本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及利用HLA-G氨基酸序列的抗原片段制備廣譜疫苗的應(yīng)用及方法，該廣譜疫苗可用于預(yù)防人體或動物體的腫瘤和病毒引起的疾病。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類健康和生命的主要疾病之一，其發(fā)病率逐年增高并且趨向年輕化。據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年報告，當(dāng)時全球腫瘤患者每年死亡人數(shù)高達(dá)660萬，預(yù)計到2020年全球腫瘤患者將達(dá)到1500萬。最新統(tǒng)計資料顯示，近20年來，中國每4至5個死亡者中就有一個死于癌癥，癌癥已成為人類第一殺手。
腫瘤來勢洶涌，人心惶惶，在治療腫瘤有效藥物研制成功之前，預(yù)防腫瘤成為極大的健康需求。然而目前全世界尚未有效的預(yù)防腫瘤的技術(shù)，研發(fā)預(yù)防腫瘤先進(jìn)的方法和技術(shù)是及其迫切的任務(wù)。
新的病毒或未知病毒不斷出現(xiàn)，一次又一次地給人類帶來嚴(yán)重災(zāi)害。雖然人類尚未研制出治療病毒感染的有效藥物，但是如何預(yù)防病毒感染，特別是預(yù)防未知病毒或所有病毒的感染更為重要。盡管人類研制出預(yù)防某些病毒的疫苗，但是研制預(yù)防未知病毒或所有病毒的廣譜疫苗尤其重要，至今未人涉足。如果能研制出預(yù)防未知病毒或所有病毒的疫苗，將能抗拒未知病毒或所有病毒對人類的襲擊。人類期盼預(yù)防未知病毒或所有病毒的疫苗早日問世。
HLA-G是非經(jīng)典的HLA I類分子。HLA-G于1987年由Geraghty等克隆并證實。HLA-G分子具有直接抑制多種免疫活性細(xì)胞的生物功能，是機(jī)體一個重要的免疫耐受分子，在母胎免疫、腫瘤免疫、移植免疫、自身免疫、及感染免疫中發(fā)揮十分重要的作用。研究證實，在腫瘤免疫中，HLA-G能夠抑制NK細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，使機(jī)體的免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)。由于HLA-G對機(jī)體的免疫抑制作用，使腫瘤細(xì)胞能夠逃脫機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)控，實現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，腫瘤細(xì)胞獲得了自由瘋狂生長的機(jī)會。
腫瘤切片的免疫組化染色結(jié)果表明，在喉癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌等多種惡性腫瘤組織中都能表達(dá)HLA-G。另外，在HBsAg、HCAg、HIV、SARS、埃博拉、寨卡等病毒攜帶者的血液樣本中，HLA-G的檢測結(jié)果均呈陽性。說明HLA-G在腫瘤組織和病毒性疾病的血液中的表達(dá)具有普遍性，使得HLA-G有望成為所有腫瘤細(xì)胞和病毒的共同靶標(biāo)，并有望作為免疫原在預(yù)防腫瘤和病毒性疾病方面發(fā)揮作用。但是，采用HLA-G全分子制備廣譜疫苗需要經(jīng)過基因雜交、表達(dá)、純化等多道復(fù)雜工序，上游工作量大且成本高昂，不利于疫苗的普及生產(chǎn)和應(yīng)用。
免疫原的決定簇部位決定著抗原物質(zhì)在免疫應(yīng)答中的特異性，每個免疫原分子中均存在有多種或多個決定簇，這些源自腫瘤或病毒性疾病相關(guān)的HLA-G分子的決定簇均有望以多肽片段的形式作為免疫原性肽被應(yīng)用于肽疫苗的活性藥物成分之中。但是，由于免疫應(yīng)答細(xì)胞對不同特定部位的決定簇具有不同程度的親和性，并且免疫原性肽的多肽片段在形成疫苗的過程中也可能隨著結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的降低而導(dǎo)致免疫原性降低，目前已知的HLA-G分子抗原決定簇并不能為制備廣譜疫苗提供準(zhǔn)確有效的應(yīng)用信息。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明首先提供了一種抗原片段，包括下述至少一種氨基酸序列：
(1)YW EEE TRN TKA HA(SEQ ID NO:1)；
(2)RGY YNQ SEA SSH TL(SEQ ID NO:2)；
(3)PPK THV THH PVFD(SEQ ID NO:3)；
(4)PLM LRW KQS SL(SEQ ID NO:4)。
