本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及線粒體基因組9bp序列基因多態(tài)性在評價苯中毒風(fēng)險中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，苯及苯系物中毒病例報道逐年上升，苯中毒后致白血病死亡病例也逐年上升，危害非常嚴(yán)重。研究表明，苯中毒主要是中間活性代謝產(chǎn)物作用于線粒體通過氧化損傷引起的。慢性苯中毒的發(fā)生除了與苯的接觸濃度有關(guān)，還與接觸者的遺傳易感性有關(guān)。

線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單位II基因(簡稱MTCO2基因)和線粒體tRNA賴氨酸基因(簡稱MTTK基因)間的小片段非編碼序列含有2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列(核苷酸序列為：5′-CCCCCTCTACCCCCTCTA-3′)，其還存在插入/缺失多態(tài)性：3個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列即為插入型(核苷酸序列為：5′-CCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCTA-3′)，1個9bp序列即為缺失型(核苷酸序列為：5′-CCCCCTCTA-3′)。缺失型與多種遺傳疾病的發(fā)生有關(guān)，但未見與苯中毒的發(fā)生相關(guān)的報道。

血小板的主要細(xì)胞器之一是線粒體，線粒體是其唯一具有遺傳功能的細(xì)胞器，血小板線粒體相對白細(xì)胞線粒體DNA它不受人類染色體其它同源序列基因的干擾，提取血小板的基因組DNA可對線粒體基因組DNA進(jìn)行分析更有優(yōu)勢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何評價待測者從事苯暴露工作時發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險性的高低。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了用于檢測線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”還是“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的物質(zhì)在制備評價慢性苯中毒風(fēng)險性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了用于檢測線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”還是“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的物質(zhì)在評價慢性苯中毒風(fēng)險性中的應(yīng)用。

如果線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”，待測者慢性苯中毒風(fēng)險性較低。如果線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”，待測者慢性苯中毒風(fēng)險性較高。線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”的待測者慢性苯中毒風(fēng)險性低于線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的待測者。

上述應(yīng)用中，所述“用于檢測線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”還是“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的物質(zhì)”可為特異引物對，所述特異引物對由引物F和引物R組成；

所述引物F可為如下a1)或a2)：

a1)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

a2)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物R可為如下a3)或a4)：

a3)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

a4)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點突變的方法，對本發(fā)明提供的引物F和引物R的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明設(shè)計的引物F和引物R的核苷酸序列具有85％或者更高同一性的核苷酸，且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種評價慢性苯中毒風(fēng)險性的產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的評價慢性苯中毒風(fēng)險性的產(chǎn)品，可包括用于檢測線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”還是“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的物質(zhì)。

上述產(chǎn)品中，所述“包括用于檢測線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”還是“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的物質(zhì)”可為所述特異引物對。

所述產(chǎn)品還可包括記載有判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體。

所述判斷標(biāo)準(zhǔn)為判斷標(biāo)準(zhǔn)甲或判斷標(biāo)準(zhǔn)乙。

判斷標(biāo)準(zhǔn)甲：如果線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”，待測者慢性苯中毒風(fēng)險性較低；如果線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”，待測者慢性苯中毒風(fēng)險性較高。

判斷標(biāo)準(zhǔn)乙：線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”的待測者慢性苯中毒風(fēng)險性低于線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的待測者。

上述任一所述的產(chǎn)品的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上述任一所述的產(chǎn)品的制備方法可包括將上述任一所述特異引物對中的各引物分別單獨包裝的步驟。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了評價待測者發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險性的方法。

本發(fā)明所提供的評價待測者發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險性的方法為方法一，具體可包括如下步驟：檢測待測者線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”還是“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”；如果線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”，待測者慢性苯中毒風(fēng)險性較低；如果線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”，待測者慢性苯中毒風(fēng)險性較高。

