本發(fā)明涉及生物技術(shù)可再生能源領(lǐng)域，具體為一種厭氧發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)木聚糖酶的方法。

背景技術(shù)：

玉米是我國的主要糧食作物，播種面積廣泛，每年伴隨產(chǎn)生的秸稈數(shù)量也是非常巨大的。目前我國農(nóng)村的大量玉米秸稈資源完全處于高消耗、高污染、低利用率、低產(chǎn)出狀況，玉米秸稈作為能源物質(zhì)沒有得到合理開發(fā)利用。通過厭氧消化處理可將玉米秸稈進(jìn)行資源再生，但現(xiàn)有的厭氧消化技術(shù)存在技術(shù)效率低，推廣難度大的問題。

木聚糖酶系是一類降解木聚糖的酶系，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。木聚糖酶可以應(yīng)用在釀造、飼料工業(yè)中。木聚糖酶可以分解釀造或飼料工業(yè)中的原料細(xì)胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進(jìn)有效物質(zhì)的釋放，以及降低飼料用糧中的非淀粉多糖，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，并因而更易取可溶性脂類成分。木聚糖酶可以將飼料的非淀粉多糖（nsps）分解成較小聚合度的低聚木糖，從而改善飼料性能，消除或降低非淀粉多糖在動(dòng)物腸胃中因粘度較大而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用同時(shí)它可以破壞植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，提高內(nèi)源性消化酶的活性，提高飼料養(yǎng)分的利用。另外，木聚糖酶在造紙、食品和紡織等行業(yè)中的應(yīng)用也較為廣泛。

通過厭氧發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)木聚糖酶，其難點(diǎn)主要集中在木質(zhì)纖維素的水解過程。常見的預(yù)處理木質(zhì)纖維素方法有機(jī)械法、熱處理法、化學(xué)處理，這些都能有效的促進(jìn)厭氧消化，但這些預(yù)處理方法成本高，不環(huán)保。普通的微生物處理也存在較多缺陷，單一微生物處理效果不好，人工構(gòu)件的復(fù)合菌群效果也不理想，各菌種間存在相互拮抗的表現(xiàn)，導(dǎo)致預(yù)處理時(shí)間長，轉(zhuǎn)化效率低，目前尚未有完備的方案進(jìn)行玉米秸稈的厭氧發(fā)酵來生產(chǎn)木聚糖酶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是客服上述技術(shù)的不足，提出一種厭氧發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)木聚糖酶的方法。

本發(fā)明中厭氧發(fā)酵使用的菌種，是從青藏高原天祝牧場全放牧牦牛瘤胃內(nèi)容物中分離的自然共存的厭氧真菌和反芻獸甲烷短桿菌共培養(yǎng)物，piromycesyaktz+m.ruminantium。該共培養(yǎng)物保藏在中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為cgmccno.12952，保藏日期為2016年11月25日，分類命名為：“一株厭氧真菌piromyces與反芻獸甲烷短桿菌（methenobrevibacterruminantium）的共培養(yǎng)物”。

本發(fā)明提供的方法，具體包括如下步驟：

（1）piromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物菌劑的制備

將piromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物菌液以10%（v/v）接種量接種到厭氧培養(yǎng)基中，加入1%（w/v）干燥粉碎的小麥秸稈作為底物，同時(shí)加入復(fù)合抗生素傳代培養(yǎng)，置39℃厭氧培養(yǎng)72h即得到高活力菌劑。

厭氧培養(yǎng)基配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，nahco37.0g，刃天青(1.0g/l)1ml，l-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g，晨飼前采集瘤胃液8000×g，4℃離心20min后的上清170ml，鹽溶液i165ml，鹽溶液ii165ml，蒸餾水定容至1000ml。

鹽溶液i包括nacl6g，(nh4)2so43g，kh2po43g，cacl2·2h2o0.4g，mgso4·2h2o0.6g，蒸餾水定容至1000ml。

鹽溶液ii包括4gk2hpo4，蒸餾水定容至1000ml。

加入秸稈底物后除氧。高溫高壓滅菌。

作為優(yōu)選，復(fù)合抗生素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素，在厭氧培養(yǎng)基的終濃度分別為1600iu/ml和2000iu/ml。

（2）玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶

吸取步驟（1）制備的菌劑，按10%（v/v）接種量接入以1%（w/v）玉米秸稈為底物的與步驟（1）相同的厭氧培養(yǎng)基中，同時(shí)加入復(fù)合抗生素，39℃厭氧培養(yǎng)7天。

作為優(yōu)選，復(fù)合抗生素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素，在厭氧培養(yǎng)基的終濃度分別為1600iu/ml和2000iu/ml。

