本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物生物學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種來源于石蒜科植物的細(xì)胞色素P450還原酶及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物細(xì)胞色素P450酶(Cytochrome P450enzymes，CYPs)參與大量植物天然產(chǎn)物的生物合成，是天然產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵酶之一，屬于亞鐵血紅素單加氧酶超大家族，催化多種類型的氧化還原反應(yīng)，具有結(jié)構(gòu)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性。CYPs的催化活性嚴(yán)格依賴于細(xì)胞色素P450還原酶。細(xì)胞色素P450還原酶(EC1.6.2.4Cytochrome P450Reductase，CPR)是CYPs催化體系的重要組成部分，屬于核黃素蛋白家族，具有黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和黃素單核苷酸(FMN)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。作為CYPs的氧化還原分子伴侶，細(xì)胞色素P450還原酶可以從電子供體(還原力)中獲得電子，并通過輔因子FAD和FMN，將獲得的電子傳遞給CYPs，協(xié)助CYPs所催化的一系列氧化還原反應(yīng)。如果沒有CPR的存在，CYPs對其底物就沒有催化活性。因此，CPR是CYPs催化進(jìn)行結(jié)構(gòu)專一性、區(qū)域?qū)Ｒ恍院土Ⅲw專一性生物反應(yīng)所必需的：CPR催化電子從電子供體(還原力)通過FAD和FMN傳遞到CYPs的亞鐵血紅素輔基，協(xié)助CYPs催化底物的生物轉(zhuǎn)化。

植物細(xì)胞中CYPs的種類數(shù)量一般有200多種，而CPR蛋白卻只有2-5種。也就是說，植物CPR蛋白在協(xié)助植物CYPs進(jìn)行底物的轉(zhuǎn)化(產(chǎn)物的合成)過程中具有較好的適用性。因此，在研究細(xì)胞色素P450酶的催化活性以及利用細(xì)胞色素P450酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化和生物合成時，如果沒有對應(yīng)物種的CPR，可以使用來源于其他物種的CPR代替。也就是說，CPR在植物天然產(chǎn)物的體內(nèi)合成、生物轉(zhuǎn)化以及發(fā)酵過程中具有重要的作用。

忽地笑(Lycoris aurea)是多年生草本球根藥用植物，屬于石蒜科石蒜屬，富含加蘭他敏、石蒜堿、文殊蘭堿等石蒜科植物所特有的生物堿(石蒜科生物堿)與其它生物堿、以及其它類型的植物天然產(chǎn)物。這些天然產(chǎn)物具有重要的生物活性和應(yīng)用價值。例如，加蘭他敏作為一種特定的、競爭性的、可逆的乙酰膽堿酯酶抑制劑，在臨床上用于治療阿爾茨海默病(老年癡呆癥)。又例如，作為一種苯酚衍生物，對-香豆酸是植物苯丙素類天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗病毒、抗癌及抗炎等多種生物醫(yī)藥活性，用于臨床及醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)。作為一個多功能的藥效基團(tuán)和平臺化合物，對-香豆酸還可以衍生出大量具有醫(yī)藥活性的化合物(包括上述在臨床治療輕、中度老年癡呆癥的藥物-加蘭他敏等)，具有廣泛的應(yīng)用和需求。在這些天然產(chǎn)物的生物合成過程中，細(xì)胞色素P450酶(CYPs)參與催化一步或多步反應(yīng)，而其催化功能依賴于細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)。但是，石蒜屬植物細(xì)胞色素P450還原酶及其編碼基因尚未被分離與克隆。因此，本領(lǐng)域有必要開發(fā)石蒜屬植物忽地笑的細(xì)胞色素P450還原酶。該蛋白及其編碼基因可通過植物轉(zhuǎn)基因和異源表達(dá)的方式協(xié)助細(xì)胞色素P450酶進(jìn)行天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化與生物合成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種石蒜科植物的細(xì)胞色素P450還原酶，所述的細(xì)胞色素P450還原酶選自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白質(zhì)；或

(b)將SEQ ID NO：1氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-90個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有細(xì)胞色素P450還原酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或

