本申請(qǐng)為國(guó)際申請(qǐng)日2010年3月30日、國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杙ct/fr2010/050596于2011年9月30日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段、申請(qǐng)?zhí)?01080014957.1、發(fā)明名稱“用于從淀粉植物的可溶部分獲得β-淀粉酶制劑的方法”的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及一種用于從來(lái)自淀粉工業(yè)的殘?jiān)@得β-淀粉酶制劑的方法。
背景技術(shù)：
：β-淀粉酶是從(α1→4)-連接的葡萄糖聚合物或低聚物的非還原端釋放麥芽糖單元的外水解酶，該反應(yīng)在遇到的第一個(gè)α1→6分支點(diǎn)處停止。在發(fā)芽(谷類種子人工發(fā)芽)期間，“糖化力”的主要組分(對(duì)應(yīng)于α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和脫支酶的結(jié)合活性)、以及從這種酶合劑(enzymecocktail)中分離的β-淀粉酶活性對(duì)于生產(chǎn)麥芽糖或產(chǎn)生自淀粉的其他可發(fā)酵糖而言是必需的。如此獲得的麥芽糖和其他可發(fā)酵糖旨在用于，例如，經(jīng)由酵母的乙醇發(fā)酵。因此，僅僅β-淀粉酶的糖化活性并用于大量的應(yīng)用中：-在面包制作中，-在麥芽工業(yè)中，-作為一種食品添加劑，或甚至作為一種“消化”劑，-用于生產(chǎn)麥芽糖和富含麥芽糖的糖漿(麥芽糖醇的前體和麥芽糖醇糖漿)，-用于生產(chǎn)增甜劑，-在藥學(xué)中，用于生產(chǎn)疫苗。谷類的β-淀粉酶、豆類的β-淀粉酶和塊莖的β-淀粉酶關(guān)于它們的酶活性都是類似的。然而，作為用于麥芽工業(yè)、或用于其他生物技術(shù)方法的β-淀粉酶的來(lái)源，一些淀粉植物優(yōu)先于其他淀粉植物的事實(shí)取決于它們的種子關(guān)于β-淀粉酶的豐富度，并且取決于從這些富含多種酶活性的介質(zhì)中可以分離它們的容易程度。因此，清楚地鑒定了兩種提取β-淀粉酶的來(lái)源。第一種提取“常規(guī)的”β-淀粉酶的來(lái)源是小麥、大麥或黑麥的胚乳，這是已知用于主要生產(chǎn)大量β-淀粉酶的一種來(lái)源。提取的第二種來(lái)源相應(yīng)于人工發(fā)芽的種子。因此特別是β-淀粉酶的一種人工富集是通過(guò)引起發(fā)芽來(lái)進(jìn)行的；然后使β-淀粉酶活性與其他淀粉酶和葡萄糖苷酶活性一起過(guò)表達(dá)。本發(fā)明涉及的
技術(shù)領(lǐng)域：
是提取的第一種來(lái)源，使得有可能像這樣更有效地以更大的量生產(chǎn)β-淀粉酶。本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
還涉及從淀粉工業(yè)中的植物加工所生成的殘余可溶部分，這些植物如小麥、大麥、黑麥、玉米、高粱、蕎麥、水稻、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、馬鈴薯、木薯、甘薯或魔芋。β-淀粉酶的第二種來(lái)源更具體地旨在用于制備酶合劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已經(jīng)接受未發(fā)芽的大麥、黑麥或小麥種子都是用于大規(guī)模商業(yè)制備β-淀粉酶的生物材料的選擇。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還已知，可以從未發(fā)芽的大麥、小麥或黑麥種子中提取的一半的β-淀粉酶可以容易地通過(guò)用水和鹽溶液提取以游離酶的形式獲得。另一半部分處于“結(jié)合”形式，對(duì)于它的提取需要添加還原劑或蛋白酶。不可以直接提取的另一種β-淀粉酶部分被稱為“潛在的”部分，也已經(jīng)被描述：為了從谷類種子中將它提取，洗滌劑是必需的。而且，根據(jù)預(yù)期的應(yīng)用將描述于現(xiàn)有技術(shù)中的β-淀粉酶提取方法進(jìn)行了調(diào)整。更具體地，旨在用于淀粉糖化和用于實(shí)驗(yàn)測(cè)試的那些淀粉酶是集中地從植物來(lái)源(如大豆、小麥、大麥、燕麥、黑麥和甘薯)中提取的，或者是通過(guò)微生物(如多粘芽孢桿菌等)來(lái)生產(chǎn)的。在由淀粉制備麥芽糖的情況下，第一種束縛是要盡可能限制其他低聚糖(如葡萄糖和麥芽三糖)的伴隨性產(chǎn)生。第二種束縛在于使用一種基本不含有真菌毒素、鹽和低分子量蛋白質(zhì)和肽(小于50kda并且優(yōu)選小于30kda)，并且不會(huì)引起過(guò)敏的(具體是通過(guò)在制備方法中重亞硫酸鹽的缺乏)的β-淀粉酶制劑，以允許富含麥芽糖的糖漿的迅速并且容易的純化(過(guò)濾、脫色、脫礦質(zhì))以及獲得更穩(wěn)定的糖漿。