本發(fā)明所提供的評價待測者發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險性的方法為方法二，具體可包括如下步驟：檢測待測者線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”還是“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”；線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”的待測者慢性苯中毒風(fēng)險性低于線粒體中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的待測者。

“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”或“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”作為標(biāo)記物在評價慢性苯中毒風(fēng)險性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述特異引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述特異引物對在評價慢性苯中毒風(fēng)險性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述特異引物對在制備用于評價慢性苯中毒風(fēng)險性的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明所提供的評價待測者發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險性的方法為方法三，具體可包括如下步驟：以待測者的線粒體基因組DNA為模板，采用所述特異引物對進(jìn)行PCR擴增；PCR擴增產(chǎn)物為738bp的待測者慢性苯中毒風(fēng)險性較低，PCR擴增產(chǎn)物為729bp的待測者慢性苯中毒風(fēng)險性較高。

本發(fā)明所提供的評價待測者發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險性的方法為方法四，具體可包括如下步驟：以待測者的線粒體基因組DNA為模板，采用所述特異引物對進(jìn)行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物為738bp的待測者慢性苯中毒風(fēng)險性低于PCR擴增產(chǎn)物為729bp的待測者。

上述任一所述高于可為在統(tǒng)計學(xué)上的高于。

上述任一所述低于可為在統(tǒng)計學(xué)上的低于。

上述任一所述“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”可如序列表的序列1所示；

上述任一所述“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”可為所述“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”缺失了第1至9個核苷酸。上述任一所述“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”可如序列表的序列1自5′末端起第10至18位所示。

上述任一所述慢性苯中毒為職業(yè)性慢性苯中毒。

以27名慢性苯中毒的患者作為病例組，以40名正常健康體檢者作為對照組，對其線粒體基因組進(jìn)行研究。結(jié)果表明，病例組中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的比例(33.3％)顯著高于對照組(10.0％)，且兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ²＝5.090，P＝0.024)，OR值(95％CI)為4.5(1.21-16.62)。因此，線粒體基因組DNA中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的個體發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險高于線粒體基因組DNA中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”的個體發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險。因此，“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”與慢性苯中毒風(fēng)險性有密切聯(lián)系，可評價慢性苯中毒的風(fēng)險性。

附圖說明

圖1為對照組的測序結(jié)果。

圖2為病例組的測序結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

天凈沙系列柱式血液DNA提取試劑為北京天恩澤生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。 Long PCR Master Mix為普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司。

“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”如序列表的序列1所示?！?個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”為“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”缺失了第1至9個核苷酸。

下述實施例中的各個實驗均是在患者的知情同意的前提下進(jìn)行的，且均簽署知情同意書。

實施例1、2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型在評價慢性苯中毒風(fēng)險性中的應(yīng)用

一、病例的選擇

以確診為慢性苯中毒的患者27名(男性6名，平均年齡39.8±9.6歲；女性21名，平均年齡40.7±5.9歲)進(jìn)行研究，并依次編號p1-p27。以40名正常健康體檢者作為對照(男性24名，平均年齡42.1±8.3歲；女性16名，平均年齡35.3±11.3歲)，并依次編號h1-h40。

將上述27名慢性苯中毒的患者作為病例組，27名慢性苯中毒患者均滿足病例組納入標(biāo)準(zhǔn)。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：已確診為職業(yè)性慢性苯中毒(GBZ68-2013《職業(yè)性苯中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》)。

將上述40名正常健康體檢者作為對照組，40名正常健康體檢者均滿足對照組納入標(biāo)準(zhǔn)。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①無職業(yè)性苯接觸史；②無吸煙、飲酒史；③無遺傳疾病或家族史；④近3個月無內(nèi)無感染史、服藥史；⑤近3個月內(nèi)無X射線或其他放射線接觸史。

二、成套引物的制備

成套引物由引物F：5′-TATGCCCTTTTCCTAACACT-3′(序列表中序列2)和引物R：5′-TTGGGTGATGAGGAATAGTGTAAG-3′(序列表中序列3)組成。

