本發(fā)明涉及的是一種微生物發(fā)酵工藝，尤其涉及的是一種利用瘤胃液生產(chǎn)維生素B12的稻草發(fā)酵培養(yǎng)基及其方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
瘤胃是反芻動(dòng)物獨(dú)特的消化器官，瘤胃內(nèi)營養(yǎng)豐富，溫度適宜，且瘤胃液中含有大量的微生物，因此反芻動(dòng)物瘤胃是一個(gè)天然的發(fā)酵罐。瘤胃微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的分解和合成作用稱為瘤胃發(fā)酵，產(chǎn)物主要是氨基酸、NH3、揮發(fā)性脂肪酸、B族維生素等，瘤胃微生物依靠瘤胃內(nèi)飼料的營養(yǎng)物質(zhì)生存和繁殖，而反芻動(dòng)物又依靠瘤胃微生物的發(fā)酵物進(jìn)行生存。反芻動(dòng)物與瘤胃微生物之間形成密切的共生關(guān)系，而瘤胃微生物相互之間相互制約，維持著微生物區(qū)系生態(tài)系統(tǒng)的協(xié)調(diào)(司振書,江成,瘤胃微生物對(duì)纖維素的降解及其應(yīng)用,微生物學(xué)雜志,2003)。瘤胃微生物主要有厭氧細(xì)菌、原蟲、真菌等。通過微生物純培養(yǎng)，可以分離得到純種菌株，并可以獲得其生長(zhǎng)代謝的詳細(xì)資料，然而純培養(yǎng)并沒有考慮微生物群居生活方式及相互影響的重要性。一般而言，降解有機(jī)物質(zhì)，尤其是植物細(xì)胞壁成分，如纖維素，需要微生物間的相互作用，其降解過程是由高度分化的專性微生物群對(duì)底物協(xié)同降解的過程。菌種之間的協(xié)同作用和相互依賴程度并不相同，它們可以從極簡(jiǎn)單的養(yǎng)分的交差，如維生素、碳源和能源到極特殊的完全依賴，電子傳遞就是瘤胃微生物相互作用的典型例子。
維生素B12又稱為鈷胺素或氰鈷素，是一種由含鈷的卟啉類化合物組成的B族維生素。自然界中的維生素B12都是由微生物合成的，高等動(dòng)植物自身不能合成。維生素B12是幾種變位酶的輔酶，常以輔酶的形式參與多種代謝過程，促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的合成，促進(jìn)紅細(xì)胞的發(fā)育和成熟，促進(jìn)脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)的代謝，維持神經(jīng)系統(tǒng)功能的健全，臨床上可以用于預(yù)防和治療惡性貧血、末梢神經(jīng)炎、脊髓炎等(王華等,維生素B12功能及營養(yǎng)作用研究,中國食物與營養(yǎng),2007)。在飼料工業(yè)方面，大多數(shù)動(dòng)物的植物性飼料中不含維生素B12，其生長(zhǎng)發(fā)育所需的維生素B12，一方面來源于消化道中的微生物的合成，另一方面來源于外界的添加。豬、雞等非反芻動(dòng)物缺乏維生素B12主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)發(fā)育停滯、貧血、繁殖率降低等。飼料維生素B12能預(yù)防懷孕母豬貧血，促進(jìn)家禽家畜，特別是幼禽幼畜的生長(zhǎng)發(fā)育，提高飼料蛋白的利用率，預(yù)防和治療由于維生素B12缺乏引起的非反芻動(dòng)物的貧血和生長(zhǎng)發(fā)育不良，缺鈷地區(qū)反芻動(dòng)物的地方性消瘦病等。
目前在工業(yè)制造中，微生物發(fā)酵法是獲得微生素B12的主要途徑，且大部分產(chǎn)品被用于動(dòng)物飼料添加劑。瘤胃微生物有很強(qiáng)的分解纖維素的能力(李莉,侯先志,瘤胃纖維素分解菌的研究進(jìn)展,黃牛雜志,2002)，而且能合成維生素B12。植物秸稈資源豐富，目前不能被充分利用，不但造成資源浪費(fèi)，還對(duì)環(huán)境造成一定的污染。目前，可利用植物秸稈等資源進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素等，將植物秸稈變廢為寶，實(shí)現(xiàn)廢物利用，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但是，目前，利用植物秸稈生產(chǎn)維生素時(shí)，收率較低，而目前尚無利用植物秸稈定向生產(chǎn)維生素B12的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種利用瘤胃液生產(chǎn)維生素B12的稻草發(fā)酵培養(yǎng)基及其方法和應(yīng)用，以提供一種利用稻草等廢棄物定向生產(chǎn)維生素B12的方法，提高維生素B12的得率。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明提供了一種利用瘤胃液生產(chǎn)維生素B12的稻草發(fā)酵培養(yǎng)基，所述稻草發(fā)酵培養(yǎng)基包括干稻草粉和營養(yǎng)鹽溶液，所述營養(yǎng)鹽溶液的配方包括：尿素為50g/L，ZnCl2·2H2O為0.25g/L，MnCl2·4H2O為0.04g/L，CoCl2·6H2O為0.5g/L，NH4HCO3為5g/L，NaHCO3為0.5g/L，Na2HPO4·12H2O為0.45g/L，KH2PO4為0.32g/L，MgSO4·7H2O為0.06g/L。
