本發(fā)明涉及一種提高胞內(nèi)氧化型輔酶I含量的方法，屬于輔因子工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

輔酶I，又稱煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide)，是一種傳遞電子(氫離子)的輔酶，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)顯示NADH/NAD⁺作為重要的輔因子全程參與微生物細(xì)胞內(nèi)的740多個(gè)代謝反應(yīng)，包括氧化還原反應(yīng)、能量代謝過(guò)程、調(diào)控基因表達(dá)、維持Ca⁺穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老等，尤其在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。NAD⁺能為代謝網(wǎng)絡(luò)中各種反應(yīng)提供能量和氧化還原力，其濃度可以調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)途徑，增大代謝流通量，提高氧化還原反應(yīng)中生物催化效率和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率等。

NAD⁺生物合成主要有兩條途徑：從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑(圖1)。從頭合成途徑以天冬氨酸或色氨酸為前體，通過(guò)一系列步驟生成喹啉酸(QA)，接著經(jīng)基因nadC編碼的喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化生成煙酸單核苷酸(NaMN)，再由基因nadD編碼的腺苷轉(zhuǎn)移酶催化腺苷化生成煙酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)，最后在基因nadE編碼的NAD⁺合成酶催化下氨基化成NAD⁺。補(bǔ)救途徑是基因pncA編碼的煙酰胺酶水解煙酰胺生成煙酸，再經(jīng)基因pncB編碼的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化煙酸生成煙酸單核苷酸(NaMN)，最后生成NAD⁺。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)大量存在NAD⁺前體煙酰胺(NAM)、煙酸(NA)時(shí)，補(bǔ)救途徑對(duì)胞內(nèi)NAD⁺的含量起到重要的作用。

目前，提高細(xì)胞內(nèi)NAD⁺含量主要從代謝工程和生化工程兩個(gè)方向上考慮，其中包括：過(guò)量表達(dá)NADH代謝相關(guān)酶、缺失NADH競(jìng)爭(zhēng)途徑、引入NADH外源代謝途徑、添加外源電子受體、不同氧化還原態(tài)底物及NAD合成前體物、調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境和氧化還原電勢(shì)等。

大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單且生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于科研工作中。然而，其細(xì)胞內(nèi)的輔酶含量較低，無(wú)法起到增強(qiáng)相關(guān)催化反應(yīng)效率的作用。因此，通過(guò)基因工程的手段增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NAD⁺含量對(duì)于提高胞內(nèi)氧化型輔酶I的含量具有重要作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種共表達(dá)pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中至少兩個(gè)基因的重組大腸桿菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌以E.coli BL21為宿主。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌是共表達(dá)pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中的任意三種基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌共表達(dá)pncA、nadD、nadE基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌共表達(dá)pncB、nadE、nadD基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌共表達(dá)nadC、nadD、nadE基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌共表達(dá)pncB、nadE、pncA基因。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，是以pET-21a為載體，在大腸桿菌E.coli BL21中表達(dá)pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中的至少2個(gè)基因。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種提高重組大腸桿菌胞內(nèi)氧化型輔酶I含量的方法，所述方法是將所述重組大腸桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30～37℃培養(yǎng)8～72h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述接種是按體積比1％的接種量進(jìn)行接種。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有終濃度1～100mg/L的色氨酸、天冬氨酸、喹啉酸、煙酸、煙酰胺中的至少一種。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是在接種后菌體OD₆₀₀達(dá)到0.6-2.0時(shí)，加入終濃度為0.1-10mM的IPTG，16-37℃誘導(dǎo)8-48h。

本發(fā)明還提供所述重組大腸桿菌在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域生產(chǎn)氧化型輔酶I方面的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述方法在生產(chǎn)含氧化型輔酶I的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明通過(guò)采用共表達(dá)多基因的組合，并且在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的前體物質(zhì)，將多基因與多種類的前體物質(zhì)結(jié)合，擴(kuò)大代謝網(wǎng)絡(luò)通量，大腸桿菌胞內(nèi)的輔酶含量在經(jīng)過(guò)代謝工程和生化工程兩個(gè)手段的調(diào)控后可達(dá)到20-30μmol/g DCW。相比出發(fā)菌株BL21/pET-21a提高了近10倍，NAD⁺生成的效率明顯提高，大腸桿菌胞內(nèi)NAD⁺的含量也進(jìn)一步增加。

附圖說(shuō)明

圖1為輔酶NAD⁺合成途徑示意圖，其中NAD⁺化學(xué)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)中間體(R：核糖體、P：磷酸、Ad：腺嘌呤)化合物的縮寫為：L-Trp：L-色氨酸；Asp：天冬氨酸；QA：喹啉酸；NA：煙酸；NaMN：煙酸單核苷酸；NaAD：煙酸腺嘌呤二核苷酸；NAD⁺：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAM：煙酰胺；NR：煙酰胺核苷；NMN：煙酰胺單核苷酸。