其中，所述抗原片段與HLA-G氨基酸序列中任意一段包含至少一種上述氨基酸序列(SEQ ID NO:1-4)的多肽片段、或該多肽片段的同源物、類似物或衍生物的序列相同。該抗原片段的序列可以是人工合成的；也可以優(yōu)選的是將HLA-G氨基酸序列通過各種方式的縮短剪切而獲得的，該HLA-G氨基酸序列可以是對天然序列經(jīng)人工分離、或通過基因重組及表達(dá)的人工合成等方式而獲得。
進(jìn)一步，所述HLA-G氨基酸序列包括HLA-G分子各異構(gòu)體氨基酸序列、以及該HLA-G分子各異構(gòu)體氨基酸序列的保守性變體、生物活性片段或衍生物。目前，已知的HLA-G天然分子具有7種異構(gòu)體，這7中異構(gòu)體中具有4種不同的氨基酸序列(SEQ ID NO:5-8)，該4種不同的氨基酸序列(SEQ ID NO:5-8)均可作為所述HLA-G氨基酸序列的一種優(yōu)選的選擇。
進(jìn)一步，所述HLA-G氨基酸序列與氨基酸序列SEQ ID NO:5-8之一具有至少15％的同源性，優(yōu)選為至少具有35％的同源性，還優(yōu)選為至少具有60％、70％、80％或90％的同源性，更優(yōu)選為至少具有95％、96％、97％、98％、99％的同源性。
進(jìn)一步，所述抗原片段優(yōu)選為序列SEQ ID NO:1-4之一。
進(jìn)一步，所述抗原片段優(yōu)選為序列SEQ ID NO:9-12之一。
本發(fā)明還要求保護(hù)上述抗原片段在制備預(yù)防腫瘤和病毒病的廣譜疫苗中的應(yīng)用。
其中，所述腫瘤和病毒病包括能夠表達(dá)HLA-G的所有腫瘤和病毒性疾病，包括未知腫瘤和病毒。這些腫瘤包括：(1)來源于上皮組織的鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、惡性多形性腺瘤和移行上皮癌等；(2)來源于間葉組織的纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞癌、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、滑膜肉瘤和惡性間皮瘤等；(3)來源于淋巴造血組織的淋巴瘤和白血病等；(4)來源于神經(jīng)組織的神經(jīng)纖維肉瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、惡性腦膜瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等；(5)來源于消化道的食管鱗癌細(xì)胞瘤、食管腺癌細(xì)胞瘤、胃癌腺瘤、胃鱗癌、肝細(xì)胞瘤、直腸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌；(6)來源于呼吸道的非小細(xì)胞肺癌；(7)來源于其他組織的黑色素瘤、絨毛膜上皮癌、卵巢癌細(xì)胞瘤、喉癌、乳腺癌、精原細(xì)胞瘤、前列腺癌、宮頸癌、無性細(xì)胞瘤、胚胎性癌和惡性畸胎瘤等。這些病毒包括：(1)雙鏈DNA病毒中痘病毒科、虹彩病毒科、桿狀病毒科、皰疹病毒科、腺病毒科、乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、多DNA病毒科、囊泡病毒科、非州豬瘟病毒科等；(2)單鏈DNA病毒中的聯(lián)體病毒科、環(huán)病毒科、細(xì)小病毒科等；(3)DNA和RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒中的嗜肝DNA病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、假病毒科、轉(zhuǎn)座病毒科等；(4)雙鏈RNA病毒中的呼腸孤病毒科、雙RNA病毒科、雙組分雙鏈RNA球狀真菌病毒科、減毒病毒科等；(5)裸露RNA病毒中的裸露RNA病毒科；(6)負(fù)單鏈RNA病毒中的副粘病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、博爾納病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、沙拉病毒科等；(7)正單鏈RNA病毒中的輕小噬菌體科、動脈炎病毒科、冠狀病毒科、小RNA病毒科。
優(yōu)選的，這些腫瘤包括：喉癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌；這些病毒包括：HBsAg、HCAg、HIV、SARS、埃博拉、寨卡、登革熱病毒、禽流感病毒。
進(jìn)一步，所述疫苗通過所述抗原片段在生物體內(nèi)產(chǎn)生能夠與HLA-G結(jié)合的HLA-G抗體而發(fā)揮作用。
本發(fā)明還提供了制備預(yù)防腫瘤和病毒病的廣譜疫苗的方法，包括采用上述抗原片段作為免疫原的步驟。
進(jìn)一步，所述方法還包括將所述抗原片段與載體蛋白結(jié)合成復(fù)合物，然后將復(fù)合物進(jìn)行純化的步驟。
