本發(fā)明屬于造紙廢棄物領(lǐng)用領(lǐng)域,特別涉及以造紙污泥為原料制備纖維素酶。

背景技術(shù)：

造紙污泥即造紙生產(chǎn)過程中（包括蒸煮、洗選、打漿、漂白、抄紙）各個工段產(chǎn)生的污水中所沉淀下的含有泥沙、造紙?zhí)盍稀⒓毿±w維等（無機的、有機的）復(fù)雜物資的綜合性污泥。造紙污泥具有量大、氣味惡臭、隨污水流動的特點，且成分復(fù)雜，含水量高，處理難度大，一直都是造紙污水處理中令環(huán)保人士最為無奈、最為頭疼的事情。長期以來，絕大部分造紙污泥隨意外運、簡單填埋、被棄置填坑或焚燒等，不但占用大量土地，還造成嚴(yán)重的二次污染以及新的環(huán)境問題，給生態(tài)環(huán)境帶來了隱患。對造紙污泥的處理只有投資沒有效益，嚴(yán)重制約了很多企業(yè)的發(fā)展。

本發(fā)明根據(jù)造紙污泥獨有的特性，開發(fā)一種造紙污泥資源化利用的新技術(shù)，對該領(lǐng)域具有重要意義；同時以造紙污泥作為底物生產(chǎn)纖維素酶，降低纖維素酶的生產(chǎn)成本，可以解決纖維素酶由于生產(chǎn)成本高限制其應(yīng)用的局限性問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是以造紙污泥為原料制備纖維素酶，解決造紙污泥處理難的問題，同時降低纖維素酶的生產(chǎn)成本。

技術(shù)方案：一種以造紙污泥為原料制備纖維素酶的方法，包括以下步驟：

（1）造紙污泥的預(yù)處理

用清水將造紙污泥配置成質(zhì)量濃度在5%～10%的泥水；利用離心機，在2000～3000 轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，將泥水分離10～20分鐘后，除去上層清液和沉淀物底層的三分之一，得到沉淀物上層的三分之二混合物，常溫擠壓脫水，得到含水量為40%～60%的粗污泥；

（2）碳源底物的制備

利用質(zhì)量濃度為15%～25%的磷酸溶液，在55～70℃溫度下，與粗污泥攪拌反應(yīng)1～2小時，反應(yīng)過程物料配比為磷酸溶液20～40份、粗污泥20～40份，反應(yīng)完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%～60%的一段污泥；

利用質(zhì)量濃度為1.0%～1.5%的硫酸溶液，在微沸的條件下消煮一段污泥30～60分鐘，反應(yīng)過程物料配比為硫酸溶液60～90份、一段污泥10～30份，反應(yīng)完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%～60%的二段污泥；

利用質(zhì)量濃度為1.0%～1.5%的氫氧化鈉溶液，在微沸的條件下消煮二段污泥30～60分鐘，反應(yīng)過程物料配比為磷酸溶液60～90份、二段污泥10～30份，反應(yīng)完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%～60%的三段污泥；

在抽濾的條件下，利用質(zhì)量濃度為5%～10%的乙醇溶液清洗三段污泥，清洗過程物料配比為乙醇溶液60～90份、三段污泥5～10份，然后用清水清洗至pH值6.0～7.0范圍，清洗后烘干，得到碳源底物；

（3）纖維素酶的培養(yǎng)

菌種的活化：將里氏木霉菌種轉(zhuǎn)移至斜面培養(yǎng)基，置入生化培養(yǎng)箱中，在26℃環(huán)境下培養(yǎng)7天，得到活化菌種；

其中斜面培養(yǎng)基為綜合馬鈴薯培養(yǎng)基

種子液的培養(yǎng)：用接種環(huán)將活化菌種轉(zhuǎn)入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml種子瓶中，置于水浴恒溫搖床上，在30℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的環(huán)境下培養(yǎng)2天，得到種子液；

其中種子培養(yǎng)基為葡萄糖40g/L，示蛋白胨1g/L，硫酸銨2.2g/L，尿素0.5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.3g/L，氯化鈣0.3g/L，Mandels 微量元素1ml，并用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為5.0的混合溶液

產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配置與滅菌：將碳源底物與氮源和無機營養(yǎng)物按比例配置成產(chǎn)酶培養(yǎng)基，配置過程碳源底物濃度為40～60 g/L，并用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為5.0后，置于121℃的高溫滅菌鍋中滅菌30min；

