【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)表達(dá)純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于血紅素結(jié)合域的可視化蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

重組蛋白表達(dá)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。將外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌、酵母菌等宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)以獲得目的蛋白，是科學(xué)研究以及生產(chǎn)過(guò)程中獲取所需蛋白質(zhì)的重要方法。然而，許多外源蛋白的可溶性表達(dá)量很低或者形成不具有活性包涵體。目前，有許多方法可以提高重組蛋白的可溶性表達(dá)，其中將目的蛋白和標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)是提高目的蛋白可溶性的有效手段。標(biāo)簽蛋白是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和純化等。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員相繼開(kāi)發(fā)出了具有各種不同功能的蛋白標(biāo)簽。大量實(shí)踐證明，合理使用標(biāo)簽蛋白可增加目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，促進(jìn)目標(biāo)蛋白的正確折疊。而一些親和標(biāo)簽，如谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gsttag)、組氨酸標(biāo)簽(histag)、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)等，還可用于蛋白的純化(curropinbiotechnol.2006,17(4):353-358)。但是目前使用的融合標(biāo)簽種類還不足，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的多樣性，沒(méi)有一種通用的融合標(biāo)簽?zāi)芙鉀Q提高所有的異源蛋白的表達(dá)可溶性問(wèn)題，也沒(méi)有一種融合標(biāo)簽可以用于純化所有的蛋白，因此開(kāi)發(fā)新型的標(biāo)簽蛋白對(duì)異源蛋白的可溶性表達(dá)及純化具有重要意義。

除了重組蛋白的可溶性表達(dá)問(wèn)題，另一個(gè)制約重組蛋白表達(dá)技術(shù)的是蛋白質(zhì)的純化。盡管目前組氨酸標(biāo)簽(histag)、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gsttag)和麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)等多種標(biāo)簽已經(jīng)廣泛用于重組蛋白的親和層析純化。但是這些標(biāo)簽蛋白在可見(jiàn)光下均為無(wú)色，無(wú)法實(shí)現(xiàn)重組蛋白在表達(dá)及純化過(guò)程中的持續(xù)可視化跟蹤。如果借助融合蛋白標(biāo)簽?zāi)軐?shí)現(xiàn)重組蛋白表達(dá)過(guò)程及其純化過(guò)程的肉眼可視化，不僅能夠提高蛋白表達(dá)條件優(yōu)化的效率，而且在后續(xù)純化中能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白純化效率及純度。例如，可以通過(guò)肉眼觀察菌體和菌體破碎液的顏色判定重組蛋白的可溶性表達(dá)量；通過(guò)測(cè)定特定可見(jiàn)光波長(zhǎng)下重組蛋白的吸光度就可以獲得重組蛋白的濃度。近年來(lái)，來(lái)源于細(xì)胞色素p450還原酶的黃素單核苷酸結(jié)合域(～21kda)以及來(lái)源于細(xì)胞色素b5的血紅素結(jié)合域(～13kda)被用于融合蛋白標(biāo)簽，在可見(jiàn)光下這兩個(gè)標(biāo)簽的顏色分別為黃色和紅色(biotechniques.2005,38(3):387-392；proteinsci.2010,19(10):1830-1839)。然而由于這兩種蛋白標(biāo)簽在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)較低，并沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)能增加重組蛋白可溶性表達(dá)并且實(shí)現(xiàn)可視化的融合標(biāo)簽具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種包含血紅素結(jié)合域的可視化融合標(biāo)簽在蛋白質(zhì)表達(dá)純化中的應(yīng)用，可以解決通過(guò)肉眼觀察重組蛋白在表達(dá)及純化過(guò)程中變化的問(wèn)題。

本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有的肉眼可視化融合標(biāo)簽的種類很少，提供更多的可視化融合標(biāo)簽用于目標(biāo)蛋白的表達(dá)，具體是提供一種包含來(lái)源于人胱硫醚β-合酶的血紅素結(jié)合域片段基因的氨基酸序列，其序列如序列表中seqidno:1所示；

seqidno:1

metglyserserhishishishishishisserserglymetprosergluthrproglnalagluvalglyprothrglycysprohisargserglyprohisseralalysglyserleuglulysglyserprogluasplysglualalysgluproleutrpileargproaspalaproserargcysthrtrpglnleuglyargproalasergluserprohishishisthralaproalalysserprolysileleuproaspileleulyslysileglyaspthrprometvalargileasnlysileglylyslyspheglyleulyscysgluleuleualalyscysgluleuvalproargglyser；