具體實(shí)施方式

發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 10g/L蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2，以去離子水配制，使用前加入氨芐青霉素100μg/mL。

發(fā)酵條件：初始溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，菌體OD₆₀₀達(dá)到0.6-2.0時(shí)，加入終濃度為0.1-10mM的IPTG，16-37℃誘導(dǎo)8-48h，添加前體物質(zhì)的濃度為1-100mg/L。

實(shí)施例1

(1)構(gòu)建過(guò)量表達(dá)基因pncA、pncB、nadC、nadD、nadE的表達(dá)質(zhì)粒：

根據(jù)NCBI上報(bào)道的大腸桿菌中基因pncA的序列(Gene ID:946276)，基因pncB的序列(Gene ID:8182321)，基因nadC的序列(Gene ID:948869)，基因nadD的序列(Gene ID:8180157)，基因nadE的序列(Gene ID:8179982)設(shè)計(jì)上下游引物，并合成帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)的引物：

pncA-F:GGATCCATGCCCCCTCGCGCCCTGTT

pncA-R：CCGCTCGAGTTACCCCTGTGTCTCTTCCCAGTCTG

pncB-F:CGCGGATCCATGACACAATTCGCTTCT

pncB-R:CCGCTCGAGTTAACTGGCTTTTTTAATATGCGG

nadC-F:GGATCCATGCCGCCTCGCCGCTATAACC

nadC-R:CTCGAGTTAGCGAAAACGCATTGAAAGGTCGAGTG

nadD-F:CGCGGATCCATGAAATCTTTACAGGCTC

nadD-R:CCGCTCGAGTCAGCGATACAAGCCTTGTT

nadE-F:CGCGGATCCATGACATTGCAACAACAAAT

nadE-R:CCGCTCGAGTTACTTTTTCCAGAAATCATCG

提取E.coli BL21(DE3)的基因組，以其為模板，PCR克隆擴(kuò)增得到目的基因pncA、pncB、nadC、nadD和nadE片段，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s；55℃退火30s；72℃分別延伸42s、80s、58s、42s、55s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

將目的基因產(chǎn)物純化后，連接到pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。再將載體pET-21a和T載上的目的基因用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切90min，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的基因片段和質(zhì)粒骨架，在T4連接酶作用下16℃連接過(guò)夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109克隆宿主感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子。

(2)將質(zhì)粒pET-21a-pncA、pET-21a-pncB、pET-21a-nadC、pET-21a-nadD、pET-21a-nadE導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，得到重組菌株。

(3)對(duì)重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為按體積的1％，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1-10mM，測(cè)定其胞內(nèi)的NAD⁺含量(表1)。其中效果比較明顯的有：E.coli BL21/pET-21a-pncB和E.coli BL21/pET-21a-nadE。其胞內(nèi)的輔酶含量分別達(dá)到12.475μmol/g DCW和13.398μmol/g DCW，與對(duì)照相比提高了3倍和3.3倍。

表1過(guò)表達(dá)單個(gè)基因重組菌株生長(zhǎng)情況及NAD⁺含量

實(shí)施例2

(1)構(gòu)建共表達(dá)多基因的大腸桿菌重組菌株：

根據(jù)已經(jīng)構(gòu)建成功的質(zhì)粒pET-21a-pncA、pET-21a-pncB、pET-21a-nadC、pET-21a-nadD、pET-21a-nadE設(shè)計(jì)上下游引物，并且在兩個(gè)多個(gè)基因之間加上SD-AS序列(AGAAGGAGATATACA)，采用重疊延伸PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因在同一個(gè)質(zhì)粒上的串聯(lián)表達(dá)。

合成帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)的引物，以質(zhì)粒pET-21a-pncA、pET-21a-pncB、pET-21a-nadC、pET-21a-nadD、pET-21a-nadE為模板，重疊延伸PCR克隆擴(kuò)增得到目的基因pncA-pncB、pncA-nadD、pncA-nadE、pncB-nadD、pncB-nadE、nadD-nadE、nadC-nadD、nadC-nadE以及pncA-pncB-nadD、pncA-nadD-nadE、pncB-nadD-nadE、nadC-nadD-nadE、pncA-pncB-nadE片段，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s；60℃退火15s；72℃分別延伸112s、80s、90s、112s、125s、90s、95s、105s，以及155s、130s、165s、145s、165s，15個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，再加入上下游引物各1μL，繼續(xù)上述條件，15個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，12℃30min。

將目的基因產(chǎn)物純化后，連接到pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。再將載體pET-21a和T載上的目的基因用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切90min，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的基因片段和質(zhì)粒骨架，在T4連接酶作用下16℃連接過(guò)夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109克隆宿主感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子。

(2)將以上所得到的質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，得到多基因共表達(dá)的重組菌株