在麥芽工業(yè)中，例如，已知葡萄糖的存在通過(guò)抑制酵母生長(zhǎng)而干擾酵母它們的發(fā)酵。為了從麥芽糖糖漿商業(yè)生產(chǎn)麥芽糖醇，推薦的是要限制山梨醇和麥芽三糖醇的產(chǎn)生。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將優(yōu)選使得有可能獲得盡可能純的β-淀粉酶制劑的方法。當(dāng)然這些方法將具有昂貴的缺點(diǎn)。因此專利us3492203描述了從麩皮中提取純的β-淀粉酶用于制備富含麥芽糖的糖漿。因此避免了從麥芽(還含有難于從β-淀粉酶中分離的α-淀粉酶)開始的方法。那么麩皮具有較價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，并且作為培養(yǎng)基是可回收的，但是特別選擇它是因?yàn)樗恼純?yōu)勢(shì)的β-淀粉酶含量。該方法在于這種情況：在20℃與40℃之間的溫度下用水提取純的β-淀粉酶。然而，這一方法使得有可能從麩皮中僅僅有效地回收一半的可獲得的β-淀粉酶。而且，這種方法的主要缺點(diǎn)是它提供了一種細(xì)菌學(xué)不穩(wěn)定的β-淀粉酶：因此，生產(chǎn)的β-淀粉酶必須即時(shí)用于糖化淀粉。未進(jìn)行巴斯德滅菌。在專利us3801462中，β-淀粉酶是從甘薯，更具體地是從在銼磨甘薯的步驟之后的洗滌水中提取的。該實(shí)際的提取方法由在ph4-4.5的處理以及處于沉淀物形式的β-淀粉酶的回收組成。當(dāng)溫度被調(diào)整至55℃時(shí)提取率更高。然而，α-淀粉酶和麥芽糖酶活性仍污染這個(gè)富集β-淀粉酶的部分，這當(dāng)然使得獲得一種純的制劑變得復(fù)雜。專利us4675296提出了通過(guò)一種用水提取的方法(在5℃與50℃之間的溫度，持續(xù)5至70h)用于制備商品β-淀粉酶的一種方法，但是這需要從完整的或部分脫殼的大麥粒開始。所述方法是難于實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)樗腔谑褂霉攘５谋砻孀鳛橐环N會(huì)阻留所述谷粒的除了β-淀粉酶之外的所有組分的半透膜。然而，添加一種還原劑以促進(jìn)β-淀粉酶的釋放是有用的，所述還原劑是基于二氧化硫或硫酸的。而且，推薦用鹽、多元醇、糖或酸來(lái)穩(wěn)定該酶。在文獻(xiàn)中的其他方法推薦使用酶以促進(jìn)β-淀粉酶的提取。因此在國(guó)際專利申請(qǐng)wo02/062980中，在具有纖維素酶、半纖維素酶和β-葡聚糖酶活性的多種酶的復(fù)方合劑的存在的條件下，在一種水性介質(zhì)中從谷類提取了β-淀粉酶。所獲得的提取物必須被精細(xì)地純化以分離因此從反應(yīng)混合物中回收的β-淀粉酶。選擇的谷類是大麥和小麥。在還原條件下(含有亞硫酸鹽的水)，以明確定義的比例，在清楚設(shè)定的溫度和反應(yīng)時(shí)間范圍的條件下，并且在ph6.5下進(jìn)行提取。在us3769168中，富集β-淀粉酶的提取物的純化途徑是優(yōu)選的。用一種膨潤(rùn)土或高嶺土型吸附劑處理從麩皮、從大豆或從甘薯制備的粗提取物。吸附這些β-淀粉酶然后使用一種具有大于0.5μ的離子強(qiáng)度以及超過(guò)5的ph值的溶液洗脫。根據(jù)上述內(nèi)容，對(duì)于提供一種簡(jiǎn)單并且相對(duì)價(jià)廉的用于獲得β-淀粉酶制劑的方法仍有未滿足的需要，這些制劑具有足夠的質(zhì)量以允許特別是富含麥芽糖的糖漿的有效生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的目的是要滿足這一需要，并且值得稱道的是，在很多研究之后，本申請(qǐng)公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這一目標(biāo)可以針對(duì)所有預(yù)期而達(dá)到，只要使用來(lái)自淀粉工業(yè)的殘?jiān)?，特別是來(lái)自淀粉工業(yè)的液體殘?jiān)?也稱為“可溶部分”，雖然它們?nèi)匀缓胁煌叶鄻拥臍堄嗖蝗芪镔|(zhì)、顆粒以及膠體)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種從淀粉植物的組分(淀粉、蛋白質(zhì)以及纖維)的濕法提取期間產(chǎn)生的液體殘?jiān)?也稱為“可溶部分”，雖然它們還含有不同且多樣的殘余不溶物質(zhì)、顆粒以及膠體)獲得β-淀粉酶制劑的方法。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“淀粉植物”旨在表示在淀粉工業(yè)中能夠被加工的為了從其中提取淀粉的植物，如特別是玉米、馬鈴薯、甘薯、小麥、水稻、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、木薯、高粱、魔芋、黑麥、蕎麥以及大麥。