本發(fā)明涉及一種水溶性的生物硫醇雙光子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)非常重要的三種小分子生物硫醇，維持著生命體的各項(xiàng)生理平衡。當(dāng)人體內(nèi)生物硫醇的含量異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)各種疾病，例如升至緩慢、神經(jīng)性中毒、心血管疾病、器官衰竭等。所以，快速、定量的檢測(cè)出人體內(nèi)生物硫醇的含量具有重要意義。

相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，光譜法檢測(cè)具有操作方便、成本低、空間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，而且隨著光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，熒光檢測(cè)法已做到在細(xì)胞、組織以及活體中的實(shí)時(shí)監(jiān)控，在生物領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。而且雙光子技術(shù)相比于單光子技術(shù)，可以減弱光漂白和光毒性，減小樣品的檢測(cè)背景，提高信噪比，能夠更好的得到樣品的立體成像。但是，目前報(bào)道了許多生物硫醇探針，基于不同的熒光團(tuán)，利用不同的反應(yīng)機(jī)理識(shí)別三種生物硫醇。但是，硫化氫具有相似巰基結(jié)構(gòu)，而且具有更強(qiáng)的親核性，一直存在著干擾生物硫醇檢測(cè)的問(wèn)題。因此，研發(fā)出在復(fù)雜生物環(huán)境中特異性檢測(cè)生物硫醇的生物熒光傳感器是必不可少的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前有機(jī)小分子熒光探針在生物硫醇的檢測(cè)中所面臨的問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)分子設(shè)計(jì)，合成出一種水溶性的生物硫醇雙光子熒光探針，該探針可以用于水環(huán)境和生物環(huán)境中生物硫醇的傳感檢測(cè)。

本發(fā)明還提供了上述熒光探針的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種水溶性的生物硫醇雙光子熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：

上述的水溶性生物硫醇雙光子熒光探針的制備方法，它包括如下步驟：

(1)將1mmol化合物1與1.2mmol 6-羥基萘醛(化合物2)在氮?dú)夥諊录又练磻?yīng)瓶中，然后將0.5mL冰醋酸和30mL乙醇一次加至上述反應(yīng)器中，于氮?dú)夥諊略诩訜峄亓?h后，點(diǎn)板檢測(cè)反應(yīng)完全，反應(yīng)液冷至室溫，析出沉淀，抽濾，得到粗產(chǎn)品，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得到紅色產(chǎn)物NBI；

(2)將1mol化合物NBI和0.5mL三乙胺溶解在干燥的20mL二氯甲烷中，冰浴條件下，逐滴滴入3mmol丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，冰浴下反應(yīng)1h后，室溫反應(yīng)2h停止反應(yīng)，有機(jī)相用二次水洗三次，干燥，抽濾，減壓濃縮，粗產(chǎn)品通過(guò)柱色譜分離即得到目標(biāo)探針化合物。

所述步驟(2)中柱色譜分離提純所用洗脫劑配比為CH₂Cl₂:MeOH＝25:1。

本發(fā)明探針?lè)肿拥暮铣陕肪€如下所示：

本發(fā)明所述的雙光子熒光探針的應(yīng)用，該熒光探針可用于水環(huán)境和生物體系中生物硫醇的傳感檢測(cè)；所述傳感檢測(cè)包含熒光檢測(cè)、細(xì)胞成像和組織成像檢測(cè)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：(1)該探針的合成方法簡(jiǎn)單，識(shí)別硫醇迅速；(2)本發(fā)明通過(guò)熒光光譜檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了生物硫醇的定量檢測(cè)，且不受性質(zhì)相似的硫化氫分子的干擾；(3)該探針具有雙光子熒光性質(zhì)，能夠?qū)崿F(xiàn)生物細(xì)胞內(nèi)的雙光子成像以及肝臟和腫瘤組織成像。因此，本發(fā)明是一種簡(jiǎn)單，快速，靈敏的生物硫醇特異性檢測(cè)試劑，在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。其性能將在實(shí)施例中結(jié)合附圖給予詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1為探針ANBI的核磁氫譜圖。

