本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種長非編碼RNA及其在診斷/治療胃癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的癌癥之一。盡管手術(shù)、介入、放化療、靶向治療和免疫治療等綜合性治療手段順利開展，但胃癌的死亡率仍較高，大部分患者在就診時(shí)已經(jīng)處于癌癥晚期。即使接受根治性手術(shù)或者輔助化療的患者，仍有近60％的病人出現(xiàn)胃癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此，更好地了解胃癌的發(fā)病機(jī)理和分子機(jī)制對胃癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。

除蛋白編碼基因的異常調(diào)控，越來越多的證據(jù)表明，一些非編碼RNA產(chǎn)物尤其是長非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)的異常表達(dá)也參與胃癌惡性進(jìn)展。lncRNAs是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子，有別于其他小分子非編碼RNA，其可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平等多種層面調(diào)控基因的表達(dá)，影響腫瘤發(fā)生。本課題組前期研究結(jié)果顯示：lncRNA HOXA-AS2通過表觀沉默P21/PLK3/DDIT3的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。lncRNA HOTAIR可競爭性吸附miR-331-3p上調(diào)HER2，促進(jìn)胃癌發(fā)展。更多文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示：lncRNAs發(fā)揮原癌基因或抑癌基因的作用，普遍參與胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過程。提示lncRNAs可能作為胃癌細(xì)胞功能重要調(diào)控分子之一，影響胃癌進(jìn)程。

為進(jìn)一步研究lncRNAs在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們通過對GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus)中一份胃癌病例-對照芯片數(shù)據(jù)(GSE58828)分析發(fā)現(xiàn)，LINC00707在胃癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)。同時(shí)對TCGA數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas)中30例胃癌患者癌和癌旁組織中LINC00707的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，LINC00707在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。臨床病理資料分析結(jié)果顯示，高表達(dá)的LINC00707與胃癌患者的腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，提示LINC00707可能在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用且可能成為胃癌診斷及預(yù)后的分子靶標(biāo)。細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞系中敲低LINC00707的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)干擾LINC00707的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的腫瘤形成能力。綜上結(jié)果表明：LINC00707在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮原癌基因的作用，參與胃癌的惡性進(jìn)程，并可能作為胃癌患者診斷和預(yù)后的分子標(biāo)記物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供用于診斷胃癌預(yù)后情況或作為治療胃癌藥物靶點(diǎn)的lncRNA LINC00707，其基因位于10p14，長度為3087bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1，

SEQ ID NO:1：

本發(fā)明還涉及識(shí)別所述的長非編碼RNA的標(biāo)記物在制備判斷胃癌治療預(yù)后情況的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的標(biāo)記物包括但不限于：

(1)結(jié)合所述長非編碼RNA的引物/引物組或熒光標(biāo)記的結(jié)合所述長非編碼RNA的引物/引物組；

(2)結(jié)合所述長非編碼RNA的小分子化合物；

(3)結(jié)合所述長非編碼RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗體或抗體功能片段、熒光標(biāo)記的抗體或抗體功能片段、RNA結(jié)合蛋白或其功能片段、熒光標(biāo)記的RNA結(jié)合蛋白或其功能片段。

優(yōu)選的，所述的引物組或熒光標(biāo)記的引物組的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，

LINC00707 Primer F(SEQ ID NO：2)：5'TCACATCTGTGAAAAGAGTGCT3',

Primer R(SEQ ID NO：3)：5’-CTGGACTGTGAGTACCAGGC-3’。

GAPDH Primer F(SEQ ID NO：4)：5'GGGAGCCAAAAGGGTCAT 3',

Primer R(SEQ ID NO：5)：5'GAGTCCTTCCACGATACCAA 3'。

本發(fā)明還涉及包含所述的識(shí)別所述的長非編碼RNA的標(biāo)記物的用于判斷非小細(xì)胞肺癌治療預(yù)后情況的試劑或試劑盒。

本發(fā)明還涉及所述的識(shí)別所述的長非編碼RNA的標(biāo)記物或包含所述標(biāo)記物的試劑或試劑盒在判斷胃癌的治療預(yù)后情況中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及所述的長非編碼RNA在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用；

本發(fā)明還涉及所述的長非編碼RNA在作為篩選判斷胃癌預(yù)后情況的診斷試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及所述的長非編碼RNA在作為篩選治療胃癌的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)方案

通過qPCR篩查臨床組織中LINC00707的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在胃癌患者癌組織中LINC00707的表達(dá)量較正常癌旁組織中表達(dá)量上調(diào)。猜想：高表達(dá)的LINC00707可能在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步探討LINC00707在胃癌惡性進(jìn)程中的重要作用，我們將60對胃癌組織中LINC00707的表達(dá)水平分為高表達(dá)組(n＝30)和低表達(dá)組(n＝30)，分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果提示：LINC00707在胃癌組織的高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，可能成為胃癌診斷及預(yù)后的分子靶標(biāo)。

