本發(fā)明屬于天然植物中有效成分的提取分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從甌柑果實(shí)中分離純化多甲氧基黃酮類化合物的方法，是以甌柑果實(shí)果皮為原料，采用超聲波輔助提取、c18固相萃取柱和hsccc(高速逆流色譜)的聯(lián)用技術(shù)同時分離純化川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素三種多甲氧基黃酮類化合物的方法。

背景技術(shù)：

甌柑(citrusreticulatacv.suavissima)是蕓香科柑橘屬的一個栽培變種，也是浙江省溫州、麗水地區(qū)的傳統(tǒng)特產(chǎn)，已經(jīng)有兩千多年的栽培歷史。甌柑在民間具有抗腫瘤、祛熱生津、化痰止咳、清涼解毒等特殊食藥功能，這些作用可能與甌柑中富含多甲氧基黃酮類化合物有關(guān)。多甲氧基黃酮(polymethoxylatedflavonoids,pmfs)是指具有4個及4個以上甲氧基取代基的黃酮類化合物，主要來源于蕓香科柑橘屬植物，尤其在柑橘果實(shí)的果皮中含量豐富。柑橘果實(shí)中的多甲氧基黃酮類化合物在抗腫瘤、抗炎、抗誘變和保護(hù)心血管等方面具有很好的活性，關(guān)于多甲氧基黃酮的生物活性機(jī)制研究也逐漸深入。自1934年首次分離出多甲氧基黃酮類化合物單體以來，人們對其活性進(jìn)行了大量的研究。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多甲氧基黃酮類化合物具有抑制癌細(xì)胞增殖、抵抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移作用、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和自噬等生物活性。

川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素是柑橘中主要的多甲氧基黃酮類化合物。川陳皮素(nobiletin)，別名：川皮亭、蜜橘黃素，cas：478-01-3，分子式：c21h22o8，分子量：402.395，化學(xué)名稱為2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5,6,7,8-tetramethoxy-4h-chromen-4-one。存在于甌柑或其他柑橘類水果中一類物質(zhì)，純品白色、粉末狀。橘皮素(tangeretin)，cas：2798-20-1，分子式：c20h20o7，分子量：372.369，外觀：白色粉末。5-去甲川陳皮素(5-demethylnobiletin)，cas：2174-59-6，分子式：c20h20o8，分子量：388.368，外觀：淡黃色粉末。

隨著多甲氧基黃酮類化合物的物質(zhì)結(jié)構(gòu)確定以及對其生物活性的深入研究，多甲氧基黃酮類化合物的市場需求量逐漸增大?，F(xiàn)有關(guān)于多甲氧基黃酮的分離主要采用大孔樹脂層析和制備型高效液相色譜，其局限性為工藝復(fù)雜，成本較高，分離得到的單體純度低或制備量，難以發(fā)展成為分離純度高、制備量大的分離技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種分離純化多甲氧基黃酮類化合物的方法，是一種從甌柑果實(shí)果皮中分離純化川陳皮素、橘皮素、5-去甲川陳皮素的方法，利用該方法可快速有效地從甌柑果實(shí)果皮中同時分離純化得到純度不低于98％的川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素，具體通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)樣品提?。喝∫欢ㄙ|(zhì)量的冷凍干燥的甌柑果皮粉末用95％乙醇(固液比為1：20)超聲提取2次，提取溫度25℃，每次45min，經(jīng)真空抽濾后，合并上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干至無乙醇相，溶于去離子水中。

(2)c18固相萃取柱去糖和分段：取步驟(1)中得到的水溶液上樣c18固相萃取柱，上樣后固相萃取柱先用去離子水洗脫25倍柱床體積(bv)去掉極性較高的雜質(zhì)，然后用35％甲醇12bv進(jìn)行洗脫去掉雜質(zhì)，然后用100％甲醇3bv洗脫，洗脫流速為1ml/min，收集洗脫液，洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上36℃蒸干得到初步去雜質(zhì)后的富含多甲氧基黃酮組分的粉末。