(c)與SEQ ID NO：1氨基酸序列有至少86％序列相同性，且具有細(xì)胞色素P450還原酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明SEQ ID NO：1所示的蛋白質(zhì)是從忽地笑(Lycoris aurea)中分離得到的一種新的細(xì)胞色素P450還原酶。為便于表述，將SEQ ID NO：1所示的蛋白質(zhì)命名為細(xì)胞色素P450還原酶LaCPR1。

在一個優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞色素P450還原酶活性是指利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)為電子供體(還原力)，傳遞電子給細(xì)胞色素P450酶的替代物(細(xì)胞色素c)。

在另一個優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞色素P450還原酶活性是指傳遞電子給細(xì)胞色素P450酶(Cytochrome P450enzyme，CYPs)，并協(xié)助CYPs催化其底物合成產(chǎn)物；例如植物天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化與生物合成。

在另一個優(yōu)選例中，所述的序列(c)還包括：由(a)或(b)添加了標(biāo)簽序列、信號序列或分泌信號序列后所形成的融合蛋白。

本發(fā)明的另一目的在于提供分離的多核苷酸，該多核苷酸是編碼所述細(xì)胞色素P450還原酶的多核苷酸。

在一個優(yōu)選例中，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏好性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用合適特定物種表達(dá)的密碼子。因而，本發(fā)明細(xì)胞色素P450還原酶的多核苷酸還包括由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，得到的編碼具有細(xì)胞色素P450還原酶活性的核苷酸序列。

本發(fā)明的又一目的是提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。所述的載體是將本發(fā)明的編碼所述細(xì)胞色素P450還原酶的多核苷酸與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明所述細(xì)胞色素P450還原酶的重組表達(dá)載體或抑制本發(fā)明所述細(xì)胞色素P450還原酶編碼多核苷酸表達(dá)的基因沉默載體。

在一個優(yōu)選例中，該載體是含有編碼所述細(xì)胞色素P450還原酶的SEQ ID NO：2所示序列的重組表達(dá)載體pET28a-LaCPR1。

在另一個優(yōu)選例中，該載體是含有編碼所述細(xì)胞色素P450還原酶的SEQ ID NO：2所示序列中第175-2088位多核苷酸的重組表達(dá)載體pET28a-LaCPR1(ΔN58)。

本發(fā)明的又一目的是提供一種宿主細(xì)胞，它含有所述的載體或基因組中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、運(yùn)動假單胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主細(xì)胞包括真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等。所述的真菌細(xì)胞包括酵母細(xì)胞。將所述的重組表達(dá)載體或者基因沉默載體導(dǎo)入所述的適當(dāng)宿主細(xì)胞中，獲得表達(dá)本發(fā)明所述細(xì)胞色素P450還原酶的基因工程菌株、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因愈傷、轉(zhuǎn)基因組織、轉(zhuǎn)基因植株或者基因工程植株。

本發(fā)明的又一目的是提供所述的細(xì)胞色素P450還原酶的用途，用于傳遞電子給細(xì)胞色素P450酶并協(xié)助細(xì)胞色素P450酶對其底物進(jìn)行氧化修飾合成產(chǎn)物。

在一個優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞色素P450酶是CYP73A；或所述的底物是反式-肉桂酸。

本發(fā)明的又一目的是提供一種表達(dá)構(gòu)建物。所述表達(dá)構(gòu)建物包括以下酶的編碼基因和/或基因表達(dá)盒：

所述的細(xì)胞色素P450還原酶；和

細(xì)胞色素P450酶；和/或

細(xì)胞色素P450酶底物的生物合成酶。

所述基因表達(dá)盒是酶在宿主細(xì)胞中表達(dá)與調(diào)控所需要的生物學(xué)元件，包括啟動子、增強(qiáng)子、衰減子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Kozak序列、內(nèi)含子和/或轉(zhuǎn)錄終止子等；此外，還可包括標(biāo)簽編碼序列和/或信號(肽)編碼序列等。

在一個優(yōu)選例中，所述的表達(dá)構(gòu)建物還包括：反式-肉桂酸-4-羥化酶(CYP73A)的編碼基因。

在另一個優(yōu)選例中，所述的表達(dá)構(gòu)建物還包括：反式-肉桂酸-4-羥化酶(CYP73A)的編碼基因和苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)編碼基因。