隨后選用國際認(rèn)可的4株胃癌細(xì)胞系(BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS)，1株正常胃粘膜上皮細(xì)胞系(GES-1)作為實(shí)驗(yàn)研究對象，選用BGC-823和SGC-7901細(xì)胞做功能缺失性實(shí)驗(yàn)，MGC-803細(xì)胞做功能獲得性實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)LINC00707的干擾序列，以lip2000為轉(zhuǎn)染載體將干擾序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞后模擬胃癌的發(fā)病過程。通過檢測在干擾序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞后細(xì)胞的功能如增殖，凋亡，遷移等。從而證明在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中敲低LINC00707的表達(dá)，影響了胃癌細(xì)胞的增殖，凋亡及遷移。進(jìn)而加速胃癌的進(jìn)程。相反，構(gòu)建LINC00707質(zhì)粒，正反驗(yàn)證LINC00707在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞功能。

組織收集

60對胃癌和癌旁組織標(biāo)本取自2011年4月至2012年4月之間在江蘇省人民醫(yī)院和南京市第一醫(yī)院確診為胃癌并接受手術(shù)的患者。所有的組織取下后立即置于液氮中冷凍起來并放于-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存。此研究通過南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意，并得到所有胃癌患者的知情同意書。

細(xì)胞培養(yǎng)

4株胃癌細(xì)胞系(BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS)，1株正常胃粘膜上皮細(xì)胞系(GES-1)均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。BGC-823、MGC-803細(xì)胞均培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(10％FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中；SGC-7901、GES-1細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(10％FBS)的DMEM(GIBCO-BRL)培養(yǎng)基中；AGS細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(10％FBS)的F12-k培養(yǎng)基中；培養(yǎng)基中含雙抗100U/ml青霉素和100毫克/毫升鏈霉素(Invitrogen公司)。所有細(xì)胞在5％CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％-90％時(shí)傳代。

RNA提取和定量PCR分析

根據(jù)試劑的使用說明，用Trizol試劑分離總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa Prime Script試劑盒(TaKaRa，大連，中國)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最終體積為20μl。結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對量法與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析。計(jì)算公式為：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)Refseq數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)查詢?nèi)祟怢INC00707基因的全長轉(zhuǎn)錄本序列(NR_038291.1)，公司通過化學(xué)合成法合成LINC00707的全長序列，并插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1+中，構(gòu)建LINC00707過表達(dá)載體pcDNA-LINC00707，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，搖菌，培養(yǎng)，挑選單克隆菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后測序驗(yàn)證序列是否發(fā)生突變。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

所有用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體，均用去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取(DNA Midiprep試劑盒，Qiagen)。LINC00707、HuR的干擾序列及亂序?qū)φ?si-NC)均購自Invitrogen公司(Invitrogen公司，CA，USA)。將BGC-823、SGC-7901、MGC-803細(xì)胞按每孔2×105個(gè)細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，在轉(zhuǎn)染前12h棄掉原有培養(yǎng)基，換成無雙抗培養(yǎng)基；取10μl脂質(zhì)體稀釋于250μL的OPTI-MEM中，溫和吹打混勻，室溫下孵育5min；取100pmol siRNA、si-NC或4ug pcDNA、pcDNA-LINC00707分別稀釋于250μL OPTI-MEM中，吹打混勻，室溫下孵育5min；將孵育好的脂質(zhì)體與siRNA或質(zhì)粒稀釋液混合，溫和吹打混勻，在室溫下繼續(xù)孵育20min；將上述混合物均勻滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培養(yǎng)板中，輕輕混勻，繼續(xù)放入37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)6h后，棄去OPTI-MEM培養(yǎng)基，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放入37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后24-48h，收集細(xì)胞提取總RNA或蛋白進(jìn)行qRT-PCR檢測或western blot分析。

細(xì)胞增殖活性檢測

MTT實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后24h的BGC-823、SGC-7901、MGC-803細(xì)胞按每孔3000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板；待細(xì)胞80％貼壁后，細(xì)胞同步化12h，棄去原有培養(yǎng)基。每個(gè)樣本設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔總反應(yīng)體積為200μl；每孔加入20μl的MTT反應(yīng)液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h；棄去上清液，每孔加入150μl二甲亞砜(DMSO)，在微樣振蕩器上振蕩10min，酶標(biāo)儀測定490nm波長處的吸光度。

克隆形成實(shí)驗(yàn)：用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(500個(gè))接種于6孔板，使細(xì)胞分散均勻；放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每4天換液一次，培養(yǎng)2周；當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS輕輕清洗2次；加純甲醇或1:3醋酸/甲醇1ml，固定15分鐘；棄甲醇固定液，加1ml 0.1％結(jié)晶紫染色液染15分鐘，然后用PBS緩慢洗去染色液，空氣干燥；將6孔板倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率。

Edu實(shí)驗(yàn)：1、Edu標(biāo)記，用細(xì)胞培養(yǎng)基按1000:1的比例稀釋Edu溶液(試劑A)，制備適量50μM的Edu培養(yǎng)基；每孔加入200μl 50μM的Edu培養(yǎng)基孵育2h，棄培養(yǎng)基；PBS清洗細(xì)胞1-2次， 每次5min。2、細(xì)胞固定化，每孔加入1ml細(xì)胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)，室溫孵育30min，棄固定液；每孔加入1ml 2mg/ml甘氨酸，脫色搖床孵育5min后，棄甘氨酸溶液；每孔加入1ml PBS，脫色搖床清洗5min，棄PBS；每孔加入1ml滲透劑(0.5％TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10min；PBS清洗1次，5min。