(3)hsccc進(jìn)一步分離純化川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素：配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.1：0.8：1.1：0.9)溶劑體系，充分搖勻過夜，上相為固定相，下相為流動相，首先用固定相以20ml/min流速泵入hsccc分離柱，待充滿后，開啟逆流色譜儀將轉(zhuǎn)速調(diào)至800rpm，將流動相以2ml/min的速度泵入hsccc分離柱，待流動相從出口穩(wěn)定流出時，將初步去雜質(zhì)后的100％甲醇洗脫組分50mg溶于5ml下相中進(jìn)樣，根據(jù)色譜儀檢測器采集的圖譜的峰型分管收集各組分，將特定峰開始與結(jié)束之間的流出液分別收集所得到的組分，峰ⅰ、峰ⅱ和峰ⅲ的組分分別為川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素(如圖3與圖4所示)。

本發(fā)明純化得到的川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素經(jīng)過超高效液相色譜(uplc)和質(zhì)譜(ms)鑒定。

本發(fā)明的另一個目的是所述的方法在甌柑果實(shí)中分離純化多甲氧基黃酮類化合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用c18固相萃取和hsccc聯(lián)用技術(shù)，以甌柑果實(shí)果皮粉末為原料同時分離純化得到高純度的川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素。本發(fā)明相對于過去的工藝有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)不需要高溫高壓及惰性氣體的保護(hù)，工藝簡單；(2)不需要使用具有較大刺鼻氣味的試劑，生產(chǎn)流程安全易操作；(3)可用于分離純化性質(zhì)非常接近的黃酮類化合物，適用性廣；(4)生產(chǎn)周期短，僅僅需要幾個小時就可以完成整個純化過程；(5)純化產(chǎn)物回收率高，純度高；(6)整個純化過程通過uplc和lc-ms進(jìn)行精確定性定量，準(zhǔn)確度高；(7)所用的溶劑可回收后重復(fù)利用，成本較低；(8)通過前期富集多甲氧基黃酮組分，可以提高h(yuǎn)sccc的物質(zhì)分辨率和重現(xiàn)度。

附圖說明

圖1為本發(fā)明純化工藝流程圖。

圖2是粗提物經(jīng)固相萃取uplc檢測圖譜，其中a為粗提物uplc圖譜，b和d為粗提物經(jīng)固相萃取時35％甲醇洗脫液的uplc圖譜，c和e為粗提物經(jīng)c18分段純化后uplc圖譜，在uplc圖譜中，峰1為新橙皮苷，2為川陳皮素，3為橘皮素，4為5-去甲川陳皮素。

圖3為實(shí)施例1的hsccc圖譜，圖中組分ⅰ川陳皮素，組分ⅱ為橘皮素，組分ⅲ為5-去甲川陳皮素。

圖4為實(shí)施例2的hsccc圖譜，圖中組分ⅰ川陳皮素，組分ⅱ為橘皮素，組分ⅲ為5-去甲川陳皮素。

圖5為經(jīng)hsccc純化后的組份，組分ⅰ(川陳皮素)，組分ⅱ(橘皮素)，組分ⅲ(5-去甲川陳皮素)的uplc圖譜。

圖6為二級質(zhì)譜鑒定圖譜，其中a為c18固相萃取和hsccc聯(lián)用技術(shù)分離純化得到的川陳皮素單體二級質(zhì)譜鑒定圖譜；b為c18固相萃取和hsccc聯(lián)用技術(shù)分離純化得到的橘皮素單體二級質(zhì)譜鑒定圖譜；c為c18固相萃取和hsccc聯(lián)用技術(shù)分離純化得到的5-去甲川陳皮素單體二級質(zhì)譜鑒定圖譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明分離純化川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的操作方法按照如下步驟進(jìn)行，參見圖1：