(3)對(duì)多基因共表達(dá)重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，先用LB氨芐青霉素平板活化重組菌株，挑取單菌落接入5mL含有終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB試管中，培養(yǎng)12h后再按1％的接種量轉(zhuǎn)接于50mL的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-2.0時(shí)添加終濃度為0.1-10mmol/L的IPTG，16-37℃，200r/min誘導(dǎo)，蛋白表達(dá)正常后進(jìn)行胞內(nèi)NAD⁺含量的測(cè)定(表2)。

表2多基因共表達(dá)重組菌株胞內(nèi)NAD⁺含量

多基因共表達(dá)重組菌株中，E.coli BL21/pET-21a-nadE-pncB、E.coli BL21/pET-21a-pncB-nadE-nadD和E.coli BL21/pET-21a-pncB-nadE-pncA胞內(nèi)NAD⁺含量能達(dá)到18μmol/g DCW。相比出發(fā)菌株E.coli BL21/pET-21a提高了近5倍。

實(shí)施例3

(1)配制功能因子促進(jìn)劑：將色氨酸、天冬氨酸、喹啉酸、煙酸、煙酰胺分別用滅菌后的超純水溶解，配制為終濃度100mg/L的溶液。

(2)對(duì)初始菌株E.coli BL21/pET-21a進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用50ml搖瓶有氧發(fā)酵。按1％接種量從凍存管里接入5mL的LB試管中，同時(shí)接入終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素，培養(yǎng)12h后再按1％的接種量轉(zhuǎn)接于50mL的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加終濃度為40mg/L的功能因子促進(jìn)劑，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-2.0時(shí)添加終濃度為0.1-10mmol/L的IPTG，16-37℃，200r/min誘導(dǎo)。

3、測(cè)定添加不同前體物質(zhì)培養(yǎng)后的初始菌株E.coli BL21/pET-21a胞內(nèi)NAD⁺含量。結(jié)果如表3所示，其中添加了喹啉酸、煙酸及煙酰胺后對(duì)胞內(nèi)輔酶的生成量促進(jìn)作用較大，相比空白對(duì)照組，分別提高了近64％、105％和67％。

表3添加不同前體物質(zhì)后E.coli BL21/pET-21a胞內(nèi)NAD⁺的含量

實(shí)施例4

(1)根據(jù)實(shí)施例3的方法配制功能因子促進(jìn)劑。

(2)對(duì)多基因共表達(dá)重組菌株(實(shí)施例2制備的重組菌)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，先用LB氨芐青霉素平板活化重組菌株，挑取單菌落接入5mL含有終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB試管中，培養(yǎng)12h后再按1％的接種量轉(zhuǎn)接于50mL的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加終濃度為1-100mg/L的前體物質(zhì)，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-2.0時(shí)添加終濃度為0.1-10mmol/L的IPTG，16-37℃，200r/min誘導(dǎo)。

(3)收集發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，組合共表達(dá)的關(guān)鍵限速酶酶正常表達(dá)后進(jìn)行胞內(nèi)NAD⁺含量的測(cè)定，結(jié)果如表4所示，添加了前體物質(zhì)的共表達(dá)重組菌株胞內(nèi)的輔酶含量均有所提高。其中效果最為明顯的是E.coli BL21/pET-21a-nadE-pncB和E.coliBL21/pET-21a-pncB-nadE-pncA在添加煙酸后，NAD⁺含量可達(dá)到近32μmol/g DCW。

表4多基因共表達(dá)的重組菌株組合不同的前體物質(zhì)對(duì)胞內(nèi)NAD⁺含量的影響

本發(fā)明配制0～100mg/L的功能因子促進(jìn)劑，并將其用于重組大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果顯示，均能有效促進(jìn)胞內(nèi)NAD⁺的含量，雙基因共表達(dá)組合中，喹啉酸對(duì)E.coli BL21/pET-21a-nadC-nadD和E.coli BL21/pET-21a-nadC-nadE的促進(jìn)作用最大，使其胞內(nèi)氧化型輔酶含量分別達(dá)到15.7μmol/g DCW和19.9μmol/g DCW。煙酸對(duì)E.coli BL21/pET-21a-pncB-nadE和E.coli BL21/pET-21a-nadE-pncB胞內(nèi)輔酶含量提高幅度明顯，分別可達(dá)到30.6μmol/g DCW和32.5μmol/g DCW。煙酰胺對(duì)E.coli BL21/pET-21a-pncA-nadE促進(jìn)作用較大，胞內(nèi)輔酶含量達(dá)24.8μmol/g DCW。

三個(gè)基因共表達(dá)組合中，煙酰胺對(duì)E.coli BL21/pET-21a-nadC-nadD-nadE的提高幅度較大，其他菌株均是煙酸起到了更明顯的提高輔酶含量的作用。

所有效果明顯的重組菌株與未添加前體物質(zhì)相比，均提高了56％以上。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。