還包括一種將上述氨基酸序列作為可視化蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽的用途；

還包括用于上述用途的融合表達(dá)載體，該載體是將六個(gè)組氨酸、包含人胱硫醚β-合酶的血紅素結(jié)合域片段基因的氨基酸序列和凝血酶酶切位點(diǎn)基因克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pet-28a(+)而獲得，即獲得包含可視化蛋白標(biāo)簽的融合表達(dá)載體pet-hm14；

還包括一種可視化融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其至少包括上述的融合表達(dá)載體。

上述的可視化蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽包括來(lái)源于人胱硫醚β-合酶(cbs)氨基端的血紅素(heme)結(jié)合域(第1-110位氨基酸殘基)，它具有較強(qiáng)的水溶性，融合蛋白表達(dá)量更高，表現(xiàn)為肉眼可見(jiàn)的鮮紅色。因此，在表達(dá)和純化過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的肉眼可視化跟蹤，根據(jù)融合標(biāo)簽在420nm的特征吸收可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白含量實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，根據(jù)重組蛋白溶液od420/od280比值可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白純度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，同時(shí)該可視化標(biāo)簽也大大提高了目的蛋白的可溶性表達(dá)。

使用過(guò)程中，待表達(dá)的目的基因連接到pet-hm14載體實(shí)現(xiàn)可視化標(biāo)簽和目的基因的融合表達(dá)。為了方便目的蛋白的純化，本發(fā)明在融合標(biāo)簽的氨基端加入六個(gè)組氨酸殘基，利于使用ni-nta樹(shù)脂親和層析純化融合蛋白；同時(shí)為了獲得天然n端的目的蛋白，在融合標(biāo)簽的羧基端加入凝血酶酶切位點(diǎn)(lvprgs)，在純化融合蛋白后能夠切除標(biāo)簽。

本發(fā)明還公開(kāi)了可視化蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽的編碼基因，其編碼基因可以是序列表中seqidno:2所示的dna分子，當(dāng)然，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，其它與seqidno:2所示核苷酸序列同源且編碼相同氨基酸序列的dna分子也可用于構(gòu)建本發(fā)明的融合標(biāo)簽蛋白。

seqidno:2

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcatgccttctgagaccccccaggcagaagtggggcccacaggctgcccccaccgctcagggccacactcggcgaaggggagcctggagaaggggtccccagaggataaggaagccaaggagcccctgtggattcggcccgatgctccgagcaggtgcacctggcagctgggccggcctgcctccgagtccccacatcaccacactgccccggcaaaatctccaaaaatcttgccagatattctgaagaaaatcggggacacccctatggtcagaatcaacaagattgggaagaagttcggcctgaagtgtgagctcttggccaagtgtgagctggtgccgcgcggcagc；

優(yōu)選應(yīng)用實(shí)施例中選擇的是：

來(lái)源于灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)的膽固醇酯酶基因，該基因在大腸桿菌中單獨(dú)表達(dá)時(shí)的可溶性蛋白量很少(<10％)，而與本發(fā)明的可視化蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)后，重組蛋白可溶性得到大幅度提高(>30％)。同時(shí)由于可視化標(biāo)簽的存在使膽固醇酯酶的表達(dá)和純化過(guò)程可以實(shí)現(xiàn)肉眼可視化跟蹤，目的蛋白濃度可以根據(jù)od420的吸光度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，目的蛋白純度可以根據(jù)od420/od280比值進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，大大簡(jiǎn)化了膽固醇酯酶的表達(dá)和純化過(guò)程。膽固醇酯酶是催化膽固醇酯水解成膽固醇和脂肪酸的一種酶，它是臨床檢測(cè)血清總膽固醇的重要酶之一，提高其可溶性表達(dá)量以及純化效率將使大規(guī)模膽固醇酯酶的表達(dá)和純化更加簡(jiǎn)便和快捷。

本發(fā)明的有益效果是：(1)來(lái)自于人胱硫醚β-合酶(cbs)的血紅素結(jié)合域可以作為肉眼可視化蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽用于重組蛋白的表達(dá)，能大大提高融合蛋白的可溶性表達(dá)量；(2)由于該融合標(biāo)簽具有肉眼可見(jiàn)的鮮紅色，因此在表達(dá)和純化過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的肉眼可視化跟蹤，可以不通過(guò)紫外檢測(cè)器而僅靠肉眼判定融合蛋白純化過(guò)程，大大簡(jiǎn)化了純化流程；(3)由于該可視化蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽的特征吸收為～420nm，根據(jù)純化過(guò)程中od420的數(shù)值變化可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白含量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，根據(jù)od420/od280比值可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白純度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