在另一個優(yōu)選例中，當(dāng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞時，所述的表達(dá)構(gòu)建物中，還包含大腸桿菌啟動子、大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)和/或大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止子等基因表達(dá)盒。

本發(fā)明的又一目的是提供一種宿主細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞中包括所述的表達(dá)構(gòu)建物。所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、運(yùn)動假單胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主細(xì)胞包括真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等。較佳地，所述的宿主細(xì)胞是內(nèi)源存在細(xì)胞色素P450酶的底物或其底物前體的細(xì)胞。

本發(fā)明的又一目的是提供所述的表達(dá)構(gòu)建物的用途，用于生產(chǎn)對-香豆酸。

本發(fā)明的又一目的是提供一種生產(chǎn)對-香豆酸的方法。所述方法包括：利用所述的細(xì)胞色素P450還原酶作為氧化還原分子伴侶，協(xié)助細(xì)胞色素P450酶CYP73A催化反式-肉桂酸合成對-香豆酸。

在一個優(yōu)選例中，所述方法包括：以所述的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，利用轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞催化反式-肉桂酸合成對-香豆酸；所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、運(yùn)動假單胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主細(xì)胞包括真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等。所述的真菌細(xì)胞包括酵母細(xì)胞。

在另一個優(yōu)選例中，所述方法包括：以所述的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，利用簡單的碳水化合物(葡萄糖)合成對-香豆酸。該宿主細(xì)胞是包含有細(xì)胞色素P450酶的底物的細(xì)胞；較佳地，該宿主細(xì)胞是內(nèi)源存在反式-肉桂酸或其前體的細(xì)胞。

本發(fā)明首次揭示了石蒜科植物忽地笑來源的細(xì)胞色素P450還原酶LaCPR1，其具有良好的輔酶專一性。本發(fā)明還揭示了編碼所述細(xì)胞色素P450還原酶的多核苷酸、表達(dá)所述細(xì)胞色素P450還原酶的表達(dá)載體及宿主細(xì)胞。本發(fā)明應(yīng)用石蒜科植物來源的細(xì)胞色素P450還原酶，可協(xié)助細(xì)胞色素P450酶(CYPs)發(fā)揮催化活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物(例如但不限于對-香豆酸)的生物轉(zhuǎn)化以及生物合成。

附圖說明

圖1是引物對SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

圖2是重組表達(dá)載體pET28a-LaCPR1的菌落PCR驗證電泳圖(引物為T7和T7ter)。

圖3是重組表達(dá)載體pET28a-LaCPR1(ΔN58)的菌落PCR驗證電泳圖(引物為T7和T7ter)。

圖4是LaCPR1在大腸桿菌中表達(dá)與分布檢測的SDS-PAGE電泳圖。

圖5是LaCPR1的輔因子專一性與酶活性圖。

圖6是LaCPR1(ΔN58)在大腸桿菌中表達(dá)與分布檢測的SDS-PAGE電泳圖。

圖7是LaCPR1(ΔN58)的輔因子專一性與酶活性圖。

圖8是重組表達(dá)載體pET28a-LaCPR1-CYP73A的菌落PCR驗證電泳圖(引物為SEQ ID NO：10和T7ter)。

圖9是重組表達(dá)載體pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A的菌落PCR驗證電泳圖(引物為SEQ ID NO：10和T7ter)。

圖10是重組表達(dá)載體pET28a-CYP73A的菌落PCR驗證電泳圖(引物為T7和T7ter)。

圖11是重組菌株EcR-LaCPR1、EcR-CYP73A、EcR-LaCPR1-CYP73A和EcR-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A生物轉(zhuǎn)化圖。

圖12是重組表達(dá)載體pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A-rbsPAL的菌落PCR驗證電泳圖(引物為SEQ ID NO：13和T7ter)。

圖13是重組菌株Ec31884-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A-PAL發(fā)酵生產(chǎn)對-香豆酸的產(chǎn)量圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例并附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1、細(xì)胞色素P450還原酶LaCPR1編碼基因的克隆

合成兩條引物分別具有序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

以從忽地笑中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用如上兩條引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4進(jìn)行PCR。DNA聚合酶選用南京諾唯贊生物科技有限公司的Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增程序為：95℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃2min，共30個循環(huán)；72℃10min，降至10℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1。