進(jìn)一步，所述抗原片段與載體蛋白的復(fù)合物可以通過采用偶聯(lián)試劑進(jìn)行結(jié)合而獲得，如采用碳化二亞胺、戊二醛和二異氰酸化合物等，也可以通過構(gòu)建融合基因經(jīng)生物體表達(dá)而獲得。
其中，所述載體蛋白優(yōu)選為血藍(lán)蛋白，所述偶聯(lián)試劑優(yōu)選為戊二醛。
本發(fā)明提供的抗原片段(氨基酸序列SEQ ID NO:1-4及至少包含SEQ ID NO:1-4其中之一的其他抗原片段)，具有高度的結(jié)構(gòu)保守性和較高的免疫活性，能夠通過生物體免疫反應(yīng)產(chǎn)生HLA-G抗體(HLA-G特異性抗體)，該HLA-G抗體通過與HLA-G結(jié)合，能夠阻止HLA-G對機(jī)體的免疫抑制作用，切斷腫瘤及病毒免疫逃逸，使腫瘤細(xì)胞及病毒易被人體免疫系統(tǒng)清除和消滅。本發(fā)明提供的抗原片段僅含有低至10個左右的氨基酸殘基，在保持其免疫活性的前提下極大地降低了合成成本和疫苗制備的上游工作量，且由于結(jié)構(gòu)的高度保守性使得其具有不亞于、甚至優(yōu)于一般免疫決定簇序列的結(jié)合效果，從實驗數(shù)據(jù)來看，選用本發(fā)明氨基酸序列SEQ ID NO:1-4之一作為疫苗原材料制備的疫苗，經(jīng)免疫動物后所得抗體的滴度可達(dá)1比10萬以上(ELISA法)。
本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中使用的下列術(shù)語，除非另外說明具有下述一般含義，且下述含義被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)：
“HLA-G氨基酸序列”做廣義理解，不僅理解為包括HLA-G天然分子各異構(gòu)體的氨基酸序列(如SEQ ID NO:5-8)，還理解為包括HLA-G分子各異構(gòu)體氨基酸序列的保守性變體、生物活性片段或衍生物，該HLA-G分子各異構(gòu)體氨基酸序列的保守性變體、生物活性片段或衍生物中包含有序列SEQ ID NO:1-4中至少一種；這些廣義理解的HLA-G氨基酸序列本身或其任意一段包含序列SEQ ID NO:1-4中至少一種的片段均能夠成為本發(fā)明抗原片段的來源，或者，這些廣義理解的HLA-G氨基酸序列本身或其任意一段包含序列SEQ ID NO:1-4中至少一種的片段均具有與本發(fā)明抗原片段相同的氨基酸序列。
“氨基酸序列”僅涉及氨基酸殘基排列的一級結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu))，不擴(kuò)大理解為包含氨基酸序列空間排列的二級及三級結(jié)構(gòu)。
“多肽”泛指具有氨基酸序列的肽鏈，包括寡肽、肽、狹義的多肽(20個氨基酸殘基以上的肽)或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分，可以是糖基化或非糖基化的，氨基酸序列中一個或多個氨基酸殘基可以被修飾或未被修飾。當(dāng)其氨基酸序列涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意味著將氨基酸序列限制為與該天然存在的蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的或完全一致的天然氨基酸或其序列。
“同源”包括完全同源和部分同源，在本發(fā)明具有相對較為廣泛的含義，在描述抗原片段、多肽或氨基酸序列時，指具有相同或相似的結(jié)構(gòu)或功能，或具有相似的氨基酸序列，包括序列的變體、類似物及衍生物；在涉及百分?jǐn)?shù)時，指序列氨基酸殘基的排列上具有一定百分比的相同性。
“類似物”指基本上保持本發(fā)明抗原片段活性的多肽，只要該類似物能夠通過SEQ ID NO:1-4中至少一種產(chǎn)生能夠與HLA-G結(jié)合的HLA-G抗體。本發(fā)明的多肽“類似物”可以包括：(I)在序列中連續(xù)或間隔地插入、缺失、替換一個或多個氨基酸殘基，且所述一個或多個氨基酸殘基的插入、缺失、替換在同一序列中可同時或不同時存在；(II)序列中一個或多個氨基酸殘基的基團(tuán)被其他基團(tuán)替換或缺失；(III)序列中一個或多個氨基酸殘基被修飾。
“衍生物”在描述多肽、蛋白質(zhì)或氨基酸序列時，指由原多肽、蛋白質(zhì)或氨基酸序列衍生而來的關(guān)聯(lián)多肽、蛋白質(zhì)或氨基酸序列。本發(fā)明的多肽、抗原片段或氨基酸序列包含這樣的衍生物：能夠通過SEQ ID NO:1-4中至少一種產(chǎn)生能夠與HLA-G結(jié)合的HLA-G抗體。本發(fā)明“衍生物”的非限定性例子可以包括：(IV)成熟多肽與另一種化合物融合，或者(V)在氨基酸序列中融合或插入附加的氨基酸序列(linker、蛋白質(zhì)純化標(biāo)識序列、酶切位點等)。