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這些“淀粉植物”包括玉米、馬鈴薯、小麥、水稻、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、木薯、高粱、魔芋以及大麥。本發(fā)明還涉及所述方法，該方法包括可溶部分的澄清的一個(gè)第一步驟、以及然后任選地一個(gè)超濾的第二步驟從而獲得關(guān)于β-淀粉酶的純化的(從不含有它的鹽的意義而言)和/或濃縮的制劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及所述方法，該方法包括可溶部分的澄清的一個(gè)第一步驟、一個(gè)超濾的第二步驟、以及然后一個(gè)滲濾的第三步驟從而獲得關(guān)于β-淀粉酶的純化(從它被排除鹽的意義而言)且濃縮的制劑。最后，本發(fā)明使得有可能提供一種β-淀粉酶制劑，它具有一種質(zhì)量這樣有可能以與純化的β-淀粉酶相同的方式來(lái)使用它，特別是用于生產(chǎn)富含麥芽糖的糖漿。更具體地，用于獲得根據(jù)本發(fā)明的β-淀粉酶制劑的方法在于選擇是β-淀粉酶的來(lái)源的介質(zhì)、在于澄清所述介質(zhì)、進(jìn)而任選地在于進(jìn)行超濾以回收或甚至濃縮它們所包含的β-淀粉酶，這些介質(zhì)來(lái)自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥、甘薯以及馬鈴薯的可溶部分，優(yōu)選小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥以及馬鈴薯的可溶部分，更優(yōu)選小麥和大麥的可溶部分。優(yōu)選地，用于獲得根據(jù)本發(fā)明的β-淀粉酶制劑的方法在于選擇是β-淀粉酶的來(lái)源的介質(zhì)、在于澄清所述介質(zhì)、進(jìn)而在于進(jìn)行超濾和滲濾以回收并且濃縮它們所包含的β-淀粉酶，這些介質(zhì)來(lái)自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥、馬鈴薯以及甘薯的可溶部分，優(yōu)選小麥和大麥的可溶部分。在用于獲得根據(jù)本發(fā)明的β-淀粉酶制劑的方法中，不進(jìn)行ph值校正，該ph值天然地約為4.5。值得稱道的是，本申請(qǐng)公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自在除了發(fā)酵(作為氮源)的領(lǐng)域或動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)(與產(chǎn)生自小麥的產(chǎn)物混合)的領(lǐng)域之外的領(lǐng)域中的開發(fā)很差的淀粉工業(yè)的這些殘?jiān)梢詷?gòu)成一種選擇的介質(zhì)，用于以足以用于目標(biāo)應(yīng)用(例如制備富含麥芽糖的糖漿)的質(zhì)量水平來(lái)容易地提取感興趣的酶(并且更具體是β-淀粉酶)。根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于：a)淀粉植物的可溶部分是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥、甘薯以及馬鈴薯，優(yōu)選小麥、馬鈴薯、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻以及大麥，并且更優(yōu)選小麥和大麥的可溶部分，b)以這樣一種方式進(jìn)行所述可溶部分的澄清，以從中除去不溶物質(zhì)和膠體，c)任選地，以這樣一種方式進(jìn)行所述澄清的可溶部分的超濾，以獲得含有濃縮的β-淀粉酶和超濾滲透物的超濾滲余物，d)回收生成的濃縮的β-淀粉酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于：a)淀粉植物的可溶部分是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：小麥、馬鈴薯、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥以及甘薯，并且優(yōu)選小麥和大麥的可溶部分，b)以這樣一種方式進(jìn)行所述可溶部分的澄清，以從中特別地除去不溶物質(zhì)、膠體和微生物材料，c)以這樣一種方式進(jìn)行所述澄清的可溶部分的超濾，以獲得含有濃縮的β-淀粉酶和超濾滲透物的超濾滲余物(也稱為濾液)，d)進(jìn)行含有濃縮的β-淀粉酶的所述超濾滲余物的滲濾，e)回收生成的濃縮的β-淀粉酶。該超濾滲透物還可以與步驟b)的不溶物質(zhì)和膠體混合。