本發(fā)明屬于水產(chǎn)食品加工
技術領域：
，具體涉及一種淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法。
背景技術：
：體內自由基代謝失衡累積過多的自由基，引起機體氧化應激，導致機體組織和細胞的氧化損傷，誘發(fā)各種慢性疾病。抗氧化劑通過清除自由基、調節(jié)機體內各類抗氧化物質的功能活性，調整和改善人體生理功能，從而達到預防和治療慢性疾病的目的。商用抗氧化劑多是合成化合物，如BHT、BHA，雖抗氧化效果良好，但長期使用對人體肝、脾等具有不利影響，其應用受到極大的限制。因此逐步轉向關注從各種動植物中分離天然抗氧化劑，其需求日益高漲。食品蛋白源抗氧化肽是非酶類自由基清除劑，具有低毒、高效、易吸收等特點，在食品、制藥和化妝品行業(yè)中具有極大的利用價值和廣泛的應用前景。隨著肽轉運載體(Peptidetransporter1，PepT1)的發(fā)現(xiàn)及多肽吸收轉運機制的深入研究，表明小分子活性肽才可被人體小腸上皮細胞吸收利用。我國是淡水漁業(yè)大國，養(yǎng)殖產(chǎn)量位居全球榜首。淡水魚具有豐富的營養(yǎng)價值，是優(yōu)質的蛋白質資源。目前對于魚蛋白加工利用，已采用化學法和酶法制備水解物。化學法用酸和堿處理魚蛋白，得到的水解物感官和功能活性都不理想。而酶法制備的水解物具有良好的功能活性而備受關注。但現(xiàn)有的酶法生產(chǎn)的魚蛋白水解物，由于原料中存在促氧化劑如肌紅蛋白，以及磷脂膜中的不穩(wěn)定脂質成分，影響水解效率且易導致活性肽被氧化而失活的問題；且水解物多為長鏈多肽，不能被肽轉運載體(PepT1)識別和轉運吸收，難以在體內發(fā)揮抗氧化功能。技術實現(xiàn)要素：本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。鑒于上述和/或現(xiàn)有的制備淡水魚抗氧化活性多肽的技術空白，提出了本發(fā)明。因此，本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有技術中的不足，提供一種抗氧化活性高的淡水魚抗氧化活性多肽的制備方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了如下技術方案：一種淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法，包括，預處理，將淡水魚魚糜與NaCl溶液混合，均質攪拌離心后取沉淀，加入CaCl2和檸檬酸混合液，均質攪拌離心后取沉淀凍干，得到預處理后的魚糜；制備魚蛋白酶解物，對預處理后的魚糜進行堿性蛋白酶酶解、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解，離心收集上清液凍干，得到魚蛋白酶解物；制備抗氧化物活性肽，將制得的蛋白酶解物溶解于水，逐級過濾膜，將透過液凍干，得到淡水魚抗氧化物活性肽。作為本發(fā)明所述淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述NaCl溶液質量濃度0.2％～1.0％，其添加質量為魚糜質量的2～5倍。作為本發(fā)明所述淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述CaCl2和檸檬酸混合液包括5～10mmol/LCaCl2和1～10mmol/L檸檬酸溶液，其添加量為魚糜質量的2～5倍。作為本發(fā)明所述淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述均質攪拌離心，其是在10000～13000rpm下均質1～3min，以200～1000rpm攪拌30～60min，在4000～10000×g下離心10～15min。作為本發(fā)明所述淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述離心收集上清液，其中，離心條件為在4000～10000×g下離心10～15min。