“保守”指所涉及的氨基酸序列與原始序列具有較高的相似性或同一性，能夠維持其原始序列基本的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性或功能，一般可以通過相似的氨基酸殘基替換等獲得，例如，賴氨酸和精氨酸、亮氨酸和異亮氨酸之間的替換等。
“變體”指具有一個或多個氨基酸改變的氨基酸序列，所述改變可包括氨基酸序列或核酸序列中氨基酸或核苷酸的插入、缺失或替換。變體可具有保守性改變，其中替換的氨基酸與原氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如亮氨酸和異亮氨酸之間的替換，也可具有非保守性改變。
“生物活性片段”指該片段能夠基本維持其在生物分子中原有的活性和功能，該片段可以同原始片段相同，也可以在原始片段的基礎(chǔ)上發(fā)生改變，改變的部位一般情況下在原始片段的非功能區(qū)或非決定簇區(qū)域(如linker區(qū))的保守性改變(保守性變體)，但不排除發(fā)生非保守性改變的非原始片段，該非原始片段能夠作為通過SEQ ID NO:1-4中至少一種產(chǎn)生HLA-G抗體的本發(fā)明抗原片段的來源，或者，該非原始片段本身或其任意一段包含序列SEQ ID NO:1-4中至少一種的片段均具有與本發(fā)明抗原片段相同的氨基酸序列。
“活性”在描述本發(fā)明的抗原片段或序列SEQ ID NO:1-4之一時，指該抗原片段或序列SEQ ID NO:1-4之一能夠通過人體或動物的免疫反應(yīng)產(chǎn)生可以與HLA-G結(jié)合的HLA-G抗體。
具體實施方式
除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明創(chuàng)造所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。以下實施例中所用的試驗試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下面結(jié)合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明創(chuàng)造。下述實施例中，制備疫苗用的免疫原均市購或通過商用的合成法進(jìn)行合成而獲得。
實施例1
用HLA-G 1、HLA-G 5、HLA-G 7分別作為免疫原制備廣譜疫苗。HLA-G 1、HLA-G5、HLA-G 7為HLA-G分子的三個異構(gòu)體，具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)，其制備疫苗的過程相同，以HLA-G 1為例，疫苗的制備過程如下。
取33mg HLA-G 1溶于50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。HLA-G 1的濃度為660mg/L。將該溶液置于電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌HLA-G 1溶液。然后緩緩加入3ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加1ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調(diào)整溶液的pH值到7.4，經(jīng)無菌過濾后置4℃保存。
實施例2
用HLA-G 2、HLA-G 6分別作為免疫原制備廣譜疫苗。HLA-G 2、HLA-G 6為HLA-G分子的兩個異構(gòu)體，具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)，其制備疫苗的過程相同，以HLA-G 2為例，疫苗的制備過程如下。
取24mg HLA-G 2溶于50ml pH7.4,，0.01M/L PBS溶液中。HLA-G 2的濃度為480mg/L。將該溶液置于電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌HLA-G 2溶液。然后緩緩加入2.1ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.72ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調(diào)整溶液的pH值到7.4，經(jīng)無菌過濾后置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例3
