一種斜帶石斑魚CCR12的多克隆抗體制備方法及其應(yīng)用與流程
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種斜帶石斑魚ccr12的多克隆抗體制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
趨化因子是一類分子量非常小的細(xì)胞因子，他們具有相似的單體結(jié)構(gòu)(baggiolini，1998；jinetal.，2005)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和4個保守半胱氨酸的排列順序，可將趨化因子分為：cxc型、cc型、xc型、cx3c型和cx型等5類(murphy，etal.，2000；nomiyamaetal.，2008)。趨化因子行使功能時，需要與其相應(yīng)的受體結(jié)合。xcl1是一種xc型趨化因子，在穩(wěn)態(tài)、病原感染或炎癥反應(yīng)時，由胸腺髓樣上皮細(xì)胞、或激活的t細(xì)胞、nk細(xì)胞、以及nkt細(xì)胞產(chǎn)生(leietal.，2012)。xcr1是xcl1唯一的受體，由cd8α+和cd11b-cd103+dc細(xì)胞分泌(alexandreetal.，2013)。xcl1-xcr1軸在維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞產(chǎn)生、以及dc細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)中都起到重要作用(leietal.，2012)。此外，xcl1-xcr1軸還參與感染和自生免疫疾病。
目前，鼠基因組中只鑒定到xcl1這一種趨化因子xc亞家族成員，但在人基因組中鑒定到xcl1和xcl2兩種(devriesetal.，2006；foxetal.，2015)。xcl1是哺乳動物和鳥中普遍存在的趨化因子，但xcl2僅僅在一些物種中存在(nomiyamaetal.，2011)。在魚中，目前尚未鑒定到xcl1或xcl2同源蛋白，但發(fā)現(xiàn)了3種xcr1樣趨化因子受體，即xcr1、xcr1l和ccr12(grimholtetal.，2015；nomiyamaetal.，2011)。其中xcr1l和ccr12只在魚類基因組中發(fā)現(xiàn)，但關(guān)于其功能研究甚少，且抗xcr1l或ccr12抗體的缺乏也限制了對其陽性細(xì)胞的分離及功能的研究。截止目前，尚未有關(guān)于魚類ccr12體外表達的任何報道，更無關(guān)于ccr12多克隆抗體的研究。
我們研究發(fā)現(xiàn)：刺激隱核蟲感染后，石斑魚ccr12在皮膚、鰓和脾臟中的表達量顯著增加，推測ccr12陽性細(xì)胞參與石斑魚抗寄生蟲感染過程。為進一步揭示石斑魚ccr12陽性細(xì)胞在寄生蟲感染組織中的遷移或增殖情況，鑒定ccr12陽性細(xì)胞類型，本研究首次構(gòu)建了石斑魚ccr12胞外區(qū)表達載體，首次通過原核系統(tǒng)表達純化了ccr12的n-端區(qū)和3個胞外區(qū)重組蛋白，并最終首次制備了兔抗ccr12重組蛋白多克隆抗體，該抗體能特異性識別石斑魚ccr12蛋白，且標(biāo)記血液中的細(xì)胞，為我們今后標(biāo)記ccr12陽性細(xì)胞并開展其抗寄生蟲感染研究奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
到目前為止，尚未有人制備過斜帶石斑魚的ccr12多克隆抗體，關(guān)于ccr12多克隆抗體的應(yīng)用更無任何報道，而本發(fā)明通過基因工程方法，首次成功表達純化了斜帶石斑魚ccr12，并首次制備了兔抗ccr12重組蛋白多克隆抗體，同時對其初步應(yīng)用也進行了一定研究。
本發(fā)明的目的在于提供一種斜帶石斑魚ccr12的多克隆抗體制備方法及其應(yīng)用，具體步驟如下：
(一)石斑魚ccr12基因克隆及序列分析：
1、石斑魚脾臟總rna的提取
(1)從液氮中快速取出凍存的脾臟，進行液氮研磨，待研磨充分后，加入3mltrizolreagent，待其快融化時，吸1ml至1.5mlep管中，冰上放置；
(2)每管中加入20％氯仿(即1mltrizolreagent加入0.2ml氯仿)，劇烈震蕩15s，冰上靜置3min可看到分層現(xiàn)象；