(1)超聲波輔助提?。?0.3g冷凍干燥的甌柑果實(shí)果皮粉末用95％乙醇(固液比比1：20)超聲提取三次(25℃)，每次45min，真空抽濾后，合并上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干至無乙醇相，溶于去離子水中，得到粗提物水溶液。

(2)c18固相萃取柱去糖和分段：取步驟(1)中得到的粗提物水溶液約5ml上樣c18固相萃取柱，上樣后固相萃取柱先用去離子水洗脫25倍柱床體積(bv)去掉極性較高的雜質(zhì)，然后用35％甲醇12bv進(jìn)行洗脫去掉雜質(zhì)，然后用100％甲醇3bv洗脫，洗脫流速為1ml/min，收集洗脫液約12ml，洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上36℃蒸干得到初步去雜質(zhì)后的富含多甲氧基黃酮組分的粉末。該步驟純化后得到初步純化后的去雜質(zhì)粉末207.2mg，粉末中川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的總含量≥80％，結(jié)果見圖2b和2c。

(3)hsccc進(jìn)一步分離純化川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素：配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.1：0.8：1.1：0.9)溶劑體系，充分搖勻過夜，上相為固定相，下相為流動相，首先用固定相以20ml/min流速泵入hsccc分離柱，待充滿后，開啟逆流色譜儀將轉(zhuǎn)速調(diào)至800rpm，將流動相以2ml/min的速度泵入hsccc分離柱，待流動相從出口穩(wěn)定流出時，將初步去雜質(zhì)后的100％甲醇洗脫組分50mg溶于5ml下相中進(jìn)樣，根據(jù)色譜儀檢測器采集的圖譜(圖3)分管收集各組分，用uplc測定各組分的純度，分別合并含有川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的離心管，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上36℃蒸干即得到川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素。得到川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的純度均≥98％，結(jié)果參見圖5。

實(shí)施例2

本發(fā)明分離純化川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的操作方法按照如下步驟進(jìn)行，參見圖1：

(1)超聲波輔助提取：11.2g冷凍干燥的甌柑果實(shí)果皮粉末用95％乙醇(固液比比1：20)超聲提取三次(25℃)，每次45min，真空抽濾后，合并上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干至無乙醇相，溶于去離子水中，得到粗提物水溶液。

(2)c18固相萃取柱去糖和分段：取步驟(1)中得到的粗提物水溶液約5ml上樣c18固相萃取柱，上樣后固相萃取柱先用去離子水洗脫25倍柱床體積(bv)去掉極性較高的雜質(zhì)，然后用35％甲醇12bv進(jìn)行洗脫去掉雜質(zhì)，然后用100％甲醇3bv洗脫，洗脫流速為1ml/min，收集洗脫液約13ml，洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上36℃蒸干得到初步去雜質(zhì)后的富含多甲氧基黃酮組分的粉末。該步驟純化后得到初步純化后的去雜質(zhì)粉末220.3mg，粉末中川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的總含量≥80％，結(jié)果參見圖2d和2e。

(3)hsccc進(jìn)一步分離純化川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素：配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.1：0.8：1.1：0.9)溶劑體系，充分搖勻過夜，上相為固定相，下相為流動相，首先用固定相以20ml/min流速泵入hsccc分離柱，待充滿后，開啟逆流色譜儀將轉(zhuǎn)速調(diào)至800rpm，將流動相以2ml/min的速度泵入hsccc分離柱，待流動相從出口穩(wěn)定流出時，將初步去雜質(zhì)后的100％甲醇洗脫組分50mg溶于5ml下相中進(jìn)樣，根據(jù)色譜儀檢測器采集的圖譜(圖4)分管收集各組分，用uplc測定各組分的純度，分別合并含有川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的離心管，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上36℃蒸干即得到川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素。得到川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的純度均≥98％，結(jié)果參見圖5。