人胱硫醚β-合酶(cbs)氨基端包含有110個(gè)氨基酸殘基的血紅素(heme)結(jié)合域，分子量約12kda，具有很強(qiáng)的水溶性，作為融合蛋白標(biāo)簽可以提高目的蛋白的可溶性表達(dá)。并且該血紅素標(biāo)簽(hemetag)在～420nm下具有特征吸收峰，表現(xiàn)為肉眼可見(jiàn)的鮮紅色，可以對(duì)重組蛋白的表達(dá)過(guò)程和純化過(guò)程進(jìn)行可視化跟蹤，同時(shí)可以根據(jù)420nm的吸光度測(cè)定融合蛋白的濃度，根據(jù)重組蛋白溶液在420nm和280nm下的吸光度比值(od420/od280)判定重組蛋白的純度。

【附圖說(shuō)明】

圖1為5660個(gè)堿基對(duì)的人胱硫醚β-合酶血紅素(heme)結(jié)合域片段基因作為可視化蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽的大腸桿菌表達(dá)載體pet-hm14圖譜，其中：

26-72是t7終止子序列，158-203是多克隆位點(diǎn)序列，204-221是凝血酶酶切位點(diǎn)的核苷酸序列，222-551是血紅素結(jié)合域可視化蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽的核苷酸序列，561-578是編碼6個(gè)組氨酸位點(diǎn)的核苷酸序列，661-677是t7啟動(dòng)子序列，1064-2143是laci基因的編碼序列，3577是pbr322復(fù)制起始位點(diǎn)，4286-5098是卡拉霉素抗性基因kan的編碼序列；

圖2為pet-hm14空載體誘導(dǎo)表達(dá)的可視化標(biāo)簽的sds-page圖，其中：

1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，大小分別為200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda，29.0kda，20.1kda，14.3kda，6.5kda；2.未誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-hm14破碎后上清液；3-4.誘導(dǎo)后的大腸桿菌bl21(de3)/pet-hm14破碎后上清液，其中箭頭標(biāo)注為誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白標(biāo)簽；

圖3為膽固醇酯酶基因與可視化標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白的sds-page圖，其中：

1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，大小分別為200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda；2.誘導(dǎo)前的重組菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；3.誘導(dǎo)后2h的重組菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；4.誘導(dǎo)后4h的重組菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；5.誘導(dǎo)后6h的重組菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；

圖4為融合表達(dá)膽固醇酶的重組大腸桿菌破碎后上清液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，其中：280nm是蛋白質(zhì)的特征吸收峰，420nm是包含可視化標(biāo)簽的融合蛋白特征吸收峰，燒杯中的紅色溶液為重組大腸桿菌裂解液；

圖5是純化的膽固醇酯融合蛋白sds-page圖，其中：1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，大小分別為200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda；2.表達(dá)膽固醇酯酶融合蛋白的重組大腸桿菌破碎后上清液(可溶性蛋白)；3.經(jīng)ni-nta樹(shù)脂親和層析純化的膽固醇酯酶融合蛋白(20μg)；4.經(jīng)ni-nta樹(shù)脂親和層析純化的膽固醇酯酶融合蛋白(20μg)；5.經(jīng)ni-nta樹(shù)脂親和層析純化的膽固醇酯酶融合蛋白(50μg)；

圖6是純化后融合蛋白的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，其中：280nm是蛋白質(zhì)的特征吸收峰，420nm是包含血紅素可視化標(biāo)簽的融合蛋白特征吸收峰，離心管中紅色蛋白溶液為純化的膽固醇酯酶融合蛋白。

【具體實(shí)施方式】

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

實(shí)施例1：包含可視化血紅素融合標(biāo)簽質(zhì)粒載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)