因此根據(jù)本發(fā)明的方法只涉及物理提取技術(shù)的組合，例如過(guò)濾或離心技術(shù)，并且并不涉及任何酶提取步驟。因此不需要含有纖維素酶、半纖維素酶和/或β-葡聚糖酶的酶合劑。也不需要進(jìn)行ph校正。根據(jù)本發(fā)明的方法的第一步驟在于選擇淀粉植物的可溶部分，這些可溶部分來(lái)自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：小麥、馬鈴薯、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥以及甘薯，優(yōu)選小麥、馬鈴薯、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻以及大麥，并且更優(yōu)選小麥和大麥的可溶部分。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“可溶部分”旨在表示在淀粉植物的貴重組分的濕法提取期間所產(chǎn)生的殘留水。術(shù)語(yǔ)“貴重組分”在這里旨在表示在常規(guī)淀粉工業(yè)(并且特別是根據(jù)該淀粉植物)中開發(fā)的組分：淀粉(無(wú)論它是哪一種淀粉)、蛋白質(zhì)、纖維、膠質(zhì)。因此根據(jù)本發(fā)明的所述可溶部分不包括，或基本不包括這些貴重組分。出于這個(gè)原因，這些可溶部分也稱為殘留水或可替代地稱為液體殘余物。小麥的可溶部分或小麥可溶物，例如源自在濕小麥淀粉工業(yè)方法中，從淀粉的分離產(chǎn)生的小麥“b”淀粉分離流。b-淀粉或第二淀粉是實(shí)質(zhì)上由優(yōu)勢(shì)比例的小淀粉顆粒或損壞的顆粒組成的淀粉。根據(jù)本發(fā)明，由淀粉精煉水組成的小麥可溶物通常具有5％的干物質(zhì)，特別是小于8％的干物質(zhì)。通過(guò)回收在淀粉提取的開始從塊莖破碎所產(chǎn)生的可溶部分而獲得馬鈴薯、甘薯或木薯的可溶部分，或馬鈴薯、甘薯或木薯可溶物。豌豆的可溶部分或豌豆可溶物從豌豆浸漬水產(chǎn)生并且是在破碎和分離不同的豌豆組分之前回收的。蠶豆的可溶部分或蠶豆可溶物從蠶豆浸漬水產(chǎn)生并且是在破碎和分離不同的蠶豆組分之前回收的。馬蠶豆的可溶部分或馬蠶豆可溶物從馬蠶豆浸漬水產(chǎn)生并且是在破碎和分離不同的馬蠶豆組分之前回收的。水稻的可溶部分或水稻可溶物從水稻浸漬水產(chǎn)生并且是在破碎和分離不同的水稻組分之前回收的。大麥、黑麥或蕎麥的可溶部分，或大麥、黑麥或蕎麥可溶物從“b”-淀粉分離流產(chǎn)生，該分離流從在大麥淀粉工業(yè)方法中的淀粉分離產(chǎn)生。b-淀粉或第二淀粉是實(shí)質(zhì)上由優(yōu)勢(shì)比例的小淀粉顆?；驌p壞的顆粒組成的淀粉。這些可溶部分還含有高分子量蛋白質(zhì)，其中的一些具有感興趣的酶活性，但是它們與所有類型的不溶碎片(特別是纖維、痕量的淀粉、等)、膠體物質(zhì)(特別是磷脂、糖蛋白、胚乳的外層細(xì)胞(也稱為糊粉層)、等)以及微生物材料(微生物、細(xì)菌、等)相混雜。本申請(qǐng)公司確實(shí)面臨直到現(xiàn)在所描述的現(xiàn)有技術(shù)的偏見(jiàn)，這些可溶部分由本領(lǐng)域的技術(shù)人員僅僅使用在具有低附加值的兩個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域中：-一種在發(fā)酵中的氮源，在蛋白酶處理之后，已經(jīng)使殘余高分子量蛋白組分可被微生物同化，-家畜動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)源，并且進(jìn)一步與纖維物質(zhì)(例如在小麥可溶物的情況下的麩皮)一起添加。因此根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)步驟在于以這樣一種方式進(jìn)行所述可溶部分的澄清的步驟，以從中除去不溶物質(zhì)和膠體。通過(guò)在每次進(jìn)行了處理之后測(cè)量溶液的濁度來(lái)驗(yàn)證這一澄清步驟。濁度表示就使它渾濁的物質(zhì)而言的液體的含量。它是由吸收、散射和/或反射光的膠體顆粒引起的。使用實(shí)驗(yàn)室比濁計(jì)(或濁度計(jì))進(jìn)行濁度測(cè)量。這一方法被標(biāo)準(zhǔn)化(nfeniso7027)；使用福爾馬肼的兩個(gè)濁度測(cè)量單位作為標(biāo)準(zhǔn)品。-fnu(福爾馬肼濁度單位)，或nfu被使用于2001年12月20日的法令號(hào)2001-1220中。這種單位度量了在波長(zhǎng)860nm處在90°的角度的濁度。-fau(福爾馬肼衰減單位)度量透射光(180°)。環(huán)境保護(hù)局(epa-usa)推薦的濁度單位是ntu(比濁法濁度單位)。該測(cè)量是在以90°散射的但是在不同于860nm的波長(zhǎng)下的光中進(jìn)行的。