進(jìn)一步地，每10L營養(yǎng)鹽溶液中，干稻草粉的添加量為6kg。
本發(fā)明提供了一種利用上述稻草發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)維生素B12的方法，包括以下步驟：
(1)將稻草干燥后粉碎，獲得干稻草粉；
(2)按配方進(jìn)行稱取，制備營養(yǎng)鹽溶液，所述配方包括：尿素為50g/L，ZnCl2·2H2O為0.25g/L，MnCl2·4H2O為0.04g/L，CoCl2·6H2O為0.5g/L，NH4HCO3為5g/L，NaHCO3為0.5g/L，Na2HPO4·12H2O為0.45g/L，KH2PO4為0.32g/L，MgSO4·7H2O為0.06g/L：
(3)將干稻草粉與營養(yǎng)鹽溶液混合，獲得稻草發(fā)酵培養(yǎng)基；
(4)取健康牛的瘤胃液，加入稻草發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，所述厭氧發(fā)酵的條件為：溫度為38-39℃，發(fā)酵時(shí)間為168h，即制備獲得富含維生素B12的發(fā)酵基。
進(jìn)一步地，所述瘤胃液的制備方法，包括以下步驟：
Ⅰ)選擇1頭健康的皖北黃牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，禁食24h，禁水12h，無菌法安裝瘺管并術(shù)后護(hù)理；
Ⅱ)每次飼喂前向安裝瘺管的皖北黃牛瘤胃取內(nèi)容物，迅速攪拌并用四層紗布過濾，濾液保存于充滿二氧化碳的塑料瓶中，即得瘤胃液；此步操作要迅速，盡量減少瘤胃液與氧氣的接觸。
本發(fā)明還提供了一種飼料添加劑，所述飼料添加劑為利用上述稻草發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)維生素B12的方法制備獲得的富含維生素B12的發(fā)酵產(chǎn)物，該飼料添加劑中不僅還有豐富的維生素B12還含有多種益生菌，將其直接添加在畜禽飼料中，可以作為生血?jiǎng)?，預(yù)防和治療畜禽貧血癥，也可以促進(jìn)畜禽，特別是幼禽幼畜的生長(zhǎng)發(fā)育，提高飼料蛋白的利用率，預(yù)防和治療由于維生素B12缺乏引起的非反芻動(dòng)物的貧血和生長(zhǎng)發(fā)育不良等。
本發(fā)明還提供了上述飼料添加劑在預(yù)防和治療畜禽貧血病中的應(yīng)用。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種利用瘤胃液生產(chǎn)維生素B12的稻草發(fā)酵培養(yǎng)基及其方法和應(yīng)用，該發(fā)明利用反芻動(dòng)物瘤胃的生理特點(diǎn)(即其中的微生物菌群能夠消化分解纖維素，轉(zhuǎn)化為能夠被宿主動(dòng)物利用的糖類及維生素等物質(zhì)),利用瘤胃液中的微生物菌群來發(fā)酵稻草粉，將其轉(zhuǎn)化為富含維生素B12的發(fā)酵飼料。與維生素B12的傳統(tǒng)生產(chǎn)相比，本發(fā)明生產(chǎn)的維生素B12不需要提純，可以在發(fā)酵飼料中直接使用，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。同時(shí)該發(fā)明將稻草秸稈轉(zhuǎn)化為可被動(dòng)物直接利用的營養(yǎng)物質(zhì)，原料來源廣泛，變廢為寶，降低了生產(chǎn)成本，保護(hù)了環(huán)境。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
1、材料
本實(shí)施例所用方法如無特別說明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。
2、方法
2.1稻草粉的制備
將稻草干燥后，獲得干稻草，將干稻草粉碎，過40目篩，獲得稻草粉。
2.2營養(yǎng)鹽溶液的制備
分別稱取尿素500g，ZnCl2·2H2O為2.5g；MnCl2·4H2O為0.4g，CoCl2·6H2O為5.0g，NH4HCO3為50g，NaHCO3為5.0g,Na2HPO4·12H2O為4.45g，KH2PO4為3.2g MgSO4·7H2O為0.6g，溶于10L蒸餾水中，得營養(yǎng)鹽溶液。
2.3稻草發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
稱取稻草粉6kg，與10L營養(yǎng)鹽溶液混合均勻，即得稻草發(fā)酵培養(yǎng)基。
2.4瘤胃液的制備
2.4.1選擇1頭健康的皖北黃牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，禁食24h，禁水12h，無菌法安裝瘺管并術(shù)后護(hù)理；
