煙K326、白肋煙腺毛非分泌型突變體TI1406、F2:3家系表型鑒定為腺毛分泌型(基因型為純合顯性)的單株及表型鑒定為腺毛非分泌型(基因型為純合隱性)的單株的基因組DNA為模板，采用分子標(biāo)記SNP930887進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。PCR反應(yīng)體系為20μl，含有2×DreamTaqTMGreenDNAPolymerase10μl，10M上下游引物分別為1μl，25ng/μLDNA3μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序，95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，53-58℃退火45s，72℃延伸45s-55s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。測序結(jié)果表明：表型鑒定為腺毛分泌型的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和表型鑒定為腺毛非分泌型的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小均為485bp，其中，表型鑒定為腺毛分泌型的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的第331位脫氧核糖核苷酸均為G(表型鑒定為腺毛分泌型的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列3)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的第331位脫氧核糖核苷酸均為G的基因型命名為GG基因型；而表型鑒定為腺毛非分泌型的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的第331位脫氧核糖核苷酸均為A(表型鑒定為腺毛非分泌型的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列4)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的第331位脫氧核糖核苷酸均為A的基因型命名為AA基因型。因此可以根據(jù)如下方法判斷待測煙草為腺毛分泌型還是腺毛非分泌型：用分子標(biāo)記SNP930887對待測煙草進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確定煙草個體的基因型是AA基因型還是GG基因型：若煙草個體的基因型為GG基因型，則煙草為或候選為腺毛分泌型；若煙草個體的基因型為AA基因型，則煙草為或候選為腺毛非分泌型；所述GG基因型為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物第331位脫氧核糖核苷酸為G的純合體；所述AA基因型為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物第331位脫氧核糖核苷酸為A的純合體。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所<120>煙草腺毛分泌特性相關(guān)基因Nt-te分子標(biāo)記定位及獲得方法與應(yīng)用<160>4<210>1<211>19bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1tctaaacgacagcggtaat19<210>2<211>18bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2tggatacgaacctggaaa18<210>3<211>485bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3tctaaacgacagcggtaataaaatcatgtaataaaaaacgtatttagtaaaattaagata60attaagccaaaaaaataaaaaaacagttaagcgaccgtgctagaaccacgaaattcggaa120atgcctaacaccttcttctgaattaacagaattccttactcaggatttctggttcgcaga180ataacaaacagagtcatattctcctcgattcagggattaaaacctgtgacttgggacgcc240ttaaaattcccaggtggcgactctgaaacaaataaacaagtcccgtttcgactgtccttc300aattggagaaaactccctacgcgccccgcgggtgcggaaaaaggaggtgcgacagagacc360agtgattgaactcctcccaagtgcactcataccccaaaccaaatgtagtaccatgtttct420tcagcttgatgggtttggcaattccctggaggtttttgccgagtccctttccaggttcgt480atcca485<210>4<211>485bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4tctaaacgacagcggtaataaaatcatgtaataaaaaacgtatttagtaaaattaagata60attaagccaaaaaaataaaaaaacagttaagcgaccgtgctagaaccacgaaattcggaa120atgcctaacaccttcttctgaattaacagaattccttactcaggatttctggttcgcaga180ataacaaacagagtcatattctcctcgattcagggattaaaacctgtgacttgggacgcc240ttaaaattcccaggtggcgactctgaaacaaataaacaagtcccgtttcgactgtccttc300aattggagaaaactccctacgcgccccgcgagtgcggaaaaaggaggtgcgacagagacc360agtgattgaactcctcccaagtgcactcataccccaaaccaaatgtagtaccatgtttct420tcagcttgatgggtttggcaattccctggaggtttttgccgagtccctttccaggttcgt480atcca485當(dāng)前第1頁1 2 3