關(guān)于酶活性的測(cè)量，它在于測(cè)定糖化淀粉酶(diastase)活性，是一種常規(guī)用于測(cè)定大麥芽或其他酶制劑的淀粉酶活性的測(cè)量(參考文章diastaseactivity-diastaticpower-foodchemicalcodex6的generaltestsandassay/appendix部分v/pp1117-1118)。糖化淀粉酶活性表示為糖化力的度數(shù)(°dp)，定義為當(dāng)在20℃下將所述樣品置于100ml的底物中持續(xù)1h時(shí)，足以還原5ml的費(fèi)林液體(fehlingliquor)的包含在0.5ml5％酶制劑的樣品溶液中的酶的量。由于糖化力使得有可能測(cè)量所有淀粉酶類型的酶活性，本申請(qǐng)公司借助其他的更特異的酶法(例如使用對(duì)于α-淀粉酶特異的megazyme測(cè)定試劑盒，由ceralphamethod銷售)證實(shí)根據(jù)本發(fā)明的β-淀粉酶制劑不含有其他污染活性。同樣地，如同將要在下文中例證的那樣，在實(shí)驗(yàn)室中使用根據(jù)本發(fā)明的酶制劑的糖化作用測(cè)試顯示出高麥芽糖含量，而沒(méi)有任何葡萄糖的顯著存在?？梢砸匀N不同的方式來(lái)進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法的澄清的該第一個(gè)步驟：1)在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)第一實(shí)施方案中，這些可溶部分的澄清是借助于選自下組的技術(shù)通過(guò)過(guò)濾來(lái)進(jìn)行的，該組由以下各項(xiàng)組成：前置過(guò)濾、加壓過(guò)濾以及真空過(guò)濾。開始的可溶部分具有高濁度，不能測(cè)量給予它們高負(fù)載的膠體顆粒和剩余不溶物的該濁度。在使用加壓過(guò)濾器的情況下，使這些可溶部分通過(guò)這個(gè)預(yù)加載有微晶纖維素的過(guò)濾器。根據(jù)所使用的纖維素的類型，出自該過(guò)濾器的產(chǎn)物于是具有約20至60ntu的濁度。在真空過(guò)濾的情況下，本申請(qǐng)公司推薦使用帶式過(guò)濾器或旋轉(zhuǎn)濾器進(jìn)行過(guò)濾。例如，使用在真空下的預(yù)加載有一層纖維素的預(yù)備層過(guò)濾器。2)在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)第二實(shí)施方案中，這些可溶部分的澄清是通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行的。根據(jù)離心沉淀的流速和濃度，來(lái)自該可溶物的離心的上清液于是也具有20至60ntu的濁度(離心機(jī)的加速度越高，存在于該上清液中的產(chǎn)物的濁度就越低)。更具體地，本申請(qǐng)公司推薦使用以下設(shè)備進(jìn)行這個(gè)離心步驟：-一臺(tái)n47自動(dòng)清洗或噴嘴分離器型盤式離心機(jī)，或-一臺(tái)btux高性能渦旋噴嘴分離器型盤式離心機(jī)(這兩種類型的離心機(jī)na7或btux分別由westfalia和alfalaval公司銷售)。但是任選地在離心之后，為了盡可能減少可溶部分的加載，可能是有用的是進(jìn)行一個(gè)額外的“安全”過(guò)濾。所選擇的過(guò)濾器是一臺(tái)水平板式加壓過(guò)濾器。該過(guò)濾器加載有具有細(xì)粒度的纖維素的一個(gè)預(yù)備層。于是將過(guò)濾的這些可溶部分加入(通過(guò)用纖維素或多或少地大量注滿)。該濾液的濁度因此下降到在5與10ntu之間的一個(gè)值。3)在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)第三實(shí)施方案中，可溶部分的澄清是通過(guò)切向膜過(guò)濾來(lái)進(jìn)行的。更具體地，本申請(qǐng)公司推薦通過(guò)用多層膜(例如陶瓷膜，具有從0.1至1μm的孔隙率)的切向微孔過(guò)濾來(lái)進(jìn)行該膜過(guò)濾。在這種情況下的滲透物有利地具有一個(gè)約0ntu的濁度。然而，這種技術(shù)會(huì)導(dǎo)致吸附到這些膜上的β-淀粉酶的損失。然而，相對(duì)于最初存在于這些可溶部分中的量，這個(gè)損失是可以忽略的。根據(jù)本發(fā)明的方法的這個(gè)澄清步驟可以由這三種實(shí)施方案中的任何一種組成(過(guò)濾、離心或切向膜過(guò)濾)，或者由這三種實(shí)施方案中的兩種或三種的任何組合組成。任選地，可以在這個(gè)澄清步驟之前通過(guò)任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行一個(gè)絮凝這些膠體顆粒的步驟，而且，如同將在下文舉例說(shuō)明。