作為本發(fā)明所述淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述逐級過濾膜，其是分別過分子截留量為10、5、3及1kDa的超濾膜，再過200～300Da的納濾膜，作為本發(fā)明所述淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述堿性蛋白酶酶解，其是向預處理后的魚糜加入魚糜質量15～25倍的水，均質后調節(jié)魚漿液pH為6.0～8.5，調節(jié)溫度為50～60℃，添加占魚糜質量0.67％～2％的堿性蛋白酶，在50～60℃條件酶解1～3h，然后調節(jié)酶解液pH為5.0～5.5終止堿性蛋白酶酶解反應。作為本發(fā)明所述淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述胃蛋白酶酶解，其是添加魚糜質量20～40倍的30～40mmol/LNaCl，調節(jié)混合液pH為1.5～2.0，調節(jié)溫度為35～40℃，添加占魚糜質量3.3％～10％的胃蛋白酶，在35～40℃酶解0.5～1.5h，然后調節(jié)pH至7.0～7.5終止胃蛋白酶酶解反應。作為本發(fā)明所述淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解，其是添加魚糜質量100～150倍的磷酸鈉緩沖溶液，最終保持磷酸鈉緩沖溶液濃度為0.01～0.05mol/L，pH為6.0～7.0，添加占魚糜質量0.67％～2％的胰蛋白酶，添加占魚糜質量0.67％～2％的糜蛋白酶，在35～40℃酶解1～3h，在95～100℃下保溫5～10min終止酶解反應，然后冷卻至室溫。作為本發(fā)明所述淡水魚抗氧化物活性肽的制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述胰蛋白酶，其酶活為2200～3000U/mg；所述糜蛋白酶，其酶活為700～1000U/mg；所述堿性蛋白酶，其酶活為150～300U/mg；所述胃蛋白酶，其酶活為1100～1400U/mg。本發(fā)明所具有的有益效果：(1)本發(fā)明制備的預處理操作除去了魚肉中的肌紅蛋白85.1％，以及磷脂膜中磷脂72.2％。(2)本發(fā)明制備的淡水魚蛋白酶解物為白色，而未處理魚肉制備的酶解物為淡黃色。預處理魚肉酶解物具有很好的白度，提升了1.12倍。(3)本發(fā)明制備的淡水魚蛋白酶解物具有很好的抗氧化功能活性，與未處理魚肉制備的酶解物相比，預處理魚肉制備的酶解物的ABTS自由基清除活性和ORAC值分別增強了1.72倍和1.73倍，其中淡水魚蛋白抗氧化肽(<1kDa)的ABTS自由基清除活性和ORAC值最高，分別為5263.78±77.64μmolTE/gprotein和446.55±15.32μmolTE/gprotein。(4)本發(fā)明淡水魚蛋白酶解物小于1kDa的組分高達83.16％，其中591Da肽占26.92％，233Da肽占42.34％。(5)本發(fā)明淡水魚蛋白酶解物和抗氧化肽是以天然產(chǎn)物為原料，所得產(chǎn)品安全、無毒、無腥味和泥土味，溶解性好，能被人體吸收利用且感官品質優(yōu)良，能廣泛應用于功能食品中。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。其中：圖1為實施例1中魚蛋白酶解物超濾前的分子量分布，由圖可知，魚蛋白酶解物主要成分為小于1kDa的多肽，高達83.16％；其中591Da肽占26.92％，233Da肽占42.34％。圖2為實施例1中魚肉酶解物超濾前后各組分的抗氧化活性，由圖可知，<1kDa的抗氧化肽的ABTS自由基清除活性和ORAC值最高，說明了本發(fā)明制備的魚肉蛋白酶解物和抗氧化肽具有良好的抗氧化活性。具體實施方式為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結合具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發(fā)明內涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。其次，此處所稱的“一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn)方式中的特定特征、結構或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。實施例1按照如下方法進行：(1)預處理：取草魚魚肉100g，加入300mL0.4％氯化鈉溶液，10000r/min均質1min后，以1000rpm磁力攪拌1h，10,000×g離心15min去除上清液，收集沉淀；加入8mmol/L氯化鈣和5mmol/L檸檬酸溶液，10000r/min均質1min后，以1000rpm磁力攪拌1h，10000×g離心15min去除上清液，收集沉淀凍干(-40℃下凍干48h)，得到預處理的魚糜。