成套引物中，引物F和引物R的摩爾比為1:1。

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物F和引物R。

三、2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型評價慢性苯中毒風(fēng)險性

1、分別取27名慢性苯中毒的患者和40名正常健康體檢者的外周血5mL，置于EDTA抗凝管中，然后100×g離心15min，收集上清液(上清液即為富血小板血漿)。

2、完成步驟1后，取所述上清液，采用天凈沙系列柱式血液DNA提取試劑提取DNA，得到線粒體基因組DNA。

3、以線粒體基因組DNA為模板，以步驟二合成的引物F和引物R為引物進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。

反應(yīng)體系為20μL，由10μL Long PCR Master Mix、1μL引物F、1μL引物R、2μL(約5ng)線粒體基因組DNA和6μL雙蒸水組成；初始反應(yīng)體系中，引物F的濃度為0.5μM，引物R的濃度為0.5μM。

反應(yīng)條件：95℃10s；95℃1min，58℃30s，72℃50s，35次循環(huán)；72℃10min。

4、完成步驟3后，取PCR擴增產(chǎn)物，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

對照組測序結(jié)果見圖1(NC_012920.1為正常人類線粒體基因組參考序列)，病例組測序結(jié)果見圖2(NC_012920.1為正常人類線粒體基因組參考序列)。結(jié)果表明，編號p1至編號p18的慢性苯中毒的患者和編號h1至編號h36的正常健康體檢者的PCR擴增產(chǎn)物中均具有2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列；編號p19至編號p27的慢性苯中毒的患者和編號h37至編號h40的正常健康體檢者的PCR擴增產(chǎn)物中均具有2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型。

5、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析步驟4獲得的實驗數(shù)據(jù)，組間比較采用卡方檢驗分析(以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義)；采用Logistic回歸分析模型比較病例組和對照組的9bp序列的基因型、相對優(yōu)勢比(OR)，95％置信區(qū)間(CI)來衡量9bp序列的基因型與慢性苯中毒風(fēng)險性的相關(guān)性。

統(tǒng)計結(jié)果見表1：病例組中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的比例(33.3％)顯著高于對照組(10.0％)，且兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ²＝5.090，P＝0.024)，OR值(95％CI)為4.5(1.21-16.62)。結(jié)果表明，線粒體基因組DNA中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”的個體發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險高于線粒體基因組DNA中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”的個體發(fā)生慢性苯中毒的風(fēng)險；所述高于為在統(tǒng)計學(xué)上的高于。因此，“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”與慢性苯中毒風(fēng)險性有密切聯(lián)系，可評價慢性苯中毒的風(fēng)險性。

表1

按照上述步驟，將步驟4替換為步驟B，其它步驟均不變，得到的統(tǒng)計結(jié)果與采用上述步驟得到的統(tǒng)計結(jié)果基本一致。步驟B為：完成步驟3后，取PCR擴增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測結(jié)果表明，編號p1至編號p18的慢性苯中毒的患者和編號h1至編號h36的正常健康體檢者的PCR擴增產(chǎn)物的大小為738bp、則編號p1至編號p18的慢性苯中毒的患者和編號h1至編號h36的正常健康體檢者的線粒體基因組DNA中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列”；編號p19至編號z27的慢性苯中毒的患者和編號h37至編號h40的正常健康體檢者的PCR擴增產(chǎn)物的大小為729bp、則編號p19至編號p27的慢性苯中毒的患者和編號h37至編號h40的正常健康體檢者的線粒體基因組DNA中具有“2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列的缺失型”；電泳檢測結(jié)果與步驟4的測序結(jié)果得到的結(jié)論完全一致。

<110> 深圳市職業(yè)病防治院

<120> 線粒體基因組9bp序列基因多態(tài)性在評價苯中毒風(fēng)險中的應(yīng)用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 1

ccccctctac cccctcta 18

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<213> 人工序列

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ttgggtgatg aggaatagtg taag 24