為了得到一種不含有污染性殘余鹽的制劑并且濃縮所述關(guān)于β-淀粉酶的制劑，以這樣一種方式進(jìn)行所述澄清的可溶部分的超濾以獲得含有β-淀粉酶和一種超濾滲透物的超濾滲余物。然后以這樣一種方式以恒定的體積透析該超濾滲余物以降低在所述滲余物中雜質(zhì)的濃度。更具體地，本申請(qǐng)公司推薦使用具有從10000da至50000da的截?cái)嚅撝?優(yōu)選具有30000da(也用30kda表示)的截?cái)嚅撝?的膜進(jìn)行該超濾。在配備有在盒式超濾器(cassette)中的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的具有30000da截?cái)嚅撝档木刍撬峄?polysulfonatedmembrane)以及中試規(guī)模(pilotscale)的具有30000da截?cái)嚅撝档木刍撬峄菪さ哪K上超濾這些可溶部分。隨著體積濃縮因子(vcf)的增加，在該滲余物中的酶變得濃縮。對(duì)于十升的定量測(cè)定為22°dp/ml的起始溶液，對(duì)于vcf為5時(shí)，獲得兩升110°dp/ml的滲余物和八升不具有糖化力的滲透物。依照根據(jù)本發(fā)明的方法，以恒定的體積滲濾該超濾滲余物。這是因?yàn)榫哂懈呒兌鹊拇蠓肿拥墨@得需要實(shí)行這樣一個(gè)滲濾步驟以便使得不被膜阻留的溶質(zhì)從該超濾滲余物中去除(通過(guò)稀釋和滲透)。根據(jù)本發(fā)明的方法的最后步驟可以在于將該超濾滲透物與步驟b)的不溶物和膠體混合。使這種混合物與來(lái)自淀粉工業(yè)的未處理的可溶部分再結(jié)合。如將被舉例說(shuō)明的那樣，并且令人驚訝和出乎意料地的是，如此制備的制劑具有這樣一種品質(zhì)，使得有可能照原樣作為旨在用于制備富含麥芽糖糖漿的酶的來(lái)源而使用它，無(wú)需額外的處理。具體實(shí)施方式實(shí)例1：從小麥可溶物中獲得一種β-淀粉酶的第一制劑-實(shí)驗(yàn)室規(guī)模在從小麥制造淀粉的過(guò)程中，在可溶物蒸發(fā)器的入口處收集了60升的可溶部分，在濃縮后按慣例進(jìn)行用于家畜飼料的一個(gè)步驟，由本申請(qǐng)公司以名稱銷售。這些可溶部分具有的ph值為4并且β-淀粉酶活性為約25°dp/ml。在一臺(tái)由westfalia公司銷售的sa1除渣式盤式離心機(jī)中，以40升/小時(shí)的流速離心這些60升的可溶部分。從離心回收45升的上清液。測(cè)量的濁度為60ntu。然后在一臺(tái)56cm2的choquenet實(shí)驗(yàn)室箱板過(guò)濾器(chambersheetfilter)、一臺(tái)預(yù)加載有clar-o-cel13/6(ceca)和vitacell10(j.rettenmaierund)纖維素的布過(guò)濾器上將它們過(guò)濾。用這些纖維素以1g/l的速率還進(jìn)行連續(xù)注滿?；厥?0升具有8ntu的濁度和22°dp/ml的β-淀粉酶活性的濾液。然后在具有多層0.18m2的膜的微孔實(shí)驗(yàn)室模塊上將該濾液進(jìn)行超濾?；厥?9.5升的超濾濾液以及在因子為75的情況下的濃縮的滲余物，具有在1500與1600°dp/ml之間的β-淀粉酶活性。用2.5倍體積的水以這樣一種方式以恒定的體積連續(xù)透析該超濾滲余物，使得在因子為10的情況下降低這些可溶物的雜質(zhì)的濃度。然后在+4℃下儲(chǔ)存生成的β-淀粉酶制劑。實(shí)例2：從小麥可溶物獲得一種β-淀粉酶的第一制劑-用絮凝劑的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模在從小麥制造淀粉的過(guò)程中，在可溶物蒸發(fā)器的入口處收集了ph值為4.3的120升的可溶部分。然后用20ppm的fe3+和25ppm的聚合flopaman923pwg陰離子絮凝劑(snf)以這樣一種方式將它們進(jìn)行處理以絮凝這些不溶性顆粒和膠體顆粒。然后在實(shí)例1的條件下以40升/小時(shí)的流速離心如此處理的這些可溶部分。獲得90升的如此離心的可溶部分。它們具有約17ntu的濁度以及21°dp/ml的β-淀粉酶活性。以與實(shí)例1相同的方式，使這個(gè)部分在一臺(tái)箱板過(guò)濾器上經(jīng)受精濾。獲得80升的具有5ntu濁度的過(guò)濾溶液。然后在具有0.18m2的具有30kda的截?cái)嚅撝档哪さ奈⒖讓?shí)驗(yàn)室模塊上進(jìn)行超濾?；厥?9升的超濾濾液以及在因子為80的情況下的濃縮的滲余物，具有在1500與1600°dp/ml之間的β-淀粉酶活性。用2.5倍體積的水以這樣一種方式以恒定的體積連續(xù)透析該超濾滲余物，使得在因子為10的情況下降低這些可溶物的雜質(zhì)的濃度。然后在+4℃下儲(chǔ)存生成的β-淀粉酶制劑。