本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片檢測用試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
呼吸道感染是世界范圍內(nèi)最常見的疾病之一，發(fā)病率在各國居民發(fā)病率總體結(jié)構(gòu)中占據(jù)主要地位，每年的流行高峰期約有10％的居民患有呼吸道感染。呼吸道感染會導致鼻炎，流涕，鼻塞，咳嗽，輕度咽炎，全身發(fā)熱等癥狀，嚴重的會導致呼吸困難甚至死亡。據(jù)世界衛(wèi)生組織2002年統(tǒng)計報告，呼吸道感染居全球十大死亡原因中第三位，全球每年近四百萬人死于呼吸道感染。
基因芯片技術(shù)是近年來興起的生物高新技術(shù)，集成了探針固相原位合成技術(shù)、照相平板印刷技術(shù)、精密控制技術(shù)、激光共聚焦顯微技術(shù)和高分子合成技術(shù)。該技術(shù)的原型是80年代中期提出的，1991年Stephen Fodor博士首次將該技術(shù)定義為基因芯片，到1995年它在《Science》雜志刊登的一篇關(guān)于研究分析基因表達圖譜的文章中再次被提及，目前該技術(shù)在研究癌癥和檢測微生物方面得到廣泛的應(yīng)用。我們通常所提到的基因芯片(又稱DNA芯片、寡核苷酸芯片等)是指根據(jù)經(jīng)過特殊處理技術(shù)，將核酸分子(寡聚核苷酸、DNA、RNA等)固定于硅片、玻璃、尼龍膜等固相載體上，利用生物分子間特異相互作用的原理，將生化反應(yīng)及分析過程集成于芯片表面，從而實現(xiàn)對DNA、RNA的高通量快速檢測。其突出特點在于高度并行性、多樣性、微型化和高度自動化。
目前國內(nèi)已有許多檢測呼吸道病原體的試劑。主要是針對于病毒類的PCR熒光檢測試劑或者血清免疫檢測試劑，而對于細菌類病原體還是采取了比較傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)板培養(yǎng)的方法。熒光PCR雖然能夠得到較好的靈敏度和特異性，但是由于儀器采集信號通道的限制，每次反應(yīng)都只能檢測幾種病原體，通量較低，而采取多管檢測的時候又會極大增加檢測的經(jīng)濟成本和時間成本；而血清免疫檢測試劑雖然可以獲得較大的檢測通量，但是由于血清免疫檢測的是血清中的所產(chǎn)生的抗體，因此存在著一個較長的空窗期，并且靈敏度相對也較低；而對于細菌類病原體的檢測則是更加困難，細菌培養(yǎng)法雖然準確率高，但是周期長，培養(yǎng)效果差，很多細菌無法培養(yǎng)，延誤了最佳的治療時機。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片檢測用試劑盒及方法，以實現(xiàn)同時檢測16種呼吸道病原體的檢測需要。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一方面示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測試劑盒，所述試劑盒包括：PCR緩沖溶液、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、引物、探針以及Taq酶和金屬陽離子；
所述探針包括雜交探針和內(nèi)標探針；
所述引物包括16種呼吸道病原體引物和2種內(nèi)標引物和1種通用引物；
所述引物的序列為：SEQ ID NO:1-37；所述探針的序列為SEQ ID NO:38-55。
進一步，每條所述雜交探針的5’末端都經(jīng)過氨基與多聚polyT修飾。
進一步，每條所述雜交探針的5’端oligodT的C6位置進行氨基化修飾。
本發(fā)明第二方面示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測方法，包括：
篩選出16種呼吸道病原體的保守區(qū)域，分別得到16對引物，在所述16種呼吸道病原體的保守區(qū)域設(shè)計出16條雜交探針；
選取方形尼龍膜，使用10％EDC活化1h，將所述16條雜交探針、1種DNA內(nèi)標探針、1種RNA內(nèi)標探針點在尼龍膜上，探針排列為3×6矩陣，點與點之間的間距為100μm，得到雜交盒；
配置檢測試劑盒，設(shè)置PCR反應(yīng)擴增的程序，進行擴增反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物；
向所述擴增產(chǎn)物中加入0.2mol的NaOH50uL，得到變性后的擴增產(chǎn)物；
在雜交盒每孔內(nèi)加入500uL預(yù)雜交液，15min后取出在雜交盒中預(yù)雜交液，在雜交盒每孔內(nèi)加入雜交液400uL，同時相應(yīng)的加入所述變性后的擴增產(chǎn)物100uL，將雜交盒放入55℃烘箱中，30min后取出移出孔內(nèi)的雜交液；在雜交盒每孔內(nèi)加入500ul雜交洗液1清洗3min，移出雜交洗液1；在雜交盒每孔內(nèi)加入300ul酶標溶液，置于37℃烘箱中，30min后移出酶標溶液；在雜交盒每孔內(nèi)加入500uL雜交洗液1，震蕩清洗3min，用500uL雜交洗液2，震蕩清洗3min；在雜交盒每孔內(nèi)加入400ul顯色液，室溫顯色1-2min，移出顯色液，用雜交洗液2清洗每孔，用Bio-rad顯影，得到雜交顯色結(jié)果；