(3)4℃，12000g離心15min，管中液體分為三層，從上到下依次為水層、蛋白質(zhì)層、有機層，吸取上清至一新的1.5mlep管中；
(4)向管中加入0.5ml異丙醇，輕輕倒轉(zhuǎn)ep管，冰上靜置10min；
(5)4℃，12000g離心10min，棄上清(不要連續(xù)倒轉(zhuǎn))；
(6)每管中加入1ml75％乙醇(用depc水配制)，用槍頭輕輕吹起沉淀；
(7)4℃，7500g離心5min，去上清；
(8)重復(fù)(6)、(7)步驟一次；
(9)用15μlrnase-free水溶解rna；
(10)用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測rna的完整度，用核酸濃度測定儀測rna的濃度，a260/a280顯示其純度，剩余樣品-70℃放置待用。
2、一鏈cdna的合成
先去除基因組dna污染，再反轉(zhuǎn)錄為一鏈cdna。按照下表1添加各組分，輕輕混勻，短暫離心；
表1去除基因組dna污染配方
(1)pcr儀37℃孵育30min以去除基因組dna污染；
(2)加入1μl50mmedta，65℃孵育10min滅活dnasei；
(3)每微克總rna加入1μloligo(dt)20(10pmol/μl)，65℃孵育5min后立即放于冰上以消除rna的二級結(jié)構(gòu)，提高逆轉(zhuǎn)率的效率；
(4)按下表2配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)程序為：42℃、30min，99℃、5min，4℃、5min。產(chǎn)物-20℃待用。
表2反轉(zhuǎn)錄為cdna配方
3、ccr12序列的擴增
根據(jù)石斑魚轉(zhuǎn)錄組信息，將編碼ccr12的contig放到ncbi上查找orf區(qū)，并進行序列比對，在orf區(qū)外側(cè)設(shè)計引物(表3)，以上一步驟獲得的脾臟cdna為模板pcr擴增目的基因的orf區(qū)。
表3基因克隆引物
pcr擴增反應(yīng)液的配方如下表4所示。pcr反應(yīng)條件為：98℃，1min，(98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min)35個循環(huán)，最后72℃終延伸10min。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物。
表4pcr擴增體系配方
4、目的片段的膠回收
目的片段pcr產(chǎn)物的回收和純化按照如下步驟：
(1)在紫外燈下照膠，并盡可能快的切下目的條帶放置于一新的已稱重的1.5mlep管中；
(2)給ep管稱重，計算膠體的質(zhì)量和體積(膠體的體積按照1ml/g計算)；
(3)按照1倍體積的凝膠體積加入bindingbuffer(xp2)并置于60℃水浴鍋中孵育直至凝膠全部溶解，期間間隔2-3min輕輕混勻凝膠溶解液；
(4)將試劑盒中的
(5)將(3)中的溶解液轉(zhuǎn)移至minicolumn中，室溫10000g離心1min；
(6)去除流出液并重復(fù)(5)直至所有的凝膠溶解液都經(jīng)minicolumn底部的濾膜離心過濾；
(7)向minicolumn中加入300μlbindingbuffer(xp2)，室溫13000g離心1min，去流出液；
(8)向minicolumn中加入700μlspwwashbuffer，室溫13000g離心1min，去流出液；
(9)重復(fù)步驟(8)一次；
(10)室溫13000g離心2min使空的minicolumn的濾膜盡量脫水；
(11)將minicolumn放置于一新的1.5mlep管中，加入15-30μlelutionbuffer于濾膜中央，室溫靜置1min后，室溫13000g離心1min洗脫dna；
(12)將上述1.5mlep管于-20℃保存。
5、目的片段的克隆與轉(zhuǎn)化
按照表5體系進行加樣：
表5平末端載體連接試劑盒使用配方
(1)25℃連接30min；
(2)將連接產(chǎn)物加至50μldh5α感受態(tài)(克隆菌)中，冰浴30min；
(3)42℃水浴熱激90s，冰浴2min；
(4)加入1ml新鮮lb培養(yǎng)液，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)90min；