在紫外燈照射下，切下目標(biāo)DNA條帶。然后采用多功能DNA純化試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)從瓊脂糖凝膠中回收DNA即為擴(kuò)增出的細(xì)胞色素P450還原酶編碼基因的DNA片段。利用寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)的pMD19-T克隆試劑盒，將回收的PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體，所構(gòu)建的載體命名為pMDT-LaCPR1。經(jīng)測序獲得LaCPR1的基因序列。

LaCPR1基因具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列。自SEQ ID NO：2的5’-端第1-2088位核苷酸為LaCPR1的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，自SEQ ID NO：2的5’-端的第1-3位核苷酸為LaCPR1基因的起始密碼子ATG，自SEQ ID NO：2的5’-端的第2086-2088位核苷酸為LaCPR1基因的終止密碼子TGA。細(xì)胞色素P450還原酶編碼基因LaCPR1編碼一個含有695個氨基酸的蛋白質(zhì)LaCPR1，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，用軟件預(yù)測到該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為77.4KDa，等電點(diǎn)pI為5.27。

實(shí)施例2、LaCPR1基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)合成分別具有序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7核苷酸序列的兩條引物。在合成的引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的5’-端分別設(shè)置NdeI和XhoI兩個酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基序列，以忽地笑的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序同實(shí)施例1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、分離、切膠回收后經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切，利用寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)的T4DNA連接酶連接同樣經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切的pET28a載體(Novagen)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于添加25μg/mL卡那霉素的LB平板上。通過菌落PCR驗證獲得陽性轉(zhuǎn)化子，菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖2。通過測序進(jìn)一步驗證重組質(zhì)粒pET28a-NdeI-LaCPR1-XhoI構(gòu)建成功，并在NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間含有SEQ ID NO：2的全長多核苷酸序列。所獲得的重組質(zhì)粒命名為pET28a-LaCPR1。

(2)合成分別具有序列表中SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7核苷酸序列的兩條引物。在合成的引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的5’-端分別設(shè)置NdeI和XhoI兩個酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基序列，以忽地笑的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序同實(shí)施例1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、分離、切膠回收后經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切，利用T4DNA連接酶(購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa))連接同樣經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切的pET28a載體(Novagen)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于添加卡那霉素(終濃度為25μg/mL)的LB平板上。通過菌落PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子，菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖3。測序進(jìn)一步驗證重組質(zhì)粒pET28a-NdeI-LaCPR1(ΔN58)-XhoI構(gòu)建成功，并在NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間含有SEQ ID NO：2多核苷酸序列中175-2088位核苷酸。所獲得的重組質(zhì)粒命名為pET28a-LaCPR1(ΔN58)。

實(shí)施例3、LaCPR1和LaCPR1(ΔN58)的表達(dá)、純化與酶活測定

(1)將重組質(zhì)粒pET28a-LaCPR1利用熱擊法(42℃，90s)轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Rosseta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組大腸桿菌Rosseta(DE3)/pET28a-LaCPR1。挑取單克隆過夜培養(yǎng)，再將菌液按100倍稀釋于含卡那霉素(終濃度為25μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待菌液生長至600nm波長下吸光度為0.6-0.8時，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(終濃度為0.1mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃。取誘導(dǎo)過的菌液40ml，離心收集菌體(4000rpm，10min，4℃)，丟棄上清后用冰冷的1×PBS緩沖液洗滌菌體2遍，重懸于30ml 1×PBS緩沖液中。取1ml重懸菌液備用，剩余菌液進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞，然后高速低溫冷凍離心(12000g，30min，4℃)分離可溶部分和不可溶部分。取菌液、可溶部分和不可溶部分各400μl，分別加100μl 5×SDS Loading Buffer，短暫漩渦震蕩后，于沸水中煮5min，10000rpm離心10min，各取10μl樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測重組蛋白，結(jié)果見圖4，表達(dá)蛋白的分子量約為77KDa。取細(xì)菌破碎液上樣到鎳柱(購自南京金斯瑞生物科技有限公司)，待濾液全部過濾完后，用Wash Buffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，50mM imidazole，pH7.9)沖洗2次。然后用Elution Buffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，250mM imidazole，pH7.9)洗脫。用Vivaspin濃縮洗脫液，并經(jīng)PD-10脫鹽柱(GE Healthcare)脫鹽后，溶解于含10％甘油的Tris-HCl緩沖液中(50mM，pH8.0)，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測重組蛋白，并采用Bradford方法(Bradford et al.，1976)測定蛋白濃度，然后分裝保存于-80℃?zhèn)溆?。取純化的LaCPR1蛋白液利用Guengerich等的方法(Guengerich et al.，Nature Protocol，2009)測定酶活，結(jié)果如圖5，LaCPR1主要傳遞電子供體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)(還原力)中的電子。