將所述雜交顯色結(jié)果與標準卡進行對比，得出檢測結(jié)果；
所述雜交洗液1為2x SSC與0.1％十二烷基硫酸鈉溶液的混合溶液；所述雜交洗液2為0.5x SSC與0.1％十二烷基硫酸鈉溶液的混合液溶液。
進一步，所述PCR反應(yīng)擴增的程序為：
逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄的溫度為50℃。時間為30min；
cDNA預(yù)變性，預(yù)變性的溫度為90℃-105℃，時間為1-10min，
變性，變性的溫度為90℃-105℃，時間為10s-30s；
退火，退火的溫度為40℃-65℃，時間為10s-60s；
延伸，延伸溫度為40℃-80℃，時間為10s-5min。
進一步，所述PCR反應(yīng)擴增的程序為：
所述逆轉(zhuǎn)錄的溫度為50℃。時間為30min；
所述預(yù)變性的溫度為95℃，時間為2min，
所述變性的溫度為95℃，時間為15s；
所述退火的溫度為57℃，時間為20s；
延伸溫度為72℃，時間為45s。
進一步，在每條所述引物的5’端添加人工接頭序列。
進一步，所述酶標溶液為鏈霉親和素和酶標母液的混合液；按照鏈霉親和素酶標母液＝1:200的配制。
進一步，所述顯色液為2mg/ml TMB：顯色緩沖液：30％H2O2＝500:500:1。
進一步，所述預(yù)雜交液、所述雜交液、所述雜交洗液1，所述雜交洗液2和所述酶標溶液使用前在55℃烘箱中預(yù)熱30min。
由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明實施例示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片檢測用試劑盒及方法，所述試劑盒包括：包括：PCR緩沖溶液、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、引物、探針以及Taq酶和金屬陽離子；所述探針包括雜交探針和內(nèi)標探針；所述引物包括16種呼吸道病原體引物和2種內(nèi)標引物和1種通用引物；所述引物的序列為：SEQ IDNO:1-37；所述探針的序列為SEQ ID NO:38-55。本發(fā)明基于PCR技術(shù)，針對16種呼吸道病原體的保守區(qū)域設(shè)計引物(SEQ ID NO:1-37)對靶核酸序列進行擴增，并通過基因芯片雜交技術(shù)對擴增產(chǎn)物進行雜交和顯色，最后將基因芯片上雜交斑點顯色情況與標準卡進行對比，從而對檢測結(jié)果進行分析判斷，同時為了避免由于樣本提取或者試劑失效導致的假陰性結(jié)果，本發(fā)明設(shè)置了人源管家基因(在取樣過程中會取到人源上皮細胞)作為內(nèi)標質(zhì)控，對靶核酸的提取和擴增進行監(jiān)控，從而保證檢測結(jié)果的精確性。
附圖說明
為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為根據(jù)一優(yōu)選實施例示出的一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測方法。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測試劑盒，包括：PCR緩沖溶液、DNA聚合酶、dNTPs、引物、探針以及催化DNA聚合酶所需要的金屬陽離子；所述探針包括雜交探針和內(nèi)標探針；
所述引物包括16種呼吸道病原體引物和2種內(nèi)標引物和1種通用引物；
所述引物的序列為：SEQ ID NO:1-37；
所述探針的序列為SEQ ID NO:38-55。
進一步，每條所述雜交探針的5’末端都經(jīng)過氨基與多聚polyT修飾。
進一步，每條所述雜交探針的5’端oligodT的C6位置進行氨基化修飾。
本發(fā)明的基因芯片上具有與所檢測的16中呼吸道病原體DNA/RNA互補的核苷酸序列的探針(SEQ ID NO:38-55)。為了增強雜交探針與基質(zhì)的結(jié)合度，有利于后續(xù)與擴增產(chǎn)物的雜交反應(yīng)的進行，每條雜交探針都經(jīng)過5’末端氨基與多聚polyT修飾。本發(fā)明針對16中病原體和2種內(nèi)標18種雜交探針，每條雜交探針都有著合適的堿基成分，Tm值相對比較均一，即18種型別的雜交探針和對應(yīng)的PCR產(chǎn)物雜交時的最適雜交條件基本一致，不會因為不同雜交探針所匹配的最適雜交溫度不同從而影響雜交結(jié)果，保證了檢測的準確性。而在擴增方面，我們在每一對擴增引物的5’末端都加入了一段人工合成的接頭序列，該序列與現(xiàn)有基因庫中基因組無特異性結(jié)合，并在接頭序列的5’末端進行生物素標記。先通過帶接頭序列的特異性引物將靶標基因進行擴增富集，再通過接頭序列對富集的模板進行擴增。從而導致了在反應(yīng)的最后擴增階段反應(yīng)體系中只有一對擴增引物，避免了不同引物對之間由于擴增效率不同而導致出現(xiàn)假陰性的情況，實現(xiàn)了所有靶標的同步擴增。
本發(fā)明實施例第二方面示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測方法，如圖1所示所述方法包括：
S101篩選出16種呼吸道病原體的保守區(qū)域，分別得到16對引物，在所述16種呼吸道病原體的保守區(qū)域設(shè)計出16條雜交探針；