3、Apollo染色

Apollo染色反應(yīng)液的配方如下：

每孔加入200μl的上述Apollo染色反應(yīng)液，避光，室溫，脫色搖床孵育30min后，棄染色反應(yīng)液；加入1ml滲透劑，脫色搖床清洗2-3次，每次10min，棄滲透劑；每孔每次加入1ml甲醇清洗1-2次，每次5min；PBS清洗1次，5min。4、DAPI染色和拍照，按DAPI:PBS(1:1000)配，平均每孔200μl分配，搖床10min；用PBS洗5次，每次5min；在載玻片上滴一滴防淬滅劑，取出玻片，正面朝下；在正置熒光顯微鏡下拍照。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

Transwell實(shí)驗(yàn)：將BGC-823、SGC-7901、MGC-803細(xì)胞按每孔2×105個(gè)細(xì)胞種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染LINC00707、HuR干擾序列或LINC00707過表達(dá)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染后24-48h取出細(xì)胞，棄上清，用PBS洗1-2遍，用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，1ml培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻成細(xì)胞懸液，取少量細(xì)胞到顯微鏡下計(jì)數(shù)；調(diào)整細(xì)胞密度至3×104，取細(xì)胞懸液300μl加入Transwell小室；24孔培養(yǎng)板下室加入700μl含20％FBS的培養(yǎng)基，放入孵箱中培養(yǎng)12-48h；取出小室用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，放入700μl的純甲醇中固定20min；將小室放入0.1％結(jié)晶紫中對小室外底面的細(xì)胞染色，用流水清洗小室，室內(nèi)倒扣晾干；選取倒置顯微鏡對小室拍照計(jì)數(shù)。

裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

選取4周大的雄性免疫缺陷小鼠，購自南京大學(xué)模式動(dòng)物中心；培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染sh-LINC00707質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒載體；轉(zhuǎn)染24h后從孵箱取出細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用1ml PBS清洗兩遍，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液收集到15ml無菌無酶的離心管中，1500g，4℃，離心5min；棄上清，用7ml PBS重懸細(xì)胞沉淀，1500g，4℃，離心5min；棄上清，用700μl PBS重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌無酶的EP管中，用封口膜封口，置于冰上備用；使用1ml注射器每次吸取100μl細(xì)胞懸液，吸前吹打混勻，皮下注射到小鼠腋下；等瘤體出現(xiàn)后，每三天觀察并記錄一次兩組的小鼠瘤體大小；待瘤體形成15天后處死小鼠，取出胃部組織瘤體，拍照記錄，并稱重。以上所有的實(shí)驗(yàn)程序都是按著NIH1996年版的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)來執(zhí)行的。用全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)小鼠，自由飲水，室溫(22±2)℃，濕度50～60％，通風(fēng)良好，12:12h光照/黑暗周期。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和倫理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。

流式細(xì)胞術(shù)

凋亡檢測，用胰酶消化收集轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)后BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的，隨后根據(jù)FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(BD)及其使用說明予以Annexin V-FITC熒光探針和碘化丙錠(PI)染色。流式細(xì)胞儀檢測和分析。

細(xì)胞周期檢測，根據(jù)說明書使用CycleTESTTM PLUS DNA試劑盒(BD)予以PI染色，隨后用FACScan分析。

Tunel實(shí)驗(yàn)

吸取舊培養(yǎng)基，PBS清洗2次；4％多聚甲醛固定，室溫孵育30min；PBS洗3次，每次5min；加入1％Triton，冰上孵育10min；PBS洗3次，每次5min；加入Enzyme Solution/Label Solution(10/90)，每孔100μl；37℃，避光反應(yīng)，60min；PBS洗3次，每次5min；按DAPI:PBS(1:1000)配，平均每孔200μl分配，搖床10min；用PBS洗5次，每次5min在載玻片上滴一滴防淬滅劑，取出玻片，正面朝下；在正置熒光顯微鏡下拍照。

免疫組化實(shí)驗(yàn)

脫蠟：二甲苯3×5min，100％乙醇1×5min，100％乙醇1×1min，95％乙醇2×1min，70％乙醇1×1min，雙蒸水浸泡洗去乙醇；燒杯中盛放600ml DW+5.6ml抗原修復(fù)液，將玻片架于塑料架上，浸入，置微波爐大火3-5min，沸騰就調(diào)成小火，15-20min，時(shí)間長些利于抗原更多的暴露；自然冷卻后，擦干組織片周圍的水，用免疫組化筆劃好；PBS+0.03％Tween20(300μl Tween20加入1000ml PBS中)，滴加，沖洗5min，甩去；3％H2O2滴加，15min，甩去；PBS沖洗5min；封閉抗原(用PBS配制5％脫脂牛奶滴加)30min；滴加PBS+0.03％Tween20沖洗，甩去水分，加入一抗，4℃過夜；滴加PBS+0.03％Tween20沖洗，3×5min；滴加二抗孵育；滴加PBS+0.03％Tween20沖洗，2×5min，PBS沖洗1×5min；滴加DAB，流水沖洗5-10min；蘇木素染色1min，流水沖洗5min；1％Hcl(用70％酒精配制)浸泡5-15s，流水沖洗10min；70％乙醇2min，80％乙醇2min，95％乙醇2×2min，100％乙醇2×15min，二甲苯3×5min；封片。

亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

根據(jù)使用說明書使用PARIS試劑盒(Life Technologies，USA)分離BGC-823、SGC-7901、MGC-803細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。使用qPCR方法檢測LINC00707、GAPDH和U1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布。GAPDH為細(xì)胞質(zhì)參照，U1為細(xì)胞核參照。以總RNA百分比呈現(xiàn)LINC00707、GAPDH和U1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)情況。

RNA免疫印跡(RIP)

裂解BGC-823、SGC-7901細(xì)胞供免疫印跡實(shí)驗(yàn)使用。將細(xì)胞上清與包被分別識(shí)別HuR和對照IgG的蛋白A/G瓊脂糖磁珠在4℃孵育6個(gè)小時(shí)。隨后，清洗磁珠，用0.1％SDS/0.5mg/ml蛋白酶K在55℃孵育30分鐘以去除蛋白。提取RNA供qPCR分析。

數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)皆用SPSS17.0軟件分析，以三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間差異用雙尾Student’s T檢驗(yàn)，胃癌患者預(yù)后采用Kaplan-Meier函數(shù)分析。P值標(biāo)示于圖中，*P<0.05，**P<0.01為差異顯著。

附圖說明

圖1.LINC00707在胃癌組織中高表達(dá)及其臨床意義

1A、1B：GEO數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫分析得出LINC00707在胃癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)；

1C：生物信息學(xué)預(yù)測LINC00707可編碼性極低

1D：LINC00707在胃癌患者的癌組織(n＝60)與配對的癌旁組織表達(dá)水平比較；

1E：Kaplan-Meier生存函數(shù)用于分析兩組病人的LINC00707表達(dá)水平與病人預(yù)后的相關(guān)性。

圖2.LINC00707在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

2A：LINC00707在胃癌細(xì)胞中表達(dá)較正常胃粘膜上皮細(xì)胞系(GES-1)上調(diào)

2B：胃癌細(xì)胞中干擾LINC00707，其中LINC00707 1#和2#產(chǎn)生的干擾效率更高，以下功能缺失性實(shí)驗(yàn)選擇1#和2#干擾序列

2C：胃癌細(xì)胞中過表達(dá)LINC00707

圖3.LINC00707對胃癌細(xì)胞增殖的影響

3A：MTT實(shí)驗(yàn)，干擾LINC00707能顯著抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的增殖活力；過表達(dá)LINC00707促進(jìn)MGC-803的增殖活力。

3B：克隆形成實(shí)驗(yàn)，敲低LINC00707后，BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的克隆形成能力受到抑制；過表達(dá)LINC00707顯著提高M(jìn)GC-803細(xì)胞的克隆形成能力。

3C：Edu實(shí)驗(yàn)，干擾LINC00707能顯著抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的增殖活力

圖4.LINC00707促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，抑制胃癌細(xì)胞凋亡

4A：流式細(xì)胞術(shù)，下調(diào)LINC00707表達(dá)可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡；

4B：Tunel實(shí)驗(yàn)，下調(diào)LINC00707表達(dá)可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡；

4C：transwell實(shí)驗(yàn)，下調(diào)LINC00707的表達(dá)可以抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；過表達(dá)LINC00707的表達(dá)可以促進(jìn)MGC-803細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

圖5.LINC00707提高胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的腫瘤形成能力

5A-B：裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察并記錄小鼠瘤體大小，待瘤體形成15天后處死小鼠，取出瘤體，拍照記錄；同時(shí)量取瘤體的大小并稱其重量；

5C：瘤體檢測，敲低sh-LINC00707 2#組小鼠瘤體的平均重量顯著低于對照組瘤體的重量。

圖6LINC00707在胃癌細(xì)胞中與HuR蛋白結(jié)合

6A：核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)，LINC00707主要定位在細(xì)胞質(zhì)

6B：GEO數(shù)據(jù)庫中一份測序結(jié)果(GSE29779)分析LINC00707可能與RNA結(jié)合蛋白HuR結(jié)合

6C：生物信息學(xué)預(yù)測LINC00707可能與HuR蛋白結(jié)合

6D-E：RNA-pulldown和RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC00707與HuR蛋白高度結(jié)合

圖7LINC00707和HuR結(jié)合提高VAV3與F11R mRNAs的穩(wěn)定性

7A：BGC-823細(xì)胞中分別敲低LINC00707和HuR 2#，通過轉(zhuǎn)錄組高通量測序檢測差異表達(dá)基因

7B-C：對276個(gè)共同差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些基因大多與細(xì)胞間粘附、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖以及凋亡等生物學(xué)過程相關(guān)