利用HLA-G 3(SEQ ID NO:7)作為免疫原制備廣譜疫苗：取14mg HLA-G 3溶于50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。HLA-G 3的濃度為279mg/L。將該溶液置于電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌HLA-G 3溶液。然后緩緩加入1.3ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.42ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調(diào)整溶液的pH值到7.4，經(jīng)無菌過濾后置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例4
利用HLA-G 4(SEQ ID NO:8)作為免疫原制備廣譜疫苗：取23mg HLA-G 4溶于100ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。HLA-G 4的濃度為459mg/L。將該溶液置于電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌HLA-G 4溶液。然后緩緩加入2.1ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.7ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調(diào)整溶液的pH值到7.4，經(jīng)無菌過濾后置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例5
如果采用兩種或兩種以上HLA-G的異構(gòu)體作為聯(lián)合免疫原制備廣譜疫苗，其操作在實施例1的基礎(chǔ)上把33mg HLA-G 1和3ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液和1ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液中的33mg、3ml、1ml均乘以n，n代表應(yīng)用HLA-G異構(gòu)體的種類數(shù)目。例如兩種異構(gòu)體聯(lián)合作為免疫原，n＝2，三種異構(gòu)體作為聯(lián)合免疫原，n＝3。以此類推。
實施例6
采用SEQ ID NO:1的多肽(小肽)作為免疫原制備廣譜疫苗。把33mg血藍(lán)蛋白溶解在50ml pH7.4，0.01mol的PBS溶液中，在電磁攪拌下，再溶入3.3mg免疫原小肽，繼續(xù)攪拌10分鐘，取5％的戊二醛水溶液，用上述PBS溶液稀釋1000倍，取稀釋后的戊二醛溶液0.15ml，在電磁攪拌器的攪拌下逐滴加到上述溶液中，再繼續(xù)攪拌30分鐘，放置4℃冰箱過夜。
次日將前日制備的溶液過sephadex-G25層析柱，收取280納米吸收峰，去掉未參加結(jié)合的戊二醛及免疫原小肽。然后再過anti-HLA-G親和層析柱，去掉未結(jié)合免疫原小肽的血藍(lán)蛋白，用pH3.5，0.05Mol的甘氨酸-HCL緩沖液解吸血藍(lán)蛋白與免疫原小肽結(jié)合的復(fù)合物，并立刻用0.05Mol NaOH中和該解吸液，經(jīng)適當(dāng)濃縮后再經(jīng)過實施例1的方法處理得到由免疫原小肽制備成的廣譜疫苗。
實施例7
采用SEQ ID NO:2的多肽(小肽)作為免疫原制備廣譜疫苗。把33mg血藍(lán)蛋白溶解在50ml pH7.4，0.01mol的PBS溶液中，在電磁攪拌下，再溶入3.3mg免疫原小肽，繼續(xù)攪拌10分鐘，取5％的戊二醛水溶液，用上述PBS溶液稀釋1000倍，取稀釋后的戊二醛溶液0.15ml，在電磁攪拌器的攪拌下逐滴加到上述溶液中，再繼續(xù)攪拌30分鐘，放置4℃冰箱過夜。
次日將前日制備的溶液過sephadex-G25層析柱,收取280納米吸收峰，去掉未參加結(jié)合的戊二醛及免疫原小肽。然后再過anti-HLA-G親和層析柱，去掉未結(jié)合免疫原小肽的血藍(lán)蛋白，用pH3.5，0.05Mol的甘氨酸-HCL緩沖液解吸血藍(lán)蛋白與免疫原小肽結(jié)合的復(fù)合物，并立刻用0.05Mol NaOH中和該解吸液，經(jīng)適當(dāng)濃縮后再經(jīng)過實施例1的方法處理得到由免疫原小肽制備成的廣譜疫苗。
實施例8
采用SEQ ID NO:3的多肽(小肽)作為免疫原制備廣譜疫苗。由于SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:1的氨基酸數(shù)目相同，均為13個氨基酸，二者分子量相差無幾，因此具體操作同實施例6。
實施例9
采用SEQ ID NO:4的多肽(小肽)作為免疫原制備廣譜疫苗。把33mg血藍(lán)蛋白溶解在50ml pH7.4，0.01mol的PBS溶液中，在電磁攪拌下，再溶入3.3mg免疫原小肽，繼續(xù)攪拌10分鐘，取5％的戊二醛水溶液，用上述PBS溶液稀釋1000倍，取稀釋后的戊二醛溶液0.15ml，在電磁攪拌器的攪拌下逐滴加到上述溶液中，再繼續(xù)攪拌30分鐘，放置4℃冰箱過夜。