本發(fā)明中采用的厭氧真菌和反芻獸甲烷短桿菌共培養(yǎng)物piromycesyaktz+m.ruminantium是從牦牛瘤胃中分離獲得的，長期的自然選擇和進(jìn)化使牦牛瘤胃成為一個(gè)高效木質(zhì)纖維素降解酶系統(tǒng)，與人為混合的厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物相比，牦牛瘤胃自然存在的厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物具有獨(dú)特優(yōu)勢和高效的木質(zhì)纖維素降解能力。采用piromycesyaktz+m.ruminantium發(fā)酵玉米秸稈，7天厭氧培養(yǎng)期內(nèi)產(chǎn)木聚糖酶活性可達(dá)到6905mu。

在發(fā)酵過程中添加復(fù)合抗生素，可防止共培養(yǎng)物體系不受細(xì)菌污染，提高厭氧發(fā)酵效率。同時(shí)，本發(fā)明中采用的共培養(yǎng)物可以通過保藏在體外存活傳代，發(fā)酵玉米秸稈可產(chǎn)生高活性木聚糖酶，且發(fā)酵工藝簡單，對(duì)設(shè)備要求低，便于推廣，在工業(yè)領(lǐng)域具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景。

通過天祝放牧牦牛瘤胃厭氧真菌和產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵玉米秸稈可產(chǎn)生高活性木聚糖酶，可進(jìn)一步提高玉米秸稈的使用率，顯著提高經(jīng)濟(jì)效益。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)基如下：

厭氧培養(yǎng)基配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，nahco37.0g，刃天青(1.0g/l)1ml，l-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g，晨飼前采集瘤胃液8000×g，4℃離心20min后的上清170ml，鹽溶液i165ml，鹽溶液ii165ml，蒸餾水定容至1000ml。

鹽溶液i包括nacl6g，(nh4)2so43g，kh2po43g，cacl2·2h2o0.4g，mgso4·2h2o0.6g，蒸餾水定容至1000ml。

鹽溶液ii包括4gk2hpo4，蒸餾水定容至1000ml。

加入秸稈底物后除氧。高溫高壓滅菌。

實(shí)施例一、piromycesyaktz+m.ruminantium菌劑的制備。

吸取1mlpiromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物接種到20ml體積的亨氏厭氧管中的9ml以風(fēng)干粉碎的小麥秸稈為底物的厭氧培養(yǎng)基中，同時(shí)加入復(fù)合抗生素，使其在厭氧培養(yǎng)基溶液的終濃度為青霉素1600iu/ml和硫酸鏈霉素2000iu/ml。39℃厭氧培養(yǎng)72h，即達(dá)到生長高峰，此時(shí)發(fā)酵液為高活力菌劑。

實(shí)施例二、厭氧發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)木聚糖酶。

在100ml體積厭氧發(fā)酵瓶中盛45ml液體基本培養(yǎng)基，以0.5g粉碎風(fēng)干后的玉米秸稈為底物。除氧。滅菌。把傳代培養(yǎng)72h的piromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物用無菌注射器吸取5ml接種到上述加有玉米秸稈的厭氧培養(yǎng)基中，同時(shí)加入復(fù)合抗生素，使其在厭氧培養(yǎng)基溶液的終濃度為青霉素1600iu/ml和硫酸鏈霉素2000iu/ml，39°c厭氧培養(yǎng)7天。

將共培養(yǎng)物的發(fā)酵液1000×g離心10min，取上清液作為粗酶液，采用分光光度計(jì)用dns法測定木聚糖酶酶活性。具體方法如下：稀釋的粗酶液（稀釋至od值大約在0.2-0.8范圍）、底物10g/l樺木木聚糖（sigmax-0502）和50mm磷酸鈉緩沖液（ph6.8）置39°c預(yù)熱15min，750ml粗酶液中加入750ml磷酸鈉緩沖液和500ml底物，39°c反應(yīng)15min后，加入3000mldns終止反應(yīng)。沸水浴5min后冷卻至室溫，取2000ml于比色皿中，在540nm下檢測吸光值。根據(jù)木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算木聚糖酶活性。

1個(gè)酶活力單位（u）是指在以上所述酶促反應(yīng)條件下，1ml酶液在1min內(nèi)自標(biāo)準(zhǔn)底物中釋放1μmol葡萄糖所需的酶量。

測定結(jié)果顯示，玉米秸稈通過piromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵7d后，其發(fā)酵液的木聚糖酶酶活性為6905mu。

綜上可知，本發(fā)明提供的方法，即采用天祝放牧牦牛瘤胃自然共培養(yǎng)物piromycesyaktz+m.ruminantium厭氧發(fā)酵玉米秸稈可產(chǎn)生大量高活性木聚糖酶，其酶活性高達(dá)6905mu，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

<110>甘肅省科學(xué)院生物研究所

<120>一種厭氧發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)木聚糖酶的方法

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