S102選取方形尼龍膜，使用10％EDC活化1h，將所述16條雜交探針、1種DNA內(nèi)標探針、1中RNA內(nèi)標探針點在尼龍膜上，探針排列為3×6矩陣，點與點之間的間距為100μm，得到雜交盒；
S103配置檢測試劑盒，設(shè)置PCR反應(yīng)擴增的程序，進行擴增反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物；
S104向所述擴增產(chǎn)物中加入0.2mol的NaOH50uL，得到變性后的擴增產(chǎn)物；
S105在雜交盒每孔內(nèi)加入500uL預(yù)雜交液，15min后取出在雜交盒中預(yù)雜交液，在雜交盒每孔內(nèi)加入雜交液400uL，同時相應(yīng)的加入所述變性后的擴增產(chǎn)物100uL，將雜交盒放入55℃烘箱中，30min后取出移出孔內(nèi)的雜交液；在雜交盒每孔內(nèi)加入500ul雜交洗液1清洗3min，移出雜交洗液1；在雜交盒每孔內(nèi)加入300ul酶標溶液，置于37℃烘箱中，30min后移出酶標溶液；在雜交盒每孔內(nèi)加入500uL雜交洗液1，震蕩清洗3min，用500uL雜交洗液2，震蕩清洗3min；在雜交盒每孔內(nèi)加入400ul顯色液，室溫顯色1-2min，移出顯色液，用雜交洗液2清洗每孔，用Bio-rad顯影，得到雜交顯色結(jié)果；
S106將所述雜交顯色結(jié)果與標準卡進行對比，得出檢測結(jié)果；
所述雜交洗液1為2x SSC與0.1％十二烷基硫酸鈉溶液的混合溶液；所述雜交洗液2為0.5x SSC與0.1％十二烷基硫酸鈉溶液的混合液溶液。
進一步，在每條所述引物的5’端添加人工接頭序列。
進一步，所述酶標溶液為鏈霉親和素和酶標母液的混合液；按照鏈霉親和素酶標母液＝1:200的配制。
進一步，所述顯色液為2mg/ml TMB：顯色緩沖液：30％H2O2＝500:500:1。
進一步，所述預(yù)雜交液、所述雜交液、所述雜交洗液1，所述雜交洗液2和所述酶標溶液使用前在55℃烘箱中預(yù)熱30min。
具體的，本發(fā)明的優(yōu)選方案配置檢測試劑盒為：
本發(fā)明的檢測方法采取RT-PCR與基因芯片相結(jié)合的方式，因此首先需要完成PCR反應(yīng)擴增的過程。一般的RT-PCR反應(yīng)過程為：
1)逆轉(zhuǎn)錄；2)cDNA預(yù)變性，時間和長度取決于靶核苷酸長度及堿基組成，預(yù)變性的溫度一般為90℃-105℃，時間一般為1-10min，預(yù)變性的目的為使雙鏈核苷酸序列徹底分離為單鏈；3)變性，溫度一般為90℃-105℃，時間一般為10s-30s；4)退火，使各引物退火至呼吸道病原體或內(nèi)標質(zhì)控核酸的靶序列上。退火的溫度通常為40℃-65℃，退火的時間可以是10s-60s；5)延伸，引物與模板結(jié)合，開始合成新的雙鏈DNA，延伸溫度一般為40℃-80℃，延伸時間可以是10s-5min。本發(fā)明由于涉及到人工接頭引物的引入和擴增，根據(jù)需要對擴增步驟進行了略微的修改。本發(fā)明的優(yōu)選方案為：
本發(fā)明的關(guān)鍵內(nèi)容為靶核苷酸以及內(nèi)標的特異性擴增引物和接頭引物，以及后來的雜交探針。
本發(fā)明中的核苷酸序列為：
本發(fā)明中的保護點為本發(fā)明中提供的核苷酸序列或部分序列(引物、探針及內(nèi)標)及與其相似的序列或反向互補的序列，以及PCR反應(yīng)體系組分及濃度參數(shù)、PCR擴增程序、芯片雜交反應(yīng)體系組成成分、濃度參數(shù)以及雜交反應(yīng)條件。
結(jié)果分析：
證明該發(fā)明方法的可行性，進行了方法學研究：
⑴最低檢測限(LOD)試驗；
通過對各濃度梯度的樣本進行檢測，表明本檢測方法的檢測靈敏度(LOD)為1000copies/mL。
(2)特異性實驗與其它疾病的交叉反應(yīng)情況；
通過用本發(fā)明中的檢測方法對16種呼吸道病原體以外的其它病原體進行檢測，結(jié)果表明本發(fā)明中的方法對EB病毒、HPV病毒、STD等病原體感染樣本無交叉反應(yīng)，表明其具有高特意性。
(3)對潛在內(nèi)源物質(zhì)的抗干擾性；
試驗表明，當檢驗人中含有以下濃度的藥物，不會影響到試劑盒對樣本檢測結(jié)果的判定：0.2mg/L倍氯米松、0.15mg/L地塞米松、12mg/L曲安西龍、0.4mg/L布地奈德、0.05mg/L莫美達松、0.5mg/L氟替卡松、75mg/L苯佐卡因、5mg/L扎那米韋、37.5mg/L奧司他韋、75mg/L妥布霉素、50mg/L金剛烷胺、75mg/L硫磺、150mg/L金英、50mg/L鹽酸金剛乙胺、0.125mg/L腎上腺素、25mg/L薄荷腦、0.05％羥甲唑啉、500mg/L氟尼縮松、500mg/L莫匹羅星。
(4)對潛在外源物質(zhì)的抗干擾性
試驗表明，常見干擾物質(zhì)，如血液、唾液、鼻分泌物在分別在10％時，不會對試劑盒檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。但考慮上述干擾物質(zhì)中的RNA酶的影響，仍提醒采樣時應(yīng)盡量避免上述物質(zhì)的干擾。