(5)4000g離心5min，去掉800μl上清，將菌液重新吹打懸起，取100μl菌液涂布到含氨芐的lb固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜；
(6)挑取單克隆于10μllb培養(yǎng)液中作為模板，通過菌落pcr檢測插入的片段大??；
(7)將片段大小一致的陽性克隆接種于5ml含氨芐的lb液體培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜，吸1ml送測序。
6、序列分析
采用smart程序(http：//smart.embl-heidelberg.de/)對序列的信號肽和蛋白的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，用tmhmmserverv.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/tmh-mm/)對受體的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，克隆得到的基因和其它物種相對應(yīng)氨基酸序列的比對用bioedit和clustalomega(http：//www.ebi.ac.uk/tools/msa/clust-alo/)進行，系統(tǒng)進化樹用mega5.04(beta2)軟件進行。
通過以上方法，我們克隆得到了斜帶石斑魚ccr12的orf序列，全長1074bp，編碼357個氨基酸的多肽，理論等電點和分子量分別為8.87和41da。smart序列分析顯示：石斑魚ccr12有1個n-端區(qū)、3個胞外區(qū)、3個胞內(nèi)區(qū)和1個c-端區(qū)構(gòu)成，結(jié)果可以參見圖1：其中波浪線分別代表n-和c-端序列，細(xì)下劃線分別代表跨膜區(qū)，粗下劃線代表胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。多序列比對顯示：石斑魚ccr12與daniorerio和oryziaslatipes相似度分別為62％和73％，與d.rerio其他ccr12以及xenopustropicalis的相似度為47％-48％。進化分析顯示：石斑魚ccr12與其他魚類ccr12歸為一支(見圖2)，與序列比對結(jié)果一致。
(二)石斑魚ccr12原核表達及純化：
1、ccr12重組表達載體的構(gòu)建
(1)目的片段擴增
a.通過smart軟件分析，石斑魚ccr12是一種七次跨膜蛋白，由一個n-端區(qū)、3個胞外區(qū)、3個胞內(nèi)區(qū)和一個c-端區(qū)構(gòu)成；本研究表達的是石斑魚ccr12的n-端區(qū)和3個胞外區(qū)；
b.以ccr12nf/r、ccr12el1f/r、ccr12el2f/r和ccr12el3f/r為引物，以前面合成的cdna為模板，用高保真酶primestartmmix分別擴增ccr12的n-端區(qū)和3個胞外區(qū)；
c.再以ccr12nf/el1r為引物，步驟b擴增的ccr12n-端區(qū)和第1個胞外區(qū)為模板，通過重組pcr連接n-端區(qū)和第1個胞外區(qū)；同時，以ccr12el2f/el3r為引物，以步驟b擴增的ccr12的第2和第3個胞外區(qū)為模板，通過重組pcr連接第2和第3個胞外區(qū)；
d.最后，以ccr12nf/el3r為引物，以步驟c連接成功的兩個融合片段為模板，通過重組pcr將ccr12的n-端區(qū)和3個胞外區(qū)連接到一起，膠回收目的片段。所用的引物詳見表6，下劃線部分表示酶切位點。
表6ccr12擴增用引物
(2)表達載體的提取
復(fù)蘇轉(zhuǎn)化有pet32a表達載體的菌株，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，進行質(zhì)粒抽提，具體步驟如下：
a.室溫1000g、1min離心收集菌液；
b.向菌體沉淀中加入250μlsolutioni，槍頭吹打重懸菌體；
c.加入250μlsolutionii，輕輕顛倒混勻幾次直至細(xì)菌懸液變澄清；
d.加入350μlsolutioniii，輕輕顛倒混勻幾次直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀；
e.室溫1000g離心10min；