(2)酶解：向步驟(1)所得的預處理魚糜5g中添加100mL水，均質制備魚漿，用1mol/LNaOH調節(jié)魚漿液pH為6.5，調節(jié)溫度為55℃，添加堿性蛋白酶(酶活為200U/mg)50mg，在55℃條件酶解2h。隨后調節(jié)酶解液pH為5.0左右終止堿性蛋白酶酶解反應，添加模擬胃液150mL(35mmol/LNaCl，HCl調至pH1.6)，調節(jié)酶解液pH為1.6，并調節(jié)溫度為37℃，添加胃蛋白酶(酶活為1200U/mg)250mg，在37℃酶解1h，調節(jié)pH至7.0終止胃蛋白酶酶解反應；加入模擬腸液750mL(終濃度為0.02mol/L的磷酸鈉緩沖溶液，pH6.5)，添加胰蛋白酶(酶活為2500U/mg)和糜蛋白酶(酶活為800U/mg)各50mg，在37℃酶解2h。酶解結束后，在100℃下保溫10min，滅酶活終止酶解反應，冷卻至室溫，在10000×g下離心15min，收集上清液，凍干(-40℃下凍干48h)得到淡水魚肉蛋白酶解物。(3)超濾分離脫鹽：將步驟(2)所得的凍干酶解物用超純水溶解制備超濾溶液，利用分子截留量為10、5、3和1kDa的超濾膜將步驟(2)所得的上清液依次進行超濾，收集超濾的透過液，再用200Da的納濾膜進行脫鹽濃縮，收集納濾的截留液，凍干(-40℃下凍干48h)得到淡水魚肉抗氧化肽。此為樣品1，經(jīng)感官評價得，無泥土與魚腥味。實施例2按照如下方法進行：(1)預處理：取青魚魚肉100g，加入200mL0.2％氯化鈉溶液，10000r/min均質1min后，以1000rpm磁力攪拌1h，10000×g離心15min去除上清液，收集沉淀；加入10mmol/L氯化鈣和1mmol/L檸檬酸溶液，10,000r/min均質1min后，以1000rpm磁力攪拌1h，10,000×g離心15min去除上清液，收集沉淀凍干(-40℃下凍干48h)，得到預處理的魚糜。(2)酶解：向步驟(1)所得的預處理魚糜5g中添加120mL水，均質制備魚漿，用1mol/LNaOH調節(jié)魚漿液pH為7.0，調節(jié)溫度為57℃，添加堿性蛋白酶(酶活為200U/mg)65mg，在57℃條件酶解3h。隨后調節(jié)酶解液pH為5.0左右終止堿性蛋白酶酶解反應，添加模擬胃液130mL(35mmol/LNaCl，HCl調至pH2.0)，調節(jié)酶解液pH為2.0，并調節(jié)溫度為35℃，添加胃蛋白酶(酶活為1200U/mg)200mg，在35℃酶解1.5h，調節(jié)pH至7.0終止胃蛋白酶酶解反應；加入模擬腸液700mL(終濃度為0.03mol/L的磷酸鈉緩沖溶液，pH6.8)，添加胰蛋白酶(酶活為2500U/mg)和糜蛋白酶(酶活為800U/mg)各65mg，在35℃酶解3h。酶解結束后，在100℃下保溫10min，滅酶活終止酶解反應，冷卻至室溫，在10000×g下離心15min，收集上清液，凍干(-40℃下凍干48h)得到淡水魚肉蛋白酶解物。(3)超濾分離脫鹽：利用分子截留量為10、5、3和1kDa的超濾膜將步驟(2)所得的上清液依次進行超濾，收集超濾的透過液，再用200Da的納濾膜進行脫鹽濃縮，收集納濾的截留液，凍干(-40℃下凍干48h)得到淡水魚肉抗氧化肽。此為樣品2，經(jīng)感官評價得，無泥土與魚腥味。實施例3按照如下方法進行：(1)預處理：取鳙魚魚肉100g，加入500mL1.0％氯化鈉溶液，13000r/min均質2min后，以200rpm磁力攪拌45min，4000×g離心15min去除上清液，收集沉淀；加入5mmol/L氯化鈣和10mmol/L檸檬酸溶液，13000r/min均質2min后，以200rpm磁力攪拌45min，4000×g離心15min去除上清液，收集沉淀凍干(-40℃下凍干48h)，得到預處理的魚糜。(2)酶解：向步驟(1)所得的預處理魚糜5g中添加100mL水，均質制備魚漿，用1mol/LNaOH調節(jié)魚漿液pH為6.5，調節(jié)溫度為55℃，添加堿性蛋白酶(酶活為250U/mg)50mg，在55℃條件酶解2h。