(2)將重組質(zhì)粒pET28a-LaCPR1(ΔN58)利用熱擊法(42℃，90s)轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Rosseta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組大腸桿菌Rosseta(DE3)/pET28a-LaCPR1(ΔN58)。挑取單克隆過夜培養(yǎng)，再將菌液按100倍稀釋于含卡那霉素(終濃度為25μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待菌液生長至600nm波長下吸光度為0.6-0.8時，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(終濃度為0.1mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃。取誘導(dǎo)過的菌液40ml，離心收集菌體(4000rpm，10min，4℃)，丟棄上清后用冰冷的1×PBS緩沖液洗滌菌體2遍，重懸于30ml 1×PBS緩沖液中。取1ml重懸菌液備用，剩余菌液進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞，然后高速低溫冷凍離心(12000g，30min，4℃)分離可溶部分和不可溶部分。取菌液、可溶部分和不可溶部分各400μl，分別加100μl 5×SDS Loading Buffer，短暫漩渦震蕩后，于沸水中煮5min，10000rpm離心10min，各取10μl樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測重組蛋白，結(jié)果見圖6，表達(dá)蛋白的分子量約為73KDa，其主要分布在大腸桿菌細(xì)胞破碎液的可溶性部分。取細(xì)菌破碎液上樣到鎳柱(購自南京金斯瑞生物科技有限公司)，待濾液全部過濾完后，用Wash Buffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，50mM imidazole，pH7.9)沖洗2次。然后用Elution Buffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，250mM imidazole，pH7.9)洗脫。用Vivaspin濃縮洗脫液，并經(jīng)PD-10脫鹽柱(GE Healthcare)脫鹽后，溶解于含10％甘油的Tris-HCl緩沖液中(50mM，pH8.0)，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測重組蛋白，并采用Bradford方法(Bradford et al.，1976)測定蛋白濃度，然后分裝保存于-80℃?zhèn)溆?。取純化的LaCPR1(ΔN58)蛋白液利用Guengerich等的方法(Guengerich et al.，Nature Protocol，2009)測定酶活，結(jié)果如圖7，LaCPR1(ΔN58)的酶活是LaCPR1的2.23倍。

實(shí)施例4、LaCPR1和CYP73A重組表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)合成分別具有序列表中SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9核苷酸序列的兩條引物，以忽地笑的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增CYP73A編碼基因。PCR擴(kuò)增程序同實(shí)施例1。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、回收?；厥斋@得的DNA片段兩端分別帶有25bp與pET28a-LaCPR1載體XhoI酶切位點(diǎn)兩側(cè)同源的序列。利用XhoI限制性內(nèi)切酶(購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa))將pET28a-LaCPR1載體線性化。利用One-step cloning試劑盒(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)按照產(chǎn)品說明書將CYP73A編碼基因?qū)雙ET28a-LaCPR1載體的XhoI酶切位點(diǎn)中，利用合成的具有序列表中SEQ ID NO：10核苷酸序列的引物與通用測序引物T7ter進(jìn)行菌落PCR驗證，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-LaCPR1-CYP73A，結(jié)果如圖8。進(jìn)一步測序證實(shí)重組質(zhì)粒中LaCPR1和CYP73A進(jìn)行了基因的融合表達(dá)。