其中氮源為示蛋白胨1g/L、硫酸銨2.2g/L和尿素0.5g/L的混合物

其中無機營養(yǎng)物為磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.3g/L、Mandels 微量元素1ml和T-80 1mL的混合物

纖維素酶的培養(yǎng)：將種子液接種到裝有50ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250ml三角瓶內(nèi)，置于搖床上，在溫度28～40℃下，通氣培養(yǎng)6～7天，得到發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)抽濾除去菌體及雜質(zhì)，即為纖維素酶。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚,下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細描述。

具體實施方式一：

步驟一：造紙污泥的預(yù)處理

用清水將造紙污泥配置成質(zhì)量濃度在5%的泥水；利用離心機，在3000 轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，將泥水分離20分鐘后，除去上層清液和沉淀物底層的三分之一，得到沉淀物上層的三分之二混合物，常溫擠壓脫水，得到含水量為40%的粗污泥；

步驟二：碳源底物的制備利用質(zhì)量濃度為15%的磷酸溶液，在55℃溫度下，與粗污泥攪拌反應(yīng)1小時，反應(yīng)過程物料配比為磷酸溶液20份、粗污泥20份，反應(yīng)完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%的一段污泥；

利用質(zhì)量濃度為1.0%的硫酸溶液，在微沸的條件下消煮一段污泥30分鐘，反應(yīng)過程物料配比為硫酸60溶液份、一段污泥10份，反應(yīng)完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%的二段污泥；

利用質(zhì)量濃度為1.0%的氫氧化鈉溶液，在微沸的條件下消煮二段污泥30分鐘，反應(yīng)過程物料配比為磷酸溶液60份、二段污泥10份，反應(yīng)完成后常溫擠壓脫水得到含水量40%的三段污泥；

在抽濾的條件下，利用質(zhì)量濃度為5%的乙醇溶液清洗三段污泥，清洗過程物料配比為乙醇溶液60份、三段污泥5份，然后用清水清洗至pH值6.0范圍，清洗后烘干，得到碳源底物；

步驟三：纖維素酶的培養(yǎng)

菌種的活化：將里氏木霉菌種轉(zhuǎn)移至斜面培養(yǎng)基，置入生化培養(yǎng)箱中，在26℃環(huán)境下培養(yǎng)7天，得到活化菌種；

其中斜面培養(yǎng)基為綜合馬鈴薯培養(yǎng)基種子液的培養(yǎng)：用接種環(huán)將活化菌種轉(zhuǎn)入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml種子瓶中，置于水浴恒溫搖床上，在30℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的環(huán)境下培養(yǎng)2天，得到種子液；

其中種子培養(yǎng)基為葡萄糖40g/L，示蛋白胨1g/L，硫酸銨2.2g/L，尿素0.5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.3g/L，氯化鈣0.3g/L，Mandels 微量元素1ml，并用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為5.0的混合溶液產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配置與滅菌：將碳源底物與氮源和無機營養(yǎng)物按比例配置成產(chǎn)酶培養(yǎng)基，配置過程碳源底物濃度為40g/L，并用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為5.0后，置于121℃的高溫滅菌鍋中滅菌30min；

其中氮源為示蛋白胨1g/L、硫酸銨2.2g/L和尿素0.5g/L的混合物其中無機營養(yǎng)物為磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.3g/L、Mandels 微量元素1ml和T-80 1mL的混合物纖維素酶的培養(yǎng)：將種子液接種到裝有50ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250ml三角瓶內(nèi)，置于搖床上，在溫度28℃下，通氣培養(yǎng)6天，得到發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)抽濾除去菌體及雜質(zhì)，即為纖維素酶。

具體實施方式二：具體實施方式二區(qū)別于實施方式一在于步驟一中造紙污泥質(zhì)量濃度為10%，離心轉(zhuǎn)速3000 轉(zhuǎn)/分，離心時間20分鐘。步驟二中一段污泥工藝段，磷酸溶液質(zhì)量濃度為25%，反應(yīng)過程物料配比為磷酸溶液40份、粗污泥40份，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為2小時；二段污泥工藝段，硫酸溶液質(zhì)量濃度為1.5%，反應(yīng)過程物料配比為硫酸溶液90份、一段污泥30份，反應(yīng)溫度為微沸，反應(yīng)時間為60分鐘；三段污泥工藝段，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度為1.5%，反應(yīng)過程物料配比為氫氧化鈉溶液90份、二段污泥30份，反應(yīng)溫度為微沸，反應(yīng)時間為60分鐘；清洗工藝段，乙醇溶液質(zhì)量濃度為10%，清洗過程物料配比為乙醇90份、三段污泥10份，然后用清水清洗至pH值7.0范圍。步驟三中產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配置時，碳源底物濃度為60 g/L；纖維素酶的培養(yǎng)在溫度40℃下，通氣培養(yǎng)7天。