2.4.2每次飼喂前向安裝瘺管的皖北黃牛瘤胃取內(nèi)容物，迅速攪拌并用四層紗布過濾，濾液保存于充滿二氧化碳的塑料瓶中，即得瘤胃液；此步操作要迅速，盡量減少瘤胃液與氧氣的接觸。
2.5發(fā)酵反應(yīng)
抽取1L瘤胃液，與8kg稻草發(fā)酵培養(yǎng)基一同加入到10L的厭氧發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為38-39℃進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵168h后完成反應(yīng)，獲得發(fā)酵基。
3結(jié)果檢測(cè)
3.1維生素B12的含量測(cè)定：
按照紫外-可見分光光度法進(jìn)行測(cè)定，步驟包括：
3.1.1配置標(biāo)準(zhǔn)溶液：所述標(biāo)準(zhǔn)溶液維生素B12的含量為25μg/ml；
3.1.2配置樣品溶液：避光操作，精密稱取樣品0.02g，用少量的蒸餾水溶解，倒入500ml容量瓶，并定容至刻度線，搖勻，用0.45μm濾膜過濾。將空白液(純化水)與樣品液分別盛于1cm厚的石英比色皿中，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量其在361nm處的吸光值A(chǔ)樣，維生素B12的吸收系數(shù)按207計(jì)算，即得。
3.1.3計(jì)算：根據(jù)比爾定律，得出樣品的比吸光系數(shù)為：
E樣＝A樣/C樣*L＝A樣/0.0025
樣品中維生素B12的含量(質(zhì)量百分比)為：
維生素B12的含量％＝E樣/E標(biāo)×100％＝E樣/207×100％
3.2對(duì)照試驗(yàn)
在上述步驟2方法的基礎(chǔ)上，以步驟2所述方法為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中，用等體積的蒸餾水代替營養(yǎng)鹽溶液，其它條件同實(shí)驗(yàn)組。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下表1所示：
表1：鹽溶液對(duì)瘤胃液發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的影響設(shè)計(jì)表
發(fā)酵168h后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組發(fā)酵產(chǎn)物分別取樣，測(cè)定其維生素B12的含量。測(cè)定結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組維生素B12的含量為0.0321％，對(duì)照組維生素B12的含量為0.0084％。由測(cè)定結(jié)果可看出，本發(fā)明利用瘤胃液體外發(fā)酵稻草粉能產(chǎn)生大量的維生素B12，說明營養(yǎng)鹽溶液能顯著提高維生素B12的產(chǎn)量。
4、應(yīng)用
將步驟2所述方法制備獲得的發(fā)酵產(chǎn)物按照每頓飼料中添加10-20g的量加入母豬飼料中，對(duì)10頭具有貧血癥的妊娠母豬進(jìn)行飼喂，連續(xù)飼喂1個(gè)月后，檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)肛i血液中血紅蛋白含量是否達(dá)到正常妊娠母豬血液中血紅蛋白水平。結(jié)果證明，該發(fā)酵產(chǎn)物作為母豬飼料添加劑，對(duì)妊娠母豬的貧血癥具有一定療效，10頭試驗(yàn)?zāi)肛i中，有9頭母豬的血液中血紅蛋白含量達(dá)到正常妊娠母豬血液中血紅蛋白水平，貧血癥得到緩解。
本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物中富含大量維生素B12(0.0321％)，可直接作為畜禽的飼料添加劑添加至飼料中，具有預(yù)防和治療由于維生素B12缺乏引起的非反芻動(dòng)物的貧血和生長(zhǎng)發(fā)育不良，及生血等作用，可直接用于預(yù)防和治療妊娠母豬貧血癥，也可促進(jìn)家禽家畜，特別是幼禽幼畜的生長(zhǎng)發(fā)育。本發(fā)明利用發(fā)酵技術(shù)將稻草秸稈轉(zhuǎn)化為可被動(dòng)物直接利用的營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)物不需要提純即可直接作為飼料添加劑使用，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，該發(fā)酵產(chǎn)物中還含有豐富的益生菌，營養(yǎng)價(jià)值豐富，可提高飼料蛋白的利用率。利用稻草發(fā)酵，原料來源廣泛，將稻草變廢為寶，降低了生產(chǎn)成本，保護(hù)了環(huán)境。
以上為本發(fā)明一種詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，是以發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述的實(shí)施例。