由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明實施例示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片檢測用試劑盒及方法，所述試劑盒包括：包括：PCR緩沖溶液、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、引物、探針以及Taq酶和金屬陽離子；所述探針包括雜交探針和內(nèi)標探針；所述引物包括16種呼吸道病原體引物和2種內(nèi)標引物和1種通用引物；所述引物的序列為：SEQ IDNO:1-37；所述探針的序列為SEQ ID NO:38-55。本發(fā)明基于PCR技術(shù)，針對16種呼吸道病原體的保守區(qū)域設(shè)計引物(SEQ ID NO:1-37)對靶核酸序列進行擴增，并通過基因芯片雜交技術(shù)對擴增產(chǎn)物進行雜交和顯色，最后將基因芯片上雜交斑點顯色情況與標準卡進行對比，從而對檢測結(jié)果進行分析判斷。同時為了避免由于樣本提取或者試劑失效導致的假陰性結(jié)果，本發(fā)明設(shè)置了人源管家基因(在取樣過程中會取到人源上皮細胞)作為內(nèi)標質(zhì)控，對靶核酸的提取和擴增進行監(jiān)控，從而保證檢測結(jié)果的精確性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮說明書及實踐這里公開的發(fā)明后，將容易想到本發(fā)明的其它實施方案。本申請旨在涵蓋本發(fā)明的任何變型、用途或者適應(yīng)性變化，這些變型、用途或者適應(yīng)性變化遵循本發(fā)明的一般性原理并包括本發(fā)明未公開的本技術(shù)領(lǐng)域中的公知常識或慣用技術(shù)手段。說明書和實施例僅被視為示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神由下面的權(quán)利要求指出。
應(yīng)當理解的是，本發(fā)明并不局限于上面已經(jīng)描述并在附圖中示出的精確結(jié)構(gòu)，并且可以在不脫離其范圍進行各種修改和改變。本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求來限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南圣湘生物科技有限公司
<120> 一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片及檢測用試劑盒
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<212> DNA
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 25
gtacgactca ctatagggac ctcttcgttg accgatgtac tctt 44
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 26
gtacgactca ctatagggag ctaccatttc tttctcccag ct 42
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> HaemoPhilus influenza
<400> 27
gtacgactca ctatagggag gcattagccg tgagcagttt 40
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> HaemoPhilus influenza
<400> 28
gtacgactca ctatagggac ttcatggcac cttcttcgtt g 41
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> Moraxella Catarrhalis
<400> 29
gtacgactca ctatagggaa actggaagcc ttatggcaac ga 42
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> Moraxella Catarrhalis
<400> 30
gtacgactca ctatagggaa gttcacgcca acacggaaat ca 42
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> Streptococcus Pneumoniae
<400> 31
gtacgactca ctatagggat ggcggttact ctgtttctg 39
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> Streptococcus Pneumoniae
<400> 32
gtacgactca ctatagggag ttgacctaac gcgatgttgt 40
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gtacgactca ctatagggac aaatgtaaac actgtgcctg at 42
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gtacgactca ctatagggag taagtcaact tcaatgtcgg att 43
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gtacgactca ctatagggac tgggtttcat ccatccgaca tt 42