(2)合成分別具有序列表中SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9核苷酸序列的兩條引物，以忽地笑的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增CYP73A編碼基因。PCR擴(kuò)增程序同實(shí)施例1。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、回收?；厥斋@得的DNA片段兩端分別帶有25bp與pET28a-LaCPR1(ΔN58)載體XhoI酶切位點(diǎn)兩側(cè)同源的序列。利用XhoI限制性內(nèi)切酶(購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa))將pET28a-LaCPR1(ΔN58)載體線性化。利用One-step cloning試劑盒(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)按照產(chǎn)品說明書將CYP73A編碼基因?qū)雙ET28a-LaCPR1(ΔN58)載體的XhoI酶切位點(diǎn)中，利用合成的具有序列表中SEQ ID NO：10核苷酸序列的引物與通用測序引物T7ter進(jìn)行菌落PCR驗證，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A，結(jié)果如圖9。進(jìn)一步測序證實(shí)重組質(zhì)粒中LaCPR1(ΔN58)和CYP73A進(jìn)行了基因的融合表達(dá)。

(3)合成分別具有序列表中SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12核苷酸序列的兩條引物，在合成的引物SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的5’-端分別設(shè)置NdeI和XhoI兩個酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基序列，以忽地笑的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增CYP73A編碼基因。PCR擴(kuò)增程序同實(shí)施例1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、分離、切膠回收后經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切，利用T4DNA連接酶(購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa))連接同樣經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切的pET28a載體(Novagen)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于添加卡那霉素(終濃度為25μg/mL)的LB平板上。利用通用測序引物對T7和T7ter進(jìn)行菌落PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-CYP73A，菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖10。

實(shí)施例5、LaCPR1和LaCPR1(ΔN58)協(xié)同CYP73A催化反式-肉桂酸合成對-香豆酸

(1)配制培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1L)：31g Na₂HPO₄，15g KH₂PO₄，2.5g NaCl，5.0g NH₄Cl，0.24g MgSO₄，0.01g CaCl₂，10g Glucose，1mL微量元素母液。生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(1L)：31g Na₂HPO₄，15g KH₂PO₄，2.5g NaCl，0.24g MgSO₄，0.01g CaCl₂，20g Glucose，1mL微量元素母液。微量元素母液配方為(1L)：0.15mM(NH4)₆Mo₇O₂₄，20.0mM H₃BO₃，1.5mM CoCl₂，0.5mM CuSO₄，4.0mM MnCl₂，0.5mM ZnSO₄，100mM HCl。

(2)將重組質(zhì)粒pET28a-LaCPR1、pET28a-CYP73A、pET28a-LaCPR1-CYP73A和pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Rosseta(DE3)細(xì)胞，獲得重組菌株Rosseta(DE3)/pET28a-LaCPR1、Rosseta(DE3)/pET28a-CYP73A、Rosseta(DE3)/pET28a-LaCPR1-CYP73A和Rosseta(DE3)/pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A，分別命名為菌株EcR-LaCPR1、EcR-CYP73A、EcR-LaCPR1-CYP73A和EcR-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A。每個菌株各挑取單克隆接種添加卡那霉素(終濃度為25μg/ml)的LB培養(yǎng)基于37℃、200rpm過夜培養(yǎng)。

(3)將過夜培養(yǎng)菌液按100倍稀釋于含卡那霉素(終濃度為25μg/mL)的50mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待菌液生長至600nm波長下吸光度為0.6-0.8時，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(終濃度為0.1mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)時間為12h，誘導(dǎo)溫度為25℃。

(4)收集誘導(dǎo)12h的細(xì)菌培養(yǎng)液于8000rpm、4℃離心5min，棄上清后用40mL生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基洗滌菌體1次。菌體用40ml生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸后全部轉(zhuǎn)移到250ml無菌三角瓶中，加入反式-肉桂酸(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)二甲基亞砜(DMSO)母液至終濃度為100μM，于25℃、250rpm震蕩培養(yǎng)60h。