隨后調節(jié)酶解液pH為5.0左右終止堿性蛋白酶酶解反應，添加模擬胃液150mL(35mmol/LNaCl，HCl調至pH1.6)，調節(jié)酶解液pH為1.6，并調節(jié)溫度為37℃，添加胃蛋白酶(酶活為1300U/mg)250mg，在37℃酶解1h，調節(jié)pH至7.0終止胃蛋白酶酶解反應；加入模擬腸液750mL(終濃度為0.02mol/L的磷酸鈉緩沖溶液，pH6.5)，添加胰蛋白酶(酶活為2200U/mg)和糜蛋白酶(酶活為900U/mg)各50mg，在37℃酶解2h。酶解結束后，在100℃下保溫10min，滅酶活終止酶解反應，冷卻至室溫，在4000×g下離心15min，收集上清液，凍干(-40℃下凍干48h)得到淡水魚肉蛋白酶解物。(3)超濾分離脫鹽：將步驟(2)所得的凍干酶解物用超純水溶解制備超濾溶液，利用分子截留量為10、5、3和1kDa的超濾膜將步驟(2)所得的上清液依次進行超濾，收集超濾的透過液，再用200Da的納濾膜進行脫鹽濃縮，收集納濾的截留液，凍干(-40℃下凍干48h)得到淡水魚肉抗氧化肽。此為樣品3，經(jīng)感官評價得，無泥土與魚腥味。實施例4(1)酶解：未預處理的凍干魚糜5g中添加100mL水，均質制備魚漿，用1mol/LNaOH調節(jié)魚漿液pH為6.5，調節(jié)溫度為55℃，添加堿性蛋白酶50mg，在55℃條件酶解2h。隨后調節(jié)酶解液pH為5.0左右終止堿性蛋白酶酶解反應，添加模擬胃液150mL(35mmol/LNaCl，HCl調至pH1.6)，調節(jié)酶解液pH為1.6，并調節(jié)溫度為37℃，添加胃蛋白酶250mg，在37℃酶解1h，調節(jié)pH至7.0終止胃蛋白酶酶解反應；加入模擬腸液750mL(終濃度為0.02mol/L的磷酸鈉緩沖溶液，pH6.5)，添加胰蛋白酶和糜蛋白酶各50mg，在37℃酶解2h。酶解結束后，在100℃下保溫10min，滅酶活終止酶解反應，冷卻至室溫，在10,000×g下離心15min，收集上清液，凍干(-40℃下凍干48h)得到淡水魚肉蛋白酶解物。(2)超濾分離脫鹽：利用分子截留量為10、5、3和1kDa的超濾膜將步驟(1)所得的上清液依次進行超濾，收集超濾的透過液，再用200Da的納濾膜進行脫鹽濃縮，收集納濾的截留液，凍干(-40℃下凍干48h)得到淡水魚肉抗氧化肽。此為樣品4，經(jīng)感官評價得，略有泥土與魚腥味。實施例5實驗樣品：實施例1凍干魚糜、實施例4凍干魚糜。實驗方法：(1)肌紅蛋白含量測定：取魚糜樣品1.0g，添加預冷的20mL0.04mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)，在11,500rpm均質1min，隨后在4℃，10,000g下離心15min，上清用濾紙過濾后測525nm處吸光度值。肌紅蛋白摩爾吸光系數(shù)為7.6×10-3，分子量為16,110Da。含量表達為g/kg干樣。(2)磷脂含量測定：磷脂含量測定采用鉬酸藍比色法測磷含量，稱取20mg魚糜樣品于消化管中，添加50mg催化劑(硫酸銅：硫酸鉀＝1:4，w/w)、2mL雙蒸水、1mL濃硫酸，置于消化爐上消化完全，冷卻后定容至50mL。取消化液3mL，定磷試劑(6mol/L硫酸：雙蒸水：25％鉬酸銨：10％抗壞血酸＝1:2:1:1，v/v)3mL，45℃水浴20min后測660nm處吸光度值。磷含量轉化為磷脂的轉化系數(shù)為25。結果見表1，與實施例4凍干魚糜相比，實施例1凍干魚糜中肌紅蛋白(促氧化劑)和磷脂膜中的磷脂含量分別降低了85.1％和72.2％。表1本發(fā)明中預處理操作的實驗效果樣品肌紅蛋白含量(g/kg干樣)磷脂含量(g/kg干樣)實施例1凍干魚糜2.04±0.1864.50±0.23實施例4凍干魚糜13.73±0.50232.36±0.45實施例6試驗樣品：取實施例1～4制得的魚肉蛋白酶解物。試驗方法：(1)ABTS自由基清除活性：取7mmol/L的ABTS溶液5mL和140mmol/L過硫酸鉀溶液88μL混合并在室溫條件下避光12～16h，作為儲備液。用含0.15mol/LNaCl的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稀釋儲備液，至734nm波長吸光度為0.70±0.02，作為試驗試劑。取4mL試驗試劑，加入40μL樣品(2mg/mL)或Trolox，室溫避光反應6min后在734nm波長處測定吸光度?？瞻讓φ沼昧姿猁}緩沖液。0～10mmol/LTrolox繪制標準曲線。(2)氧自由基吸收能力(ORAC)測定：取78nmol/L的熒光素鈉溶液60μL，60μL的樣品或75mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)或Trolox充分混合，然后在37℃溫育15min，再加入221mmol/L的AAPH溶液30μL。