7D：qRT-PCR在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中驗(yàn)證了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性

圖8VAV3、F11R可能是LINC00707和HuR下游共同的靶基因

8A：生物信息學(xué)的方法預(yù)測HuR蛋白與篩選的mRNA之間的結(jié)合豐度，VAV3、F11R的mRNAs與HuR蛋白的結(jié)合豐度較高，且具有一致性

8B：RIP實(shí)驗(yàn)在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中驗(yàn)證了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性

圖9“LINC00707-HuR”復(fù)合體與VAV3、F11R mRNAs結(jié)合，提高靶mRNAs的穩(wěn)定性

9A-B：下調(diào)LINC00707和HuR后，VAV3和F11R的mRNAs的半衰期明顯縮短

圖10HuR促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

10A：HuR在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中上調(diào)倍數(shù)最高

10B：在BGC-823和SGC-7901中分別轉(zhuǎn)染HuR 1#、2#干擾序列后，發(fā)現(xiàn)2#干擾序列產(chǎn)生的干擾效率更高，以下功能缺失性實(shí)驗(yàn)選擇HuR 2#干擾序列

10C：干擾HuR能顯著抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的增殖活力

10D：敲低HuR后，BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的克隆形成能力受到抑制

10E：下調(diào)HuR的表達(dá)可以抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。

一般性說明：

實(shí)施例中末注明具體條件的的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照Sambrook，J等人編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rded.黃培堂等譯，科學(xué)出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進(jìn)行，其它沒有詳細(xì)描述的技術(shù)相應(yīng)于本領(lǐng)域人員來說是熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。

本發(fā)明的材料：本申請中提及的細(xì)胞株、慢病毒干擾載體以及培養(yǎng)基均有商品供應(yīng)或以別的途徑 能為公眾所得，它們僅作舉例，對本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來代替。

干擾序列如下：

SEQ ID NO:6

LINC00707 1# CAUGACGUGAGAACUUACUAGAGAU

AUCUCUAGUAAGUUCUCACGUCAUG

SEQ ID NO:7

LINC00707 2# UUCAGUGUUAGUCUUAUCCACCUGU

ACAGGUGGAUAAGACUAACACUGAA

SEQ ID NO:8

LINC00707 3# UGUCUGUUAACACUAAUAGAGGGUG

CACCCUCUAUUAGUGUUAACAGACA

SEQ ID NO:9

HuR 1# UUACCAGUUUCAAUGGUCATT

UGACCAUUGAAACUGGUAATT

SEQ ID NO:10

HuR 2# CACGCUGAACGGCUUGAGGTT

CCUCAAGCCGUUCAGCGUGTT

SEQ ID NO:11

NC UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

ACGUGACACGUUCGGAGAATT

SEQ ID NO:12

sh-LINC00707 1#

CACCGGCTTTCCATGACCCATAAACTTCAAGAGAGTTTATGGGTCATGGAAAGCCTTTTTTGGATCCAAAAAAGGCTTTCCATGACCCATAAACTCTCTTGAAGTTTATGGGTCATGGAAAGCC

SEQ ID NO:13

sh-LINC00707 2#

CACCGGACCCATCACCTCAACTTTCTTCAAGAGAGAAAGTTGAGGTGATGGGTCCTTTTTTGGATCCAAAAAAGGACCCATCACCTCAACTTTCTCTCTTGAAGAAAGTTGAGGTGATGGGTCC

SEQ ID NO:14

sh-HuR

CACCGCGACTTCAACACCAACAAGTTTCAAGAGAACTTGTTGGTGTTGAAGTCGCTTTTTTG GATCCAAAAAAGCGACTTCAACACCAACAAGTTCTCTTGAAACTTGTTGGTGTTGAAGTCGC

實(shí)施例1檢測LINC00707在組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

取0.1g組織，液氮研磨充分(成粉末狀)或1-5×10⁷細(xì)胞棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS潤洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以無酶槍頭吹打混勻，靜置5min，將裂解液移入預(yù)先標(biāo)記好的無酶1.5ml的離心管中。4℃7500g離心5分鐘，取上清加入1/5體積的氯仿，顛倒混勻30s，靜置2min。4℃，12000g離心，15min。溶液分三層(水相-白色沉淀-紅色有機(jī)物)，轉(zhuǎn)移水相層至新的1.5ml離心管中，盡量不要吸到白色沉淀。加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，放置5-10min。4℃，12000g離心，10min。吸棄上清，加入1ml 75％的乙醇(現(xiàn)配)，洗滌RNA沉淀。4℃，7500g離心，5min，棄上清。盡量去除75％的酒精，于室溫中晾干，約15min。用無RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

紫外吸收測定法測定RNA的濃度。使用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，測量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零。在260nm處讀值1為表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA純度的檢測，比值范圍在1.8到2.1表明符合要求。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。配制1％的瓊脂糖膠。加熱溶解瓊脂糖，冷卻，加入1μl溴化乙錠(EB，10mg/ml)。搖勻后倒膠，待膠冷凝后，置于電泳槽中，浸于1×TAE緩沖液中平衡10min，待用。點(diǎn)樣。按1：4(v/v)將5×核酸電泳上樣緩沖液與樣本混合，準(zhǔn)確將各樣本含有1μg的RNA加入凝膠孔中。80V恒壓電泳50min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