f.小心盡可能的吸盡上清于一新的hibinddna結(jié)合柱；
g.室溫10000g離心1min，去流出液；
h.向柱中加入500μlbufferhb，室溫10000g離心1min，去流出液；
i.向柱中加入700μlwashbuffer，室溫10000g離心1min，去流出液；
j.重復(fù)步驟i)一次；
k.室溫13000g離心2min使空的minicolumn的濾膜盡量脫水；
l.將hibinddna結(jié)合柱放置于一新的1.5mlep管中，加入15-30μlelutionbuffer于濾膜中央，室溫靜置1min后，室溫13000g離心1min洗脫dna；
m.將上述1.5mlep管于-20℃保存。
(3)雙酶切目的片段和表達載體
a.將步驟(1)膠回收的目的片段和步驟(2)提取的表達載體按表7的體系加樣；
b.混勻后，瞬時離心，37℃酶切0.5h；
c.膠回收酶切后的目的片段和表達載體；
表7quickcut酶切體系
(4)重組表達載體構(gòu)建
a.將步驟(3)雙酶切后回收的目的片段和表達載體按表8體系加樣；
b.16℃連接過夜；
c.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到表達菌bl21的感受態(tài)細(xì)胞中；
d.通過菌落pcr法鑒定陽性克隆，并進行測序。
表8重組表達載體的連接體系
用所設(shè)計的引物通過重組pcr，將趨化因子受體ccr12的n-端區(qū)和3個胞外區(qū)段拼接起來，經(jīng)過膠回收、雙酶切后，連接到pet32a原核表達載體上。轉(zhuǎn)化bl21后，挑取1個陽性克隆測序，此陽性克隆序列完全正確。結(jié)果見圖3，其中泳道1為ccr12的orf區(qū)的克隆，2、3、4、5分別為ccr12的胞外n-端、el1、el2、el3區(qū)段的克隆，泳道6為ccr12的胞外n端和el1重組pcr結(jié)果，泳道7為ccr12的el2和el3重組pcr結(jié)果，泳道8為泳道6和7產(chǎn)物重組pcr結(jié)果。
2、ccr12重組蛋白表達條件的優(yōu)化和可溶性分析
(1)ccr12重組蛋白的誘導(dǎo)表達
a.將上一步驟測序正確的重組蛋白表達菌株接種到一新的含amplb液體培養(yǎng)液中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜；
b.將培養(yǎng)過夜的菌液按照1∶50比例接種到新鮮的lb培養(yǎng)液中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至od600為0.6-0.8；
c.添加iptg至終濃度為1mm，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)6h；
d.取1ml菌液，室溫4000r/min離心5min去掉上清后；
e.以100μl雙蒸水重懸，按照1∶4比例與5×sds-pageloadingbuffer混勻，水浴煮沸5min；
f.將上述樣品進行sds-page凝膠電泳，檢測ccr12重組蛋白是否表達，以pet32a的表達菌株的誘導(dǎo)組作為對照；
(2)重組蛋白表達條件的優(yōu)化
a.iptg的濃度：分別用終濃度0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm的iptg誘導(dǎo)表達菌6h，收集菌體，處理后上樣跑電泳；
b.誘導(dǎo)的時間：在最佳誘導(dǎo)濃度條件下，于誘導(dǎo)后的第0h、2h、4h和6h收集菌體，處理后上樣跑電泳。
將陽性克隆在37℃擴大培養(yǎng)至菌液的od600達到0.6-0.8時，加入0mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm的iptg在30℃誘導(dǎo)表達6h收集菌體，sds-page電泳分析表明，重組蛋白ccr12的最優(yōu)誘導(dǎo)濃度為0.5mm。在此基礎(chǔ)上對誘導(dǎo)的時間進行優(yōu)化。從圖4中可以看出，在誘導(dǎo)4h時，重組蛋白ccr12的表達量已經(jīng)達到最大。因此，大量誘導(dǎo)表達的條件為30℃、0.5mm、4h。