實(shí)施例3本發(fā)明通過以下試驗(yàn)進(jìn)行影響因素的篩選確定

1、純化材料的選擇

新鮮的甌柑果實(shí)果皮，冷凍干燥至恒重，用磨樣機(jī)磨成粉末。取一定質(zhì)量的冷凍干燥的甌柑果皮粉末用95％乙醇(固液比為1：20)超聲提取45min(25℃)，重復(fù)2次，經(jīng)真空抽濾后，合并上清液，用于多甲氧基黃酮類化合物的uplc分析。uplc流動相包括去離子水(溶液a)和色譜乙腈(溶液b)，采用梯度洗脫，檢測波長為330nm，溫度為室溫(25℃)，進(jìn)樣量為2μl，流速為0.3ml/min，條件為：溶劑b：0-5min，20％，5-8min：20％-34％；8-20min：34％-60％，20-22min：60％-100％，22～23min：100％不變，23～24min：100％～20％，保持20％溶液b1min后結(jié)束一個循環(huán)。結(jié)果表明，甌柑果皮中含有較高的多甲氧基黃酮類化合物含量，且雜質(zhì)較少，可作為純化材料。結(jié)果參見圖2a。

2、c18固相萃取甲醇洗脫濃度的選擇

c18固相萃取柱經(jīng)2個柱體積(bv)100％甲醇活化柱子、2bv去離子水水平衡柱子后，1bv左右提取液上樣，上樣流速1ml/min。上樣后的固相萃取柱先用水沖洗25bv去糖，然后分別用20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％等低濃度甲醇洗脫，每個梯度10bv，然后用100％甲醇3bv洗脫，洗脫流速為1ml/min。用uplc檢測不同濃度甲醇去雜后100％甲醇洗脫液中川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的含量，確定最適甲醇洗脫濃度。結(jié)果表明，甲醇濃度等于或高于35％條件時能高效去除粗提物中黃烷酮類雜質(zhì)，經(jīng)過100％洗脫后可以富集多甲氧基黃酮(參見表1)，并且在甲醇洗脫濃度為35％時可以更好地保存川陳皮素等多甲氧基組分不被洗脫掉，故本發(fā)明使用35％的甲醇條件下洗脫去雜，然后收集100％的甲醇洗脫液。經(jīng)c18固相萃取分段去雜純化粗提物可以富集多甲氧基黃酮類化合物，減少雜質(zhì)。

表1

3.hsccc溶劑體系的選擇

通過測定分配系數(shù)(k)來初步篩選用于hsccc的溶劑體系。將預(yù)先配好的不同的溶劑體系充分混勻，靜置分層后，吸取同樣體積的上下相，加入分段去雜后的初步純化粉末，分別測定上下相中川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素的峰面積，上下相峰面積二者之比即為二者的分配系數(shù)。結(jié)果表明，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.1：0.8：1.1：0.9)溶劑體系中，k(川陳皮素)＝0.55，k(橘皮素)＝0.78，k(5-去甲川陳皮素)＝1.81，三者之比在0.5-2范圍內(nèi)(參見表2)。故本發(fā)明應(yīng)用該溶劑體系進(jìn)行進(jìn)一步純化。經(jīng)hsccc進(jìn)一步純化得到純度較高的粉末(參見圖5)，結(jié)果表明組份ⅰ為高純度川陳皮素，組份ⅱ為高純度橘皮素，組份ⅲ為高純度5-去甲川陳皮素(參見圖5)。三種物質(zhì)結(jié)構(gòu)經(jīng)二級質(zhì)譜(ms/ms)鑒定。質(zhì)譜條件：esi離子源，正離子模式(+esi)；干燥氣(n2)溫度：350℃；流速：10.0l/min；霧化器壓力：35psi；毛細(xì)管電壓：4000v；質(zhì)量掃描范圍：m/z100～500。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集采用mrm模式。破碎方式與文獻(xiàn)報道一致，確認(rèn)為川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素(參見圖6)。

表2