Tris-乙酸(TAE)緩沖液配方(1L)50×：

實(shí)時(shí)定量PCR

胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本，胃癌細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa PrimeScript試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃15min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；85℃5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。根據(jù)Genebank提供的基因序列，設(shè)計(jì)引物序列，

QPCR應(yīng)用7300PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA樣品采用三部法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件：

結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對量法與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析。計(jì)算公式為：2^{^(-△Ct)}，△Ct＝Ct gene-Ct control。

LINC00707的引物如下：

Primer F(SEQ ID NO：2)：

5’-TCACATCTGTGAAAAGAGTGCT-3’，

Primer R(SEQ ID NO：3)：

5’-CTGGACTGTGAGTACCAGGC-3’。

結(jié)果表明，LINC00707在胃癌組織表達(dá)較正常組織上調(diào)(圖1A、1B)。利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測了60例胃癌組織/癌旁正常組織中LINC00707的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比，LINC00707的表達(dá)在癌組織中較正常組織表達(dá)上調(diào)(圖1D)。

實(shí)施例2上調(diào)的LINC00707與胃癌入侵性的腫瘤特點(diǎn)和不良預(yù)后有顯著相關(guān)

為進(jìn)一步探討LINC00707在胃癌惡性進(jìn)程中的重要作用，我們將60對胃癌組織中LINC00707的表達(dá)水平分為高表達(dá)組(n＝30)和低表達(dá)組(n＝30)，分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的相關(guān)性。顯而易見的是，胃癌中LINC00707高表達(dá)與TNM分期(p＝0.035)和腫瘤大小(p＝0.017)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p＝0.003)顯著相關(guān)。然而，LINC00707的表達(dá)與別的參數(shù)如性別(p＝0.795)和年齡(p＝0.301)等(表1)不相關(guān)。為了確定LINC00707的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，無病生存曲線(d isease-free survival,DFS)和總生存曲線(overall survival,OS)曲線根據(jù)Kaplan-Meier分析和對數(shù)秩檢驗(yàn)中的LINC00707表達(dá)水平而作圖。(圖1E)。這些結(jié)果表明LINC00707高表達(dá)組的胃癌患者的無病生存率和總生存率均低于LINC00707低表達(dá)組的胃癌患者(圖1E)。這些結(jié)果提示LINC00707在胃癌組織的高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，可能成為胃癌診斷及預(yù)后的分子靶標(biāo)。

表1 LINC00707的表達(dá)與胃癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性

實(shí)施例3 LINC00707對胃癌細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后24h的BGC-823、SGC-7901、MGC-803細(xì)胞按每孔3000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板；待細(xì)胞80％貼壁后，細(xì)胞同步化12h，棄去原有培養(yǎng)基。每個(gè)樣本設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔總反應(yīng)體積為200μl；每孔加入20μl的MTT反應(yīng)液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h；棄去上清液，每孔加入150μl二甲亞砜(DMSO)，在微樣振蕩器上振蕩10min，酶標(biāo)儀測定490nm波長處的吸光度。結(jié)果顯示：干擾LINC00707能顯著抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的增殖活力；過表達(dá)LINC00707促進(jìn)MGC-803的增殖活力(圖3A)

克隆形成實(shí)驗(yàn)：用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(500個(gè))接種于6孔板，使細(xì)胞分散均勻；放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每4天換液一次，培養(yǎng)2周；當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS輕輕清洗2次；加純甲醇或1:3醋酸/甲醇1ml，固定15分鐘；棄甲醇固定液，加1ml 0.1％結(jié)晶紫染色液染15分鐘，然后用PBS緩慢洗去染色液，空氣干燥；將6孔板倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率。敲低LINC00707后，BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的克隆形成能力受到抑制；過表達(dá)LINC00707顯著提高M(jìn)GC-803細(xì)胞的克隆形成能力(圖3B)。此外， 我們在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中下調(diào)LINC00707后進(jìn)行了Edu實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：與對照組相比，干擾組中Edu陽性細(xì)胞的比例明顯減少(圖3C)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：在胃癌細(xì)胞中，LINC00707可能扮演癌基因的角色，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例4 LINC00707促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，抑制胃癌細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步研究LINC00707是否通過細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控影響胃癌細(xì)胞的增殖能力，我們在敲低LINC00707后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)下調(diào)LINC00707表達(dá)可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡(圖4A)，但是對細(xì)胞周期并無明顯影響(結(jié)果未顯示)。緊接著，在SGC-7901細(xì)胞中干擾LINC00707后進(jìn)行Tunel實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：與對照組相比，Tunel陽性細(xì)胞的比例明顯增高(圖4B)。