用酶標儀每3min讀取熒光值共進行2h。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是485nm和535nm。磷酸鹽緩沖液代替樣品作為空白(blank)，熒光值為含有AAPH的相對熒光強度與不含AAPH的相對熒光強度之比。使用0～25μΜTrolox繪制熒光淬滅標準曲線，并計算熒光淬滅曲線下的積分面積(AUC)。AUC的計算公式如下：ORAC(μmolTE/gprotein)＝[CTrolox×(AUCsample-AUCblank)]/[Csample×(AUCTrolox-AUCblank)]其中CTrolox為Trolox濃度(25μΜ)，Csample為樣品濃度(0.5mg/mL)AUC＝0.5×[2×(f0+f1+...+fn-1+fn)-f0-fn]×Δtf0為起始熒光值，fn為時間n下熒光值，Δt為間隔時間。結果見表2。表2樣品1～4的抗氧化活性實驗效果實施例7使用高效凝膠排阻色譜法進行分子量分布情況分析，使用TSK-GelG2000SWXL色譜柱(7.8mm×300mm)。實施例1中蛋白酶解物(超濾前)用40％乙腈溶液(內含0.1％三氟乙酸)溶解至4mg/mL，0.22μm濾膜過濾后取10μL上樣，使用同樣的溶液進行洗脫，柱溫為30℃，流速為0.5mL/min，檢測220nm洗脫圖譜。使用細胞色素C(MW12384)、桿菌酶(MW1422)、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(MW451)和乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(MW189)標準品作分子量校正曲線。由圖1可知，本發(fā)明淡水魚蛋白酶解物小于1kDa的組分高達83.16％，其中591Da肽占26.92％，233Da肽占42.34％。對實施例1各分子量的魚蛋白抗氧化肽進行抗氧化活性實驗，得圖2，由圖2可知，本發(fā)明所制得的淡水魚蛋白抗氧化肽，其中分子量小于1kDa的ABTS自由基清除活性和ORAC值最高，分別為5263.78±77.64μmolTE/gprotein和446.55±15.32μmolTE/gprotein。實施例8使用色差儀(UltraScanPro1166)測定蛋白酶解物的色差值(L*值、a*值和b*值)。由表3可知，實施例1制得的蛋白酶解物為白色，實施例4制得的蛋白酶解物為淡黃色。預處理后酶解物白度提升了1.12倍。表3本產(chǎn)品蛋白酶解物色差值實施例9為測定制得的魚肉蛋白抗氧化肽的溶解性，分別取樣品1～4各100mg在室溫下分散在10mL去離子水中，使用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH將溶液的pH調整為3、4、5、6、7、8，將該溶液在8900×g下離心15min。采用雙縮脲法測定上清液中的蛋白質含量。樣品中總蛋白含量測定是將樣品溶解在0.5mol/L的NaOH溶液中進行測定的。溶解度(％)＝上清液中的蛋白質含量/樣品中總蛋白含量實驗結果如下表。由此而可見，本發(fā)明制備的預處理操作除去了魚肉中的肌紅蛋白85.1％，以及磷脂膜中磷脂72.2％；本發(fā)明制備的淡水魚蛋白酶解物為白色，而未處理魚肉制備的酶解物為淡黃色。預處理魚肉酶解物具有很好的白度，提升了1.12倍；本發(fā)明制備的淡水魚蛋白酶解物具有很好的抗氧化功能活性，與未處理魚肉制備的酶解物相比，預處理魚肉制備的酶解物的ABTS自由基清除活性和ORAC值分別增強了1.72倍和1.73倍，其中淡水魚蛋白抗氧化肽(<1kDa)的ABTS自由基清除活性和ORAC值最高，分別為5263.78±77.64μmolTE/gprotein和446.55±15.32μmolTE/gprotein；本發(fā)明淡水魚蛋白酶解物小于1kDa的組分高達83.16％，其中591Da肽占26.92％，233Da肽占42.34％；本發(fā)明淡水魚蛋白酶解物和抗氧化肽是以天然產(chǎn)物為原料，所得產(chǎn)品安全、無毒、無腥味和泥土味、溶解性好，能被人體吸收利用且感官品質優(yōu)良，能廣泛應用于功能食品中。應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。當前第1頁1 2 3