圖2為探針ANBI的PBS緩沖液的溶液加入多種硫醇的熒光發(fā)射圖譜。

圖3為探針ANBI的PBS緩沖液的溶液加入多種分析物的熒光發(fā)射柱狀圖譜。

圖4為探針ANBI的PBS緩沖液的溶液隨半胱氨酸的加入量逐漸增大的熒光變化圖。

圖5為探針ANBI在HeLa細(xì)胞內(nèi)的單光子熒光成像圖和雙光子熒光成像圖。a-d為HeLa細(xì)胞用5.0μM探針ANBI孵育后的成像圖，e-h為HeLa細(xì)胞先用500μM N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)孵育，再用5.0μM探針ANBI孵育后的成像圖。其中，a，e為明場(chǎng)下細(xì)胞圖，b，f為單光子激發(fā)波長(zhǎng)(λ_ex＝488nm)下細(xì)胞成像圖，c為a-b的疊加圖，g為e-f的疊加圖，d，h為雙光子激發(fā)波長(zhǎng)(λ_ex＝780nm)下的細(xì)胞成像圖。

圖6為探針ANBI在小鼠肝臟中的單光子熒光成像圖和雙光子熒光成像圖，其中(a)單光子熒光成像圖；(b)單光子熒光成像三維圖；(c)雙光子熒光成像圖；(d)雙光子熒光成像三維圖。

圖7為探針ANBI在腫瘤中的單光子熒光成像圖和雙光子熒光成像圖，其中(a)單光子熒光成像圖；(b)單光子熒光成像三維圖；(c)雙光子熒光成像圖；(d)雙光子熒光成像三維圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，實(shí)施例中化合物的號(hào)碼對(duì)于上述方案中化合物的號(hào)碼。

實(shí)施例1

探針化合物ABNI的合成：

將化合物1(1mmol，0.172g)與化合物2(1.2mmol，0.421g)在氮?dú)夥諊录又练磻?yīng)瓶中，然后將冰醋酸(0.5mL)和乙醇(30mL)一次加至上述反應(yīng)器中，于氮?dú)夥諊略诩訜峄亓?h后，點(diǎn)板檢測(cè)反應(yīng)完全。反應(yīng)液冷至室溫，析出沉淀，抽濾，得到粗產(chǎn)品，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得到紅色產(chǎn)物NBI，產(chǎn)率為75％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝10.45(s,1H,-OH),8.63(d,J＝13.7Hz,2H),8.46(d,J＝8.4Hz,1H),8.31(d,J＝8.9Hz,2H),8.23(d,J＝8.1Hz,1H),8.12(d,J＝9.0Hz,1H),7.94(d,J＝8.8Hz,1H),7.89(d,J＝8.8Hz,1H),7.83(t,J＝7.2Hz,1H),7.74(dd,J＝15.6and 7.8Hz,2H),7.28-7.19(m,2H),4.30(s,3H),2.06(s,6H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝182.72,159.09,153.06,139.97,138.32,137.79,135.12,133.59,131.94,131.30,130.51,129.83,128.88,127.72,127.68,12.53,127.16,124.96,123.64,120.37,113.75,111.51,109.99,54.09,35.39,25.75.HRMS:m/z[M+H]⁺calcd for[C₂₇H₂₄NO]⁺378.1858,found 378.1858.

將化合物NBI(1mol)和0.5mL三乙胺溶解在干燥的二氯甲烷(20mL)中。冰浴條件下，逐滴滴入丙烯酰氯(3mmol)的二氯甲烷溶液。冰浴下反應(yīng)1h后，室溫反應(yīng)2h停止反應(yīng)。有機(jī)相用二次水洗三次，干燥，抽濾，減壓濃縮。粗產(chǎn)品通過(guò)柱色譜層析提純，洗脫劑為CH₂Cl₂:MeOH＝25:1，得到暗紅色固體即為目標(biāo)探針產(chǎn)物ANBI，產(chǎn)率41％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.81(s,1H),8.69(d,J＝16.5Hz,1H),8.47(t,J＝8.3Hz,2H),8.33(d,J＝8.9Hz,1H),8.25(d,J＝8.2Hz,1H),8.15(dd,J＝8.9,5.1Hz,3H),7.82-7.90(m,3H),7.76(t,J＝7.6Hz,1H),7.54(dd,J＝8.8and 2.3Hz,1H),6.63(dd,J＝17.3and 1.4Hz,1H),6.52(dd,J＝17.3and 10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝10.2and 1.4Hz,1H),4.34(s,3H),2.07(s,6H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ182.93,164.66,151.98,150.62,139.94,138.77,135.95,134.65,134.04,133.76,132.76,131.40,131.26,130.53,129.10,129.95,127.99,127.77,127.11,125.40,123.76,123.38,119.52,113.87,113.59,54.37,35.67,25.50.HRMS:m/z[M+H]⁺calcd for[C₃₀H₂₆NO]⁺432.1964,found 432.1957.