實(shí)例3：從小麥可溶物中獲得一種β-淀粉酶的第一制劑-中試規(guī)模中試由在其中如實(shí)例2中收集和制備的10m3的小麥可溶部分的測(cè)試組成。通過(guò)在一臺(tái)na7離心機(jī)上以自凈操作方式離心，去除這些不溶顆粒和膠體顆粒?；厥?m3的具有22ntu的濁度的上清液。隨后在一臺(tái)加載有預(yù)定義的纖維素的0.3m2amafilter過(guò)濾器上通過(guò)前置過(guò)濾對(duì)這種上清液進(jìn)行過(guò)濾。用1g/l的纖維素將其注滿。一經(jīng)過(guò)濾，該溶液具有5ntu的濁度。在一臺(tái)由具有30kda的截?cái)嚅撝档木刍撬峄菪そM成的設(shè)備上進(jìn)行超濾。于是獲得了75升的在因子約為95的情況下濃縮的并且具有約2000°dp/ml的β-淀粉酶活性的滲余物。用2.5倍體積的水以這樣一種方式以恒定的體積連續(xù)透析該超濾滲余物，使得在因子為10的情況下降低這些可溶物的雜質(zhì)的濃度。為了使酶穩(wěn)定，加入50kg由本申請(qǐng)公司以商標(biāo)銷售的、含有99.5％的干物質(zhì)的山梨糖醇粉末。最終的制劑具有1550°dp/ml的β-淀粉酶活性。實(shí)例4：從大麥可溶物中獲得β-淀粉酶制劑將100kg的大麥粉和72升的水加入到一臺(tái)捏合機(jī)中從而獲得一種硬面團(tuán)。在環(huán)境溫度下靜置30分鐘之后，在由本申請(qǐng)公司制造的旋轉(zhuǎn)篩中以逆流的方式用水洗滌該面團(tuán)，從而將淀粉從麩質(zhì)中分離出。收集200升的淀粉懸浮液，并且在一個(gè)100μm的第一振動(dòng)篩上進(jìn)行篩分，然后在63μm的第二振動(dòng)篩上進(jìn)行篩分，以去除纖維、膠質(zhì)以及殘余麩質(zhì)。然后在一臺(tái)在名稱sedicanter下以商標(biāo)flottweg銷售的沉降式離心機(jī)上以高流速(200l/h)以這樣一種方式離心該濾液，以分離在濃縮物中的a-淀粉(大顆粒)和在上清液中的b-淀粉(小顆粒)。在sa1盤式除渣式分離機(jī)(westfalia)上以減小的流速(40l/h)以這樣一種方式再次離心b-淀粉懸浮液溢流，以分離在濃縮物中的b-淀粉以及在上清液中的可溶部分。ph值為4.5。所有這些現(xiàn)有步驟使得有可能獲得一種根據(jù)本發(fā)明的可溶部分，即不含有貴重組分，特別是不含有淀粉(無(wú)論它是哪一種淀粉)、蛋白質(zhì)、纖維和膠質(zhì)。取60升的具有120ntu的濁度的所述可溶部分。根據(jù)實(shí)例號(hào)2的絮凝方法處理該可溶部分。在一臺(tái)前述的除渣離心機(jī)上以40l/h的流速進(jìn)行離心，并且回收40升的具有28°dp/ml的β-淀粉酶活性和21ntu的濁度的可溶部分。在一臺(tái)預(yù)加載有clar-o-cel13/6(ceca)和vitacell10(j.rettenmaierund)纖維素的箱板過(guò)濾器上將這個(gè)可溶部分進(jìn)行過(guò)濾。用1g/l的纖維素將該可溶部分注滿。獲得40升具有6ntu的濁度和27°dp/ml的β-淀粉酶活性的濾液。如在實(shí)例2中所述，在一臺(tái)具有0.18m2的30kda膜的微孔實(shí)驗(yàn)室模塊上進(jìn)行超濾。在約為65的因子的情況下進(jìn)行濃縮。最后獲得0.6升的具有1700°dp/ml的β-淀粉酶活性的濃縮酶溶液。用2.5倍體積的水以這樣一種方式以恒定的體積連續(xù)透析該超濾滲余物，使得在因子為10的情況下降低這些可溶物的雜質(zhì)的濃度。用400g的由本申請(qǐng)公司以商標(biāo)銷售的、含有99.5％的干物質(zhì)的山梨糖醇粉末來(lái)將其穩(wěn)定化。于是該酶制劑具有1400°dp/ml的β-淀粉酶活性。實(shí)例5：獲得富含麥芽糖的糖漿，使用商購(gòu)的純化β-淀粉酶作為對(duì)照a)單獨(dú)通過(guò)β-淀粉酶的作用獲得麥芽糖糖漿在實(shí)驗(yàn)室中使用從genencor公司(optimaltbba)商購(gòu)的純化β-淀粉酶以及使用根據(jù)實(shí)例1制備的依照本發(fā)明的β-淀粉酶制劑進(jìn)行糖化的比較。將處于4‰的濃度的β-淀粉酶(基于干淀粉的商購(gòu)的酶)添加到一種含有30％的干物質(zhì)的液化淀粉的溶液中，該溶液具有為6的葡萄糖當(dāng)量水平(具有de6的麥芽糊精的溶出度)。有意調(diào)高該劑量以檢測(cè)可能存在的寄生酶活性(parasiticenzymaticactivity)。在58℃的溫度和ph值5的條件下進(jìn)行該反應(yīng)24小時(shí)。該結(jié)果表示為由β-淀粉酶作用產(chǎn)生的葡萄糖單體和低聚物的％，低聚物具有等于2以及更大的聚合度(通過(guò)鈉型高壓液相色譜法測(cè)定)。dp2對(duì)應(yīng)于麥芽糖，dp1對(duì)應(yīng)于葡萄糖并且dp3對(duì)應(yīng)于麥芽三糖。