本發(fā)明中，使用的大腸桿菌e.colidh5α以及e.colibl21(de3)均為外購(gòu)，大腸桿菌質(zhì)粒pet-28a(+)購(gòu)自美國(guó)novagen公司。包含人胱硫醚β-合酶(cbs)基因序列的大腸桿菌表達(dá)載體已在論文中公開(kāi)(medchemcommun.2017,8:198-201)。質(zhì)粒dna抽提試劑盒、dna膠回收試劑盒購(gòu)自omega公司；t4dna連接酶、taqdna聚合酶和各種限制性內(nèi)切酶、蛋白marker購(gòu)自takara公司。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid,5-ala)購(gòu)于sigma公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

lb培養(yǎng)基(0.5％酵母粉，1％蛋白胨，1％氯化鈉；以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，氨芐青霉素(ampicillin)終濃度均為50μg/ml。固體lb培養(yǎng)基：在液體lb培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂，即制成固體lb培養(yǎng)基(固體瓊脂平板培養(yǎng)基)。

設(shè)計(jì)引物pr1：

5′-tcaccatgggcagcagcagcagcggcatgccttctgagaccccccag-3′；

引物pr2:

5′-actggatccctcacacttggccaagagctc-3′。引入的ncoⅰ和bamhⅰ酶切位點(diǎn)以下劃線表示。引物pr1中包含6個(gè)組氨酸的編碼基因(雙下劃線)，引物pr2中包含凝血酶酶切位點(diǎn)氨基酸的編碼基因(雙下劃線)。以包含人胱硫醚β-合酶(cbs)基因序列的質(zhì)粒為模板，使用引物pr1和pr2擴(kuò)增得到包含血紅素結(jié)合域的融合標(biāo)簽。將擴(kuò)增的融合標(biāo)簽基因片段用ncoⅰ和bamhⅰ雙酶切連接到載體pet-28a(+)上，構(gòu)建能表達(dá)可視化標(biāo)簽蛋白的融合表達(dá)載體，即重組質(zhì)粒pet-hm14，質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組大腸桿菌bl21(de3)/pet-hm14。將培養(yǎng)過(guò)夜的e.colibl21(de3)/pet-hm14按照1:100的比例接種到500ml含有50ug/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液od600達(dá)到0.6～0.8，然后加入終濃度為0.3mmol/l的5-ala和終濃度為0.1mmol/l的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)于30℃下誘導(dǎo)過(guò)夜，在4℃離心收集菌體備用。將上述收獲的菌體重懸于20ml破碎緩沖液中，在冰水浴中超聲波(300w，超聲3s，間隔8s)處理1100s破碎細(xì)胞，破碎液在4℃離心30min(12000r/min)獲得上清液，然后進(jìn)行sds-page分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：成功構(gòu)建能表達(dá)可視化標(biāo)簽蛋白的表達(dá)載體，即重組質(zhì)粒pet-hm14，如圖1所示，過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體為肉眼可見(jiàn)的微紅色，菌體破碎上清液為鮮紅色；sds-page結(jié)果表明融合蛋白標(biāo)簽成功表達(dá)，表觀分子量約14kda，如圖2所示。以上結(jié)果表明包含血紅素結(jié)合域的可視化標(biāo)簽成功可溶性表達(dá)，標(biāo)簽蛋白為肉眼可見(jiàn)的血紅色，可用于融合蛋白的可視化表達(dá)和純化中。

實(shí)施例2使用包含可視化標(biāo)簽載體pet-hm14在大腸桿菌中表達(dá)膽固醇酯酶。

根據(jù)灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)的膽固醇酯酶基因(genbank:llzl01000117.1)設(shè)計(jì)引物