在圖4中，c為重組蛋白的表達量與iptg誘導(dǎo)濃度的關(guān)系，c則為在最優(yōu)的iptg誘導(dǎo)濃度下，蛋白的表達量隨時間變化的關(guān)系。m泳道表示蛋白marker，c中1-6泳道表示在30℃，iptg的使用量分別為0mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm誘導(dǎo)表達6h，重組蛋白的表達情況。c中1-4泳道分別表示在最優(yōu)iptg誘導(dǎo)濃度下，誘導(dǎo)時間為0h、2h、4h和6h時重組蛋白的表達情況，目的蛋白條帶用黑色箭頭標(biāo)出。
(3)重組蛋白可溶性分析
a.用步驟(2)優(yōu)化的條件，誘導(dǎo)重組蛋白表達，離心收集菌體；
b.按原始菌液50∶1比例加入pbs重懸后4℃、10000g離心3min，去上清；
c.加入等量的lysisbuffer重懸菌體，超聲破碎(超聲破碎條件為200w，超聲5s，間隔8s，超聲15min，3個循環(huán))；
d.超聲結(jié)束后，4℃、8000g離心15min，分別收集上清和沉淀；
e.經(jīng)處理后，sds-page檢測重組蛋白的可溶性。
最終sds-page分析表明，ccr12以可溶性形式存在于上清中，參見圖5，其中m泳道表示蛋白marker。1、2、3泳道分別表示全菌液、上清和沉淀。
3、ccr12重組蛋白的純化
(1)將含重組表達載體的bl21菌擴大培養(yǎng)至1000ml，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至od600為0.6-0.8，添加iptg至步驟2優(yōu)化的最優(yōu)終濃度，30℃、200r/min培養(yǎng)適當(dāng)時間；
(2)4℃、1000g離心1min收集全部菌體；
(3)50ml0.01mmpbs重懸菌體，4℃、1000g離心10min去上清；
(4)50mllysisbuffer重懸菌體，超聲破碎，4℃、1000g離心10min收集上清；
(5)通過washbuffer和含不同濃度咪唑的elutionbuffer依次對鎳柱進行洗滌并收集流出液，用sds-page檢測洗脫效果；
(6)純化的蛋白液在pbs中透析過夜后，用超濾離心管進行濃縮，濃縮液-80℃保存。
最終重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后，得到較純的單一目的條帶，參見圖5，其中m泳道表示蛋白marker，泳道4為經(jīng)親和層析處理得到的純化樣品，目的蛋白條帶用黑色箭頭標(biāo)出。
(三)斜帶石斑魚ccr12的多克隆抗體制備及其應(yīng)用：
1、ccr12多克隆抗體制備：
(1)將從廣東省實驗動物中心購買的兩只新西蘭雄兔在無菌動物房適應(yīng)飼養(yǎng)2周；
(2)取約2mg重組蛋白，加入pbs至2ml，加入2ml弗氏完全佐劑，反復(fù)推拉共軛注射器使重組蛋白乳化；
(3)用無菌注射器吸取已與弗氏完全佐劑乳化的重組蛋白，對新西蘭雄兔分多個位點進行皮下注射(注射位點需先用75％酒精棉消毒)，注射劑量為1ml/只；
(4)兩周后，進行加強免疫，以初始免疫一半重組蛋白量與等量的弗氏不完全佐劑乳化混勻后，對新西蘭雄兔進行皮下注射，共加強免疫3次，每次間隔時間均為2周；
(5)最后一次加強免疫7天后，對免疫新西蘭雄兔進行頸動脈采血，室溫靜置2h，4℃過夜，4℃、4000r/min離心30min后小心吸取上層血清，56℃處理30min以滅活補體，用proteina柱子進行純化，分裝后-20℃保存(首免之前采血作為陰性對照)。
2、elisa測定多抗效價：
(1)用包被液稀釋純化的蛋白抗原至20μg/ml，在96孔酶標(biāo)板中每孔加入100μl，4℃過夜包被；
(2)拍干孔中的液體，加入200μl洗滌液，振蕩洗滌3次，每次3min，棄去，拍干；
(3)每孔中加入200μl封閉液，室溫封閉1h；
(4)棄去孔中封閉液，拍干，加入200μl洗滌液，振蕩洗滌3次，每次3min，棄去，拍干；
(5)將多克隆抗體與pbs按照1∶10比例進行連續(xù)的梯度稀釋，每孔中加入100μl，設(shè)置3個平行，以pbs作為陰性對照組，37℃孵育2h；
(6)棄去孔中一抗，拍干，加入200μl洗滌液，振蕩洗滌3次，每次3min，棄去，拍干；
(7)每孔加入100μl稀釋的二抗，避光，37℃孵育2h；
(8)棄去孔中二抗，拍干，加入200μl洗滌液，振蕩洗滌3次，每次3min，棄去，拍干；
(9)配制新鮮底物液，每孔中加入100μl，避光，37℃孵育20min；