transwell實(shí)驗(yàn)：將BGC-823、SGC-7901、MGC-803細(xì)胞按每孔2×105個(gè)細(xì)胞種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染LINC00707、HuR干擾序列或LINC00707過表達(dá)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染后24-48h取出細(xì)胞，棄上清，用PBS洗1-2遍，用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，1ml培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻成細(xì)胞懸液，取少量細(xì)胞到顯微鏡下計(jì)數(shù)；調(diào)整細(xì)胞密度至3×104，取細(xì)胞懸液300μl加入Transwell小室；24孔培養(yǎng)板下室加入700μl含20％FBS的培養(yǎng)基，放入孵箱中培養(yǎng)12-48h；取出小室用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，放入700μl的純甲醇中固定20min；將小室放入0.1％結(jié)晶紫中對小室外底面的細(xì)胞染色，用流水清洗小室，室內(nèi)倒扣晾干；選取倒置顯微鏡對小室拍照計(jì)數(shù)。

細(xì)胞遷移在腫瘤的發(fā)展發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。為進(jìn)一步檢測LINC00707對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，我們進(jìn)行了transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：封閉LINC00707后，穿過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少，說明下調(diào)LINC00707的表達(dá)可以抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；過表達(dá)LINC00707后，穿過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多，說明上調(diào)LINC00707的表達(dá)可以增強(qiáng)MGC-803細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力(圖4C)。

實(shí)施例4 LINC00707提高胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的腫瘤形成能力

為進(jìn)一步驗(yàn)證LINC00707對胃癌細(xì)胞瘤體形成能力的影響，我們在SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-LINC00707質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒載體，皮下注射4周大的雄性免疫缺陷小鼠。等瘤體出現(xiàn)后，每三天觀察并記錄一次兩組的小鼠瘤體大小。待瘤體形成15天后處死小鼠，取出瘤體，拍照記錄(圖5A)，同時(shí)量取瘤體的大小并稱其重量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染形成的瘤體組相比較，轉(zhuǎn)染sh-LINC00707質(zhì)粒組小鼠體內(nèi)瘤體形成能力顯著減弱(圖5B)；同時(shí)瘤體檢測結(jié)果顯示：敲低LINC00707組小鼠瘤體的平均重量顯著低于對照組瘤體的重量(圖5C)。取瘤體組織提取總RNA，使用qRT-PCR技術(shù)檢測LINC00707在兩組瘤體組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于對照組，下調(diào)LINC00707組小鼠的瘤體中LINC00707的表達(dá)水平顯著降低(圖5D)。H&E染色及免疫組化檢測結(jié)果顯示：干擾LINC00707組小鼠瘤體組織中ki-67的表達(dá)水平明顯低于對照組小鼠瘤體組織(圖5E)。綜上結(jié)果證實(shí)：敲低LINC00707表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞的腫瘤形成能力。以上所有的實(shí)驗(yàn)程序都是按著NIH1996年版的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)來執(zhí)行的。用全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)小鼠，自由飲水，室溫(22±2)℃， 濕度50～60％，通風(fēng)良好，12:12h光照/黑暗周期。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和倫理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種長非編碼RNA及其在診斷/治療胃癌中的應(yīng)用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3087

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaataaagc aggcagagga acgtggaagg actagactgc ctgagtcttc tgaccttcat 60