實(shí)施例2

探針ANBI在PBS緩沖溶液中的光譜測(cè)試：

取實(shí)施例1制備的探針ANBI溶于DMSO中，制成1mM的儲(chǔ)備液。從儲(chǔ)備液中取出30μL加入到5mL的離心管當(dāng)中，用PBS緩沖溶液(0.1mol/L，pH＝7.2)稀釋至3mL，加入不同分析物Cys、GSH、H₂S，在激發(fā)波長(zhǎng)470nm下測(cè)量其熒光性質(zhì)，結(jié)果如圖2所示。圖2可以看出，對(duì)于Cys、GSH生物硫醇能夠引起熒光的增強(qiáng)，而H₂S只能使熒光淬滅完全。這表明該探針的選擇性較好，能夠抵抗硫化氫對(duì)生物硫醇檢測(cè)的干擾。

為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明探針的選擇性和抗干擾能力，本發(fā)明還研究了該探針在加入多種不同分析物(Cys,GSH,Alanine,Arginine,Aspartic acid,Glutamic acid,Histidine,Phenylalanine,Serine,Threonine,Tryptophan and Valine,K⁺,Ca²⁺,Na⁺,Fe³⁺,Zn²⁺,H₂O₂)和不同當(dāng)量的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)的熒光性質(zhì)，結(jié)果如圖3和圖4所示。圖3表示探針與多種被檢測(cè)物在最大發(fā)射波長(zhǎng)590nm處強(qiáng)度，由結(jié)果可以看出，該探針在多種被檢測(cè)物中的選擇性和抗干擾能力均較好。圖4顯示，隨著半胱氨酸加入量的增加，熒光逐漸增強(qiáng)，因而該探針可以實(shí)現(xiàn)半胱氨酸的定量檢測(cè)，最低檢測(cè)限可達(dá)到0.38μM。

實(shí)施例3

細(xì)胞內(nèi)熒光成像測(cè)試：

在37℃條件下，將HeLa細(xì)胞在加入5.0μM的探針ANBI的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)20min，PBS緩沖溶液洗滌三次后，置于共聚焦熒光顯微鏡下分別進(jìn)行單光子(λ_ex＝488nm)熒光成像和雙光子(λ_ex＝780nm)熒光成像，結(jié)果如圖5a-d所示。其中，對(duì)比實(shí)驗(yàn)是將HeLa細(xì)胞先用500μM N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)孵育20min，再加入5.0μM的探針ANBI的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)20min，PBS緩沖溶液洗滌三次后，置于共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行單光子(λ_ex＝488nm)熒光成像和雙光子(λ_ex＝780nm)熒光成像。

圖5中，a-d為HeLa細(xì)胞用5.0μM探針ANBI孵育后的成像圖，e-h為HeLa細(xì)胞先用500μM N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)孵育，再用5.0μM探針ANBI孵育后的成像圖。其中，a，e為明場(chǎng)下細(xì)胞圖，b，f為單光子激發(fā)波長(zhǎng)(λ_ex＝488nm)下細(xì)胞成像圖，c為a-b的疊加圖，g為e-f的疊加圖，d，h為雙光子激發(fā)波長(zhǎng)(λ_ex＝780nm)下的細(xì)胞成像圖。圖5的紅色熒光顯示，探針ANBI滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，在單雙光子激發(fā)下都呈現(xiàn)紅色熒光。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，利用NEM處理生物細(xì)胞HeLa即是將細(xì)胞內(nèi)生物硫醇進(jìn)行清除的過(guò)程，然后再加入探針ANBI之后，通過(guò)圖5中的結(jié)果可以看出無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)光，這充分說(shuō)明生物硫醇是引起細(xì)胞發(fā)光的唯一原因，因而可以利用該探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物硫醇進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。

實(shí)施例4

組織成像實(shí)驗(yàn)：

用20μM的探針ANBI孵育小鼠肝臟和腫瘤組織20min，PBS緩沖溶液洗滌三次后，置于共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行單光子(λ_ex＝488nm)熒光成像和雙光子(λ_ex＝780nm)熒光成像。圖6為小鼠肝臟成像，圖7為腫瘤組織成像，其中(a)單光子熒光成像圖；(b)單光子熒光成像三維圖；(c)雙光子熒光成像圖；(d)雙光子熒光成像三維圖。圖5-6的熒光成像圖顯示，探針可以達(dá)到肝臟的85μm深度，即使對(duì)于難于滲透的腫瘤細(xì)胞，依然能達(dá)到50μm的深度。