(5)取生物轉(zhuǎn)化液1ml于4℃凍融，加入等體積的甲醇，振蕩混勻。室溫下，12000rpm，離心5min。取上清用0.22μm孔徑濾膜過濾，濾液上樣高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行分析。分析條件為：采用LC-20A高效液相色譜儀(島津，日本)，InertSustain C18色譜柱(5μm，4.6mm×250mm)，30℃柱溫，二極管陣列檢測器，278nm和314nm波長，10μl進(jìn)樣量，1.5％(v/v)乙酸水溶液為流動相A，100％乙腈為流動相B，0.9mL/min流速，梯度洗脫。分析結(jié)果如圖11，結(jié)果表明：LaCPR1和CYP73A單獨(dú)存在時并不能夠催化底物反式-肉桂酸合成產(chǎn)物對-香豆酸；只有在LaCPR1或LaCPR1(ΔN58)的存在下，CYP73A才能夠催化底物反式-肉桂酸合成產(chǎn)物對-香豆酸?？梢岳斫鉃椋琇aCPR1和LaCPR1(ΔN58)具有細(xì)胞色素P450還原酶活性，可用于傳遞電子給細(xì)胞色素P450酶并協(xié)助細(xì)胞色素P450酶對底物的轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物的合成。

實(shí)施例6、重組大腸桿菌Ec31884-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A-PAL的構(gòu)建

(1)合成分別具有序列表中SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14核苷酸序列的兩條引物，以忽地笑的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)編碼基因。PCR擴(kuò)增程序為：95℃ 5min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃3.5min，共30個循環(huán)；72℃ 10min，降至10℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、回收。回收獲得的DNA片段兩端分別帶有25bp與pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A載體XhoI酶切位點(diǎn)兩端同源的序列，并且PAL基因起始密碼子上游12bp處添加了核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)序列(AGGAG)。利用XhoI限制性內(nèi)切酶(購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa))將pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A載體線性化。利用One-step cloning試劑盒(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)按照產(chǎn)品說明書將CYP73A編碼基因?qū)雙ET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A載體的XhoI酶切位點(diǎn)中，利用合成的具有序列表中SEQ ID NO：13核苷酸序列的引物與通用測序引物T7ter進(jìn)行菌落PCR驗證，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A-rbsPAL，結(jié)果如圖12。進(jìn)一步測序證實(shí)重組質(zhì)粒中PAL與LaCPR1(ΔN58)-CYP73A形成了多順反子基因結(jié)構(gòu)。

(2)利用λDE3溶原化試劑盒(購自Novagen)按照試劑盒說明書操作，將λDE3原噬菌體插入到大腸桿菌苯丙氨酸生產(chǎn)菌株ATCC31884(購自ATCC)基因組中，獲得溶原化的宿主菌株大腸桿菌ATCC31884(DE3)。

(3)將重組質(zhì)粒pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A-rbsPAL轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌ATCC31884(DE3)細(xì)胞，獲得重組菌株ATCC31884(DE3)/pET28a-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A-rbsPAL，命名為菌株Ec31884-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A-PAL。

實(shí)施例7、重組大腸桿菌Ec31884-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A-PAL發(fā)酵合成對-香豆酸

(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)：31g Na₂HPO₄，15g KH₂PO₄，2.5g NaCl，5.0g NH₄Cl，0.24g MgSO₄，0.01g CaCl₂，30g Glucose，1mL微量元素母液。微量元素母液配方同實(shí)施例5。

(2)挑取菌株Ec31884-LaCPR1(ΔN58)-CYP73A-PAL單克隆接種添加卡那霉素(終濃度為25μg/ml)的LB培養(yǎng)基于37℃、200rpm過夜培養(yǎng)。

(3)將過夜培養(yǎng)菌液按100倍稀釋于含卡那霉素(終濃度為25μg/mL)的50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待菌液生長至600nm波長下吸光度為0.6-0.8時，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(終濃度為0.1mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)。培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?5℃，發(fā)酵時間為72h。

(4)取發(fā)酵液1ml于4℃凍融，加入等體積的甲醇，振蕩混勻。室溫下，12000rpm，離心5min。取上清用0.22μm孔徑濾膜過濾，濾液上樣高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行分析。分析條件同實(shí)施例5。分析結(jié)果如圖13，結(jié)果表明：所構(gòu)建的大腸桿菌菌株能夠合成對-香豆酸，產(chǎn)物的量為400mg/L?？梢岳斫鉃椋谀軌蚝铣蒀YP450酶的底物及其上游代謝產(chǎn)物的微生物菌株，LaCPR1(ΔN58)具有細(xì)胞色素P450還原酶活性，可用于傳遞電子給細(xì)胞色素P450酶并協(xié)助CYP450酶對底物的轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物的合成。

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