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gtacgactca ctatagggac acggcaggca tactcatctt tt 42
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 通用接頭
<400> 37
gtacgactca ctataggga 19
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> Influenza virus A
<400> 38
tttttttttt catcccttta gtcagaggtg acaggattgg 40
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> Influenza virus B
<400> 39
tttttttttt ataatcgagg tcatcataat cctctgctgt gt 42
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> Respiratory Syncytial Virus
<400> 40
tttttttttt ctaagcatat gactggagtt tttaagtgga att 43
<210> 41
<211> 41
<212> DNA
<213> Human adenovirus
<400> 41
tttttttttt ggtttgttta cagagaattg cgatacgtta c 41
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> Human Chlamydiales pneumoniae
<400> 42
tttttttttt gttcaggttg ctttcaagtt catcgtacag 40
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> Human Legionella pneumophila
<400> 43
tttttttttt ccatatgcaa gacctgaggg aacat 35
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> Human Mycoplasmal Pneumonia
<400> 44
tttttttttt ctgataaccc cttgttcctg cagcta 36
<210> 45
<211> 38
<212> DNA
<213> Human Rhinovirus
<400> 45
tttttttttt cagctagatc agtcgtagca taatcttc 38
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> Human Parainfluenza Virus 1
<400> 46
tttttttttt cacagccatc aacagtcgtt ggcat 35
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Human Parainfluenza Virus 2
<400> 47
tttttttttt tgacgccgcg gtgcggctg 29
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> Human Parainfluenza Virus 3
<400> 48
tttttttttt cgtcagaatg ggtgctattg atggc 35
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> Pertussis
<400> 49
tttttttttt ccaaagactt gttgaccttg cctgt 35
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 50
tttttttttt ctcccagctt aagaaccgtc agacaga 37
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> HaemoPhilus influenza
<400> 51
tttttttttt cttcgttgaa atagtaccac ttatcagcga 40
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> Moraxella Catarrhalis
<400> 52
tttttttttt aacacggaaa tcacgacctg cccca 35
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> Streptococcus Pneumoniae
<400> 53
tttttttttt cctaacgcga tgttgtattc tggtg 35
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tttttttttt tcaatgtcgg attgatgaaa cccag 35
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tttttttttt ggcatactca tctttttcag tgggg 35