ctttcccctg tgttggatgc ctcctgccct caaacatcag actccaggtt cttcagcttt 120

tggactcttg gacctacccc ccgagtggtt tgccaggggc tctcaggcct tcggctacag 180

actgagggct gcattatcag ctttcctact tttgaggttt tgggacttta ctggctttct 240

tgctcctcaa cttgcagatg gcctgttgtg ggacctcacc ttgtgatcat gtacatgagg 300

gaaatacaca cccctcccag ggatgatgga aggttaaggt cctaacacct cctgcacatc 360

tgagcagctg cacattgaac cagatagtcc tggaatgtgg gaaaacagag gcagactcaa 420

gagtctggaa cattatttta ggatcacaca aaaaagatac ataattttca tagaatgata 480

ctgaaagcat ctcaaaaata aaatcacgag tatctgcaga tcactatgag actggactgg 540

aacattacct tcagacacat tgatatgact acatgctgga cattttcttg cggaaatcca 600

aaagaaatcc ccattttctt gcagaaatct aaaataatct cccctatgtg caagtcagac 660

tgagcaccac tcccaagacc atgacctccc ctgcagccct gctccttccc actcacctct 720

cctcttgaga aagccacctc ccaccaccca gtctgcagtg ccagaaaact ggaaaccagc 780

ccctaagctg ctttcacctt cggcccattt ctcactagcc agcctctccc acggcctccc 840

cagtttcttc aaatacaccc cctccactat tcaccatact gccaccgtga tttatttaca 900

actttttgtc cggattacct cagtagcctt ctaattgtcc cctttgcatc taaagtagcc 960

cctctcatcc cccaaatctt acgtcactct tctacataat tctggctttc catgacccat 1020

aaaccacatt tctcaagtgt gctctatgct ggcttgaata tgttaataat cttaattcta 1080

cttttagtgc aattttctta gagctggcat cactttcatc atgacgtgag aacttactag 1140

agataggcaa tgatgactca cagtcaagcc acatgtcata tgctgcagac atctggactg 1200

ctgcttattt gcaaatcctt ttcttcatat ttttctcatt tgtagcactg gatcaattcc 1260

aattaagagt ttaataatga attaactaat gatttaaaca ggtggataag actaacactg 1320

aaccaatgat tttaagtaaa tctaaataca taaatccccc caaattatta atctatgttg 1380

tttactaaga agtgtattaa aatgatattg aaaaagtttg ctttgggaaa gagctagaag 1440

ttagaaggtc taggttcaaa tcccgcctct actccatcct tgactaagat gttggaccca 1500

tcacctcaac tttccttggg tctttttgcc cagacatgac ccgatgacac agagcttacc 1560

tggacctcca caatagtaaa tagaacaggg ccagcaaacc aaaatttgtt gagtccttta 1620

gaattaagta gcttagataa attttcatca aaatctttat atagtaggga atagaaaaaa 1680

gtcaattctg ttttatttga ggatgtatga atatgttacc atttttcaga ctctgattta 1740

ccttccaatt attgtttatt ggggtcattg taaattagtt atcatttttt gaatacacat 1800

tcactgctga caaagtggtg aagccagaag ttatgtttga ccagggaaga ttatgaccct 1860

caaaggagaa aaattcacag ggggtagttg attattggtg gaatggagtg agagtgaatt 1920

ccttaaaagt ttaaacgaaa gcagaactat attcatatca tggagggaac ttagtttcta 1980

atatgatgaa ctattgcccc aagtcatgac aataccttgc tctctggaag agaatgagtg 2040

agtttttcat ccgccaagat acacactcta tatttccaac catcacatct gccttgcagg 2100

ctgactgaac ccagagcaaa tcaatcacaa aagttaatcc aaaagacttc ccttcagctg 2160

ctggaaatca gtcatcacat ctgtgaaaag agtgctagtt ataacaaatg agatcacaaa 2220

tttgaccatt ttattagaca ccctctatta gtgttaacag acaaagatga aggttaagtt 2280

gaaatcaaat tgaaatcttc ttccctctgt acagattgca atatctgata ataccctcaa 2340

ctttcttggt gcaaattaat tgcctggtac tcacagtcca gtgttaacag gcaataatgg 2400

tgtgattcca gaggagagta ctaggtggca ggaaaataaa tgagattagc agtatttgac 2460

ttggagccat aggcatcaat tctgctccag ctgtcgacca ggttctaaaa acaagactcg 2520

gagcagcttt tgctcttgct agtgatgcag ggccaggaga gcccccacac tctgcatttg 2580

caggtgtcca tgaggggaag ccactcctgc atttatcctg tgagtggaga agctcagagg 2640

aatgaggaca ttccaacagg gtatcagaat tctcttttgt ttatgctaat tgacagcagg 2700

aacatcacca tcttggacaa acaccaccat tttaagttct cttttattta aaaactgcct 2760

aaatccagcc ccaaaacatc agcctaatgg ctattgtcag cataatcaga aacattccaa 2820

ccctaagata aacacccctc tggccagaaa tatgccgacc ccgagacagc ctcccctccg 2880

accagagaca ttccaaaccc gcagtaaact ttccttcaca tggaaacatt ccaaacctac 2940

aaaaagcttc cctcttccta aacccttaaa tatccttagt ctgcaagaga gaatgctcct 3000

gactgaaatc agccagaagc ccctctcagg tttattctcc aaaataaacc tgtctttgac 3060

tgttgagcca aaaaaaaaaa aaaaaaa 3087

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcacatctgt gaaaagagtg ct 22

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctggactgtg agtaccaggc 20

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggagccaaa agggtcat 18

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagtccttcc acgataccaa 20

<210> 6

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

caugacguga gaacuuacua gagauaucuc uaguaaguuc ucacgucaug 50

<210> 7

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uucaguguua gucuuaucca ccuguacagg uggauaagac uaacacugaa 50

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<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

ugucuguuaa cacuaauaga gggugcaccc ucuauuagug uuaacagaca 50

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

uuaccaguuu caauggucat tugaccauug aaacugguaa tt 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cacgcugaac ggcuugaggt tccucaagcc guucagcgug tt 42

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

uucuccgaac gugucacgut tacgugacac guucggagaa tt 42

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caccggcttt ccatgaccca taaacttcaa gagagtttat gggtcatgga aagccttttt 60

tggatccaaa aaaggctttc catgacccat aaactctctt gaagtttatg ggtcatggaa 120

agcc 124

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<212> DNA

<213> 人工序列

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caccggaccc atcacctcaa ctttcttcaa gagagaaagt tgaggtgatg ggtccttttt 60

tggatccaaa aaaggaccca tcacctcaac tttctctctt gaagaaagtt gaggtgatgg 120

gtcc 124

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caccgcgact tcaacaccaa caagtttcaa gagaacttgt tggtgttgaa gtcgcttttt 60

tggatccaaa aaagcgactt caacaccaac aagttctctt gaaacttgtt ggtgttgaag 120

tcgc 124