pr3：5′-tcaggatccatgggcagcagccatcatcatc-3′,

引物pr4：5′-actaagctttcagctgccgcgcggcaccag-3′，引入的bamhⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)以下劃線表示?；疑溍咕?gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。使用真菌基因組dna提取試劑盒(購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司)提取灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)的基因組dna，使用引物pr3和pr4擴(kuò)增得到灰色鏈霉菌的膽固醇酯酶基因，將擴(kuò)增的目的基因片段用bamhⅰ和hindⅲ雙酶切連接到載體pet-hm14上構(gòu)建能表達(dá)可視化融合蛋白的融合表達(dá)載體，即重組質(zhì)粒pet-hm14-ce，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組大腸桿菌bl21(de3)/pet-hm14-ce。將培養(yǎng)過(guò)夜的e.colibl21(de3)/pet-hm14-ce按照1:100的比例接種到1l含有50ug/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液od600達(dá)到0.6～0.8，然后加入終濃度為0.3mmol/l的5-ala和終濃度為0.1mmol/l的iptg于30℃下誘導(dǎo)過(guò)夜，在4℃離心收集菌體備用。將上述收獲的菌體重懸于50ml破碎緩沖液中，在冰水浴中超聲波(300w，超聲3s，間隔8s)處理1100s破碎細(xì)胞，破碎液在4℃離心30min(12000r/min)獲得上清液，上清液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜分析并進(jìn)行sds-page分析。同時(shí)破碎上清液經(jīng)ni-nta樹(shù)脂親和層析后獲得帶有可視化標(biāo)簽的融合蛋白，純化后融合蛋白進(jìn)行蛋白含量測(cè)定、紫外-可見(jiàn)光譜分析以及sds-page分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：來(lái)源于灰色鏈霉菌的膽固醇酯酶使用pet-28a(+)載體表達(dá)時(shí)，可溶性目的蛋白的表達(dá)量低于菌體總蛋白的10％，并且表達(dá)和純化過(guò)程無(wú)法實(shí)現(xiàn)肉眼可視化。而使用可視化標(biāo)簽表達(dá)的可溶性蛋白表達(dá)量超過(guò)菌體總蛋白的30％，結(jié)果如圖3所示。表明融合標(biāo)簽大幅度提高了膽固醇酯酶的可溶性表達(dá)。

另外，表達(dá)融合蛋白的重組大腸桿菌破碎液為肉眼可見(jiàn)的紅色，紫外-可見(jiàn)光譜分析表明破碎上清液具有～420nm的血紅素特征吸收峰以及280nm的蛋白質(zhì)吸收峰，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)測(cè)定上清液蛋白濃度為6mg/ml，其中帶有可視化標(biāo)簽的融合蛋白含量為1.5mg/ml，在420nm的吸光度約為od420＝1.1，在280nm的吸光強(qiáng)度約為od280＝3，表征融合蛋白純度的od420/od280的比值約為0.4。經(jīng)過(guò)一步親和層析目的蛋白的純度達(dá)到95％，純化的帶有可視化標(biāo)簽的融合蛋白為肉眼可見(jiàn)的鮮紅色，結(jié)果如圖5和圖6所示。將純化的融合蛋白濃度調(diào)整至1.5mg/ml(與菌體破碎上清液中融合蛋白含量一致)并進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜分析如圖6所示，結(jié)果表明純化的融合蛋白在420nm的吸光度約為od420＝1.1，與含有相同濃度融合蛋白的菌體破碎上清液在420nm的吸光度一致，表明可以通過(guò)可視化標(biāo)簽在420nm的特征吸收對(duì)重組蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)純化的融合蛋白在280nm的吸光度約為od280＝1.3，純化的融合蛋白(95％純度)od420/od280的比值約為0.9，而細(xì)胞裂解液的od420/od280的比值約為0.4。因此，在使用可視化標(biāo)簽進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)純化過(guò)程中，可以通過(guò)蛋白溶液的od420/od280的比值判定目的蛋白的純度。

<110>西北工業(yè)大學(xué)

<120>一種基于血紅素結(jié)合域的可視化蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽的應(yīng)用

<130>無(wú)

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>seqidno1

<211>129

<212>prt

<213>人工序列

<400>seqidno1

metglyserserhishishishishishisserserglymetproser

151015

gluthrproglnalagluvalglyprothrglycysprohisargser

202530

glyprohisseralalysglyserleuglulysglyserprogluasp

354045

lysglualalysgluproleutrpileargproaspalaproserarg

505560

cysthrtrpglnleuglyargproalasergluserprohishishis

65707580

thralaproalalysserprolysileleuproaspileleulyslys

859095

ileglyaspthrprometvalargileasnlysileglylyslysphe

100105110

glyleulyscysgluleuleualalyscysgluleuvalproarggly

115120125

ser

<210>seqidno2

<211>387

<212>dna

<213>人工序列

<400>seqidno2

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcatgccttctgagaccccccag60

gcagaagtggggcccacaggctgcccccaccgctcagggccacactcggcgaaggggagc120

ctggagaaggggtccccagaggataaggaagccaaggagcccctgtggattcggcccgat180

gctccgagcaggtgcacctggcagctgggccggcctgcctccgagtccccacatcaccac240

actgccccggcaaaatctccaaaaatcttgccagatattctgaagaaaatcggggacacc300

cctatggtcagaatcaacaagattgggaagaagttcggcctgaagtgtgagctcttggcc360

aagtgtgagctggtgccgcgcggcagc387