次日將前日制備的溶液過sephadex-G25層析柱,收取280納米吸收峰，去掉未參加結(jié)合的戊二醛及免疫原小肽。然后再過anti-HLA-G親和層析柱，去掉未結(jié)合免疫原小肽的血藍(lán)蛋白，用pH3.5，0.05Mol的甘氨酸-HCL緩沖液解吸血藍(lán)蛋白與免疫原小肽結(jié)合的復(fù)合物，并立刻用0.05Mol NaOH中和該解吸液，經(jīng)適當(dāng)濃縮后再經(jīng)過實施例1的方法處理得到由免疫原小肽制備成的廣譜疫苗。
實施例10
采用SEQ ID NO:9的多肽作為免疫原制備廣譜疫苗。取3.3mg免疫原多肽溶于50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。免疫原多肽的濃度為66mg/L。將該溶液置于電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌免疫原多肽的溶液。然后緩緩加入0.3ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.1ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調(diào)整溶液的pH值到7.4，經(jīng)無菌過濾后置4℃保存。
實施例11
采用SEQ ID NO:10的多肽作為免疫原制備廣譜疫苗。取5.3mg免疫原多肽溶于50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。免疫原多肽的濃度為106mg/L。將該溶液置于電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌免疫原多肽溶液。然后緩緩加入0.48ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.16ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調(diào)整溶液的pH值到7.4，經(jīng)無菌過濾后置4℃保存。
實施例12
采用SEQ ID NO:11的多肽作為免疫原制備廣譜疫苗。取5.9mg免疫原多肽溶于50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。免疫原多肽的濃度為119mg/L。將該溶液置于電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌免疫原多肽溶液。然后緩緩加入0.54ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.18ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調(diào)整溶液的pH值到7.4，經(jīng)無菌過濾后置4℃保存。
實施例13
采用SEQ ID NO:12的多肽作為免疫原制備廣譜疫苗。取11.6mg免疫原多肽溶于50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。免疫原多肽的濃度為231mg/L。將該溶液置于電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌免疫原多肽溶液。然后緩緩加入1.1ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.35ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續(xù)攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調(diào)整溶液的pH值到7.4，經(jīng)無菌過濾后置4℃保存。
實施例14致敏家兔預(yù)防腫瘤實驗
實驗組取健康成年家兔9只，分a，b，c3組，每組3只，對照組取正常成年家兔9只，也分成a，b，c3組，每組3只。實驗組用廣譜疫苗免疫。a組用實施例1獲得的疫苗免疫，b組用實施例6獲得的疫苗免疫，c組用實施例10獲得的疫苗免疫，免疫劑量20微克/kg，每10天免疫1次皮下注射，共免疫3次，檢查抗體滴度達(dá)到1:1萬以上(ELISA法)停止免疫。對照組用pH7.4，0.01mol/L PBS對照免疫。每次1毫升，共注射3次。
接種腫瘤細(xì)胞試驗：分別給實驗組和對照組皮下多點接種相同數(shù)量的卵巢癌細(xì)胞株A2780，2000個/ml，3點注射0.5ml。經(jīng)過1-2個月觀察，發(fā)現(xiàn)實驗組均未生長腫瘤，保護(hù)率100％，而對照組卻全部生長了腫瘤。實驗證明利用HLA-G廣譜疫苗對預(yù)防癌癥有效。
實施例15