具體實施方式三：具體實施方式三區(qū)別于實施方式一在于步驟一中造紙污泥質(zhì)量濃度為7.5%，離心轉(zhuǎn)速2500 轉(zhuǎn)/分，離心時間15分鐘。步驟二中一段污泥工藝段，磷酸溶液質(zhì)量濃度為20%，反應(yīng)過程物料配比為磷酸溶液30份、粗污泥30份，反應(yīng)溫度為62.5℃，反應(yīng)時間為1.5小時；二段污泥工藝段，硫酸溶液質(zhì)量濃度為1.25%，反應(yīng)過程物料配比為硫酸溶液75份、一段污泥20份，反應(yīng)溫度為微沸，反應(yīng)時間為45分鐘；三段污泥工藝段，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度為1.25%，反應(yīng)過程物料配比為氫氧化鈉溶液75份、二段污泥20份，反應(yīng)溫度為微沸，反應(yīng)時間為45分鐘；清洗工藝段，乙醇溶液質(zhì)量濃度為7.5%，清洗過程物料配比為乙醇60～90份、三段污泥7.5份，然后用清水清洗至pH值6.5范圍。步驟三中產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配置時，碳源底物濃度為50 g/L；纖維素酶的培養(yǎng)在溫度34℃下，通氣培養(yǎng)6.5天。

具體實施方式四：具體實施方式四區(qū)別于實施方式一在于步驟一中造紙污泥質(zhì)量濃度為6.25%，離心轉(zhuǎn)速3000 轉(zhuǎn)/分，離心時間12.5分鐘。步驟二中一段污泥工藝段，磷酸溶液質(zhì)量濃度為17.5%，反應(yīng)過程物料配比為磷酸溶液25份、粗污泥20份，反應(yīng)溫度為58℃，反應(yīng)時間為1.25小時；二段污泥工藝段，硫酸溶液質(zhì)量濃度為1.1%，反應(yīng)過程物料配比為硫酸溶液65份、一段污泥15份，反應(yīng)溫度為微沸，反應(yīng)時間為35分鐘；三段污泥工藝段，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度為1.1%，反應(yīng)過程物料配比為氫氧化鈉溶液65份、二段污泥15份，反應(yīng)溫度為微沸，反應(yīng)時間為35分鐘；清洗工藝段，乙醇溶液質(zhì)量濃度為6%，清洗過程物料配比為乙醇65份、三段污泥6份，然后用清水清洗至pH值7.0范圍。步驟三中產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配置時，碳源底物濃度為45 g/L；纖維素酶的培養(yǎng)在溫度30℃下，通氣培養(yǎng)7天。

具體實施方式五：具體實施方式五區(qū)別于實施方式一在于步驟一中造紙污泥質(zhì)量濃度為8.75%，離心轉(zhuǎn)速2500 轉(zhuǎn)/分，離心時間17.5分鐘。步驟二中一段污泥工藝段，磷酸溶液質(zhì)量濃度為22.5%，反應(yīng)過程物料配比為磷酸溶液35份、粗污泥30份，反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時間為1.75小時；二段污泥工藝段，硫酸溶液質(zhì)量濃度為1.4%，反應(yīng)過程物料配比為硫酸溶液85份、一段污泥25份，反應(yīng)溫度為微沸，反應(yīng)時間為55分鐘；三段污泥工藝段，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度為1.4%，反應(yīng)過程物料配比為氫氧化鈉溶液85份、二段污泥25份，反應(yīng)溫度為微沸，反應(yīng)時間為55分鐘；清洗工藝段，乙醇溶液質(zhì)量濃度為9%，清洗過程物料配比為乙醇85份、三段污泥9份，然后用清水清洗至pH值6.5范圍。步驟三中產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配置時，碳源底物濃度為55 g/L；纖維素酶的培養(yǎng)在溫度38℃下，通氣培養(yǎng)6.5天。