這些結(jié)果證明，根據(jù)本發(fā)明的β-淀粉酶制劑可以有效地代替商購(gòu)的β-淀粉酶。b)在實(shí)驗(yàn)室中，通過(guò)與支鏈淀粉酶和麥芽糖生產(chǎn)酶(maltogenase)結(jié)合的β-淀粉酶制劑的作用獲得了一種富含麥芽糖的糖漿在以上條件下進(jìn)行這些測(cè)試，其區(qū)別在于，2種酶是隨著該β-淀粉酶制劑的添加而同時(shí)添加的。它們是特異性地水解淀粉的α1→6鍵的由abm公司銷售的支鏈淀粉酶、以及特異性地水解α1→4鍵的由novozymes公司在名稱下銷售的生麥芽糖α-淀粉酶。這些酶也是以4‰的比例添加的(基于干淀粉的商購(gòu)酶)。作為對(duì)照，一種源自麥芽提取物的β-淀粉酶制劑(＝主要由β-淀粉酶組成的多種酶的合劑)被用作β-淀粉酶來(lái)源。同時(shí)使用純化的β-淀粉酶與使用根據(jù)本發(fā)明的β-淀粉酶制劑所獲得的碳水化合物特征曲線是等效的，由此證明了根據(jù)本發(fā)明的所述制劑的優(yōu)異行為，使用麥芽提取物所獲得的碳水化合物特征曲線產(chǎn)生了高得多的葡萄糖含量。c)通過(guò)工業(yè)規(guī)模的與支鏈淀粉酶和麥芽糖生產(chǎn)酶結(jié)合的β-淀粉酶制劑的作用而獲得了一種富含麥芽糖的糖漿實(shí)例號(hào)3的制劑被用來(lái)進(jìn)行工業(yè)測(cè)試。糖化是在200m3的含有30％的干物質(zhì)的液化淀粉溶液上進(jìn)行的，該溶液具有為6的葡萄糖當(dāng)量水平。在以下條件下同時(shí)添加β-淀粉酶制劑(1‰，基于干基重)、支鏈淀粉酶以及麥芽糖生產(chǎn)酶：ph值5，55℃。在66小時(shí)后獲得以下結(jié)果(表示為產(chǎn)生的％dp-通過(guò)鈉hpplc進(jìn)行測(cè)量)：dp>3dp3dp2dp161.188.34.3可以純化、氫化和結(jié)晶這種富含麥芽糖的糖漿，從而獲得具有與通過(guò)常規(guī)途徑所獲得的那些品質(zhì)相同的麥芽糖醇。d)通過(guò)超濾的和滲濾的β-淀粉酶制劑的作用而獲得麥芽糖糖漿在實(shí)驗(yàn)室中使用根據(jù)實(shí)例1制備的依照本發(fā)明的β-淀粉酶制劑(實(shí)例1的β-淀粉酶)，并且使用根據(jù)實(shí)例1澄清的但不經(jīng)受超濾和滲濾步驟的β-淀粉酶制劑(未經(jīng)uf的β-淀粉酶)進(jìn)行了糖化作用的比較。對(duì)于用“實(shí)例1的β-淀粉酶”制劑的糖化作用，將4‰(基于干淀粉的商購(gòu)酶)濃度的所述“實(shí)例1的β-淀粉酶”制劑添加到一種含有30％的干物質(zhì)的液化淀粉的溶液中，該溶液具有為6的葡萄糖當(dāng)量水平(具有de6的麥芽糊精的溶出度)。于是該酶制劑具有1.8°dp/ml的β-淀粉酶活性。在58℃的溫度和ph值5的條件下進(jìn)行該反應(yīng)24h。對(duì)于用“未經(jīng)uf的β-淀粉酶”制劑的糖化作用，取1l的實(shí)例1的8ntu的濾液(既沒(méi)有超濾也沒(méi)有滲濾的濾液)。稀釋所述8ntu的濾液至1/15th從而獲得濃度為1.8°dp/ml的β-淀粉酶。將ph值調(diào)至5。取700ml的所述稀釋濾液并且添加300g的具有de6的麥芽糊精。在58℃的溫度下進(jìn)行該反應(yīng)24h。獲得以下結(jié)果(表示為產(chǎn)生的％dp-通過(guò)鈉hpplc進(jìn)行測(cè)量)：這些結(jié)果證明，未超濾和未滲濾的β-淀粉酶制劑(未經(jīng)uf的β-淀粉酶)使得有可能獲得一種含有2.2％的葡萄糖的富含麥芽糖的糖漿。不像“實(shí)例1的β-淀粉酶”制劑(獲得的含有0.4％葡萄糖的富含麥芽糖的糖漿)，因此“未經(jīng)uf的β-淀粉酶”制劑被酶雜質(zhì)污染。為了評(píng)估使用兩種制劑(“實(shí)例1的β-淀粉酶”和“未經(jīng)uf的β-淀粉酶”)而獲得的富含麥芽糖的糖漿的純度(特別是它們的含鹽量)，在一臺(tái)來(lái)自millipore公司的具有1μm孔隙率的盤式過(guò)濾器上過(guò)濾這些糖漿之后，在20℃的條件下測(cè)量了所述糖漿的傳導(dǎo)性(由mettler公司銷售的cdm210儀器)。結(jié)果如下：傳導(dǎo)性(μs)未經(jīng)uf的β-淀粉酶200實(shí)例1的β-淀粉酶20與借助“未經(jīng)uf的β-淀粉酶”制劑獲得的富含麥芽糖的糖漿相比，超濾和滲濾的制劑(“實(shí)例1的β-淀粉酶”)使得有可能獲得含鹽量低得多的富含麥芽糖的糖漿。因此，與借助“實(shí)例1的β-淀粉酶”制劑獲得的糖漿相比，借助“未經(jīng)uf的β-淀粉酶”制劑獲得的糖漿的純化(過(guò)濾、脫色、脫礦質(zhì))將是更困難的。當(dāng)前第1頁(y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