采用同實施例14相同的方法對其他腫瘤進(jìn)行預(yù)防實驗。實驗過程以及試劑用量可以依據(jù)不同腫瘤模型建立的需要而進(jìn)行常規(guī)調(diào)整，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易實現(xiàn)的。本發(fā)明實施例1-13中獲得的各種疫苗均參與不少于5種腫瘤模型的預(yù)防實驗，實驗結(jié)果均顯示采用本發(fā)明的疫苗免疫后，實驗組家兔均未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長，而對照組家兔均產(chǎn)生腫瘤。
這些腫瘤包括：(1)來源于上皮組織的鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、惡性多形性腺瘤和移行上皮癌等；(2)來源于間葉組織的纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞癌、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、滑膜肉瘤和惡性間皮瘤等；(3)來源于淋巴造血組織的淋巴瘤和白血病等；(4)來源于神經(jīng)組織的神經(jīng)纖維肉瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、惡性腦膜瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等；(5)來源于消化道的食管鱗癌細(xì)胞瘤、食管腺癌細(xì)胞瘤、胃癌腺瘤、胃鱗癌、肝細(xì)胞瘤、直腸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌；(6)來源于呼吸道的非小細(xì)胞肺癌；(7)來源于其他組織的黑色素瘤、絨毛膜上皮癌、卵巢癌細(xì)胞瘤、喉癌、乳腺癌、精原細(xì)胞瘤、前列腺癌、宮頸癌、無性細(xì)胞瘤、胚胎性癌和惡性畸胎瘤等。
實施例16致敏家兔預(yù)防病毒攻擊實驗
實驗組取健康成年家兔9只，分a，b，c3組，每組3只，對照組取正常成年家兔9只。實驗組用廣譜疫苗免疫，其中，a組用實施例2獲得的疫苗免疫，b組用實施例7獲得的疫苗免疫，c組用實施例11獲得的疫苗免疫，檢查抗體滴度達(dá)到1:5萬以上(ELISA法)停止免疫。對照組用pH7.4，0.01mol/L PBS對照免疫。
實驗組和對照組分別接種相同劑量的禽流感病毒(0.05-1.0微克/kg/次)通過滴眼或滴鼻進(jìn)行感染，每日一次，共感染2次，觀察5-20天。統(tǒng)計實驗組和對照組發(fā)病家兔只數(shù)。實驗結(jié)果，實驗組9只家兔全部未能患病保護(hù)率100％，對照組9只家兔全部患病。實驗結(jié)果證實本疫苗具有預(yù)防禽流感病毒感染的功能。
實施例17
采用同實施例16相同的方法對其他病毒進(jìn)行預(yù)防實驗。實驗過程以及試劑用量可以依據(jù)不同病毒感染模型建立的需要而進(jìn)行常規(guī)調(diào)整，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易實現(xiàn)的。本發(fā)明實施例1-13中獲得的各種疫苗均參與不少于5種病毒感染模型的預(yù)防實驗，實驗結(jié)果均顯示采用本發(fā)明的疫苗免疫后，實驗組家兔均未發(fā)現(xiàn)感染病毒，而對照組家兔均感染病毒性疾病。
這些病毒包括：(1)雙鏈DNA病毒中痘病毒科、虹彩病毒科、桿狀病毒科、皰疹病毒科、腺病毒科、乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、多DNA病毒科、囊泡病毒科、非州豬瘟病毒科等；(2)單鏈DNA病毒中的聯(lián)體病毒科、環(huán)病毒科、細(xì)小病毒科等；(3)DNA和RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒中的嗜肝DNA病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、假病毒科、轉(zhuǎn)座病毒科等；(4)雙鏈RNA病毒中的呼腸孤病毒科、雙RNA病毒科、雙組分雙鏈RNA球狀真菌病毒科、減毒病毒科等；(5)裸露RNA病毒中的裸露RNA病毒科；(6)負(fù)單鏈RNA病毒中的副粘病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、博爾納病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、沙拉病毒科等；(7)正單鏈RNA病毒中的輕小噬菌體科、動脈炎病毒科、冠狀病毒科、小RNA病毒科。
以上所述僅為本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明創(chuàng)造，凡在本發(fā)明創(chuàng)造的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。