(10)每孔中加入50μl終止液，用酶標(biāo)儀檢測450nm波長時各孔的吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)為p/n≥2.1或p≥n+3d。
最終經(jīng)elisa檢測，多克隆抗體的效價為1∶100000，此效價較高，可以滿足后續(xù)免疫組化實驗的需求。
3、westernblotting檢測多抗的特異性：
a：為了檢測制備的多克隆抗體是否能夠識別天然蛋白，分別提取斜帶石斑魚頭腎的總蛋白和膜蛋白進行westernblotting實驗。石斑魚用丁香酚進行麻醉后，取其頭腎組織快速置于一新的1.5mlep管中，置于液氮中保存，用于進行后續(xù)的總蛋白和膜蛋白提取，具體步驟如下。
(1)組織總蛋白的提?。?/p>
a)液氮環(huán)境下充分研磨組織直至成為勻漿狀；
b)向研磨充分的組織中加入組織裂解液，冰浴30min(裂解液實驗前加入pmsf至終濃度為1mm)；
c)超聲破碎儀對裂解樣品進行超聲破碎(程序為超聲破碎5是，間隔10s，2次)；
d)4℃，14000r/min離心15min后小心吸取上清，-80℃保存。
(2)組織膜蛋白的提取
a)往樣品中加入10mmtris-hcl至覆蓋樣品；
b)加入等體積預(yù)冷的tritonx-114抽提緩沖液(緩沖液用前需混勻)，加入pmsf蛋白酶抑制劑至其終濃度為1mm；
c)用漩渦震蕩儀震蕩樣品1min，冰浴5min，如此反復(fù)10次；
d)4℃，12000r/min離心15min后小心吸取上清；
e)向上清中加入等體積的蔗糖緩沖液，30℃水浴5min至出現(xiàn)云霧狀渾濁；
f)12000r/min室溫離心3min混合液將分層，冰上保存油層；
g)油層中加入9倍體積的預(yù)冷丙酮，冰上孵育1h，-20℃過夜；
h)去除丙酮，tris-hcl溶解沉淀蛋白，-80℃保存。
b：多抗的特異性檢測：
(1)抗原蛋白sds-page電泳后，將凝膠按照點樣泳道切割成適當(dāng)大小浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中；
(2)將pvdf膜裁剪成與凝膠相匹配的大小，浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中；
(3)按照黑板(負(fù)極)、泡沫墊、濾紙、凝膠、pvdf膜、濾紙、泡沫墊、白板(正極)的順序固定凝膠和pvdf膜(注意排除氣泡)；
(4)將裝置放入轉(zhuǎn)印槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，100v轉(zhuǎn)膜23min；
(5)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下pvdf膜，加入10％脫脂奶粉室溫封閉1h；
(6)加入適當(dāng)一抗(即制備的ccr12多克隆抗體)，4℃孵育過夜；
(7)棄去一抗，用pbst洗滌3次，每次5min；
(8)加入用10％脫脂奶粉稀釋的二抗室溫孵育1h；
(9)棄去二抗，用pbst洗滌3次，每次5min；
(10)用化學(xué)發(fā)光法進行顯示拍照。
通過westernblotting檢測ccr12多克隆抗體的特異性，結(jié)果如圖6所示，該多克隆抗體能特異性的識別重組蛋白，也能識別天然蛋白(約為41kda)。其中，泳道m(xù)表示marker，泳道1、2、3分別表示趨化因子受體ccr12的重組蛋白純化樣品、頭腎組織全蛋白、頭腎膜蛋白的sds-page結(jié)果，泳道a、b、c則分別為泳道1、2、3的樣品用制得的多抗進行westernblotting的結(jié)果，箭頭分別標(biāo)記多克隆抗體識別的天然蛋白和重組蛋白。
4、多抗的初步應(yīng)用(斜帶石斑魚外周血細(xì)胞免疫組化)：
(1)用適當(dāng)劑量的丁香酚(50mg/ml)將斜帶石斑魚麻醉，用肝素鈉處理過的注射器從尾靜脈采血；
(2)取一干凈的載玻片，滴加一滴抗凝血；
(3)用另一干凈玻片，一端接觸玻片上的血滴，兩玻片成45°角，輕輕移動，使血滴成一直線，由玻片的一端移向另一端，成為均勻的薄層；
(4)血涂片在空氣中干燥后，立即用4％多聚甲醛室溫固定15min；
(5)用pbs洗3次，每次3min；
(6)用0.5％tritonx-100破膜處理20min；
(7)用pbs洗3次，每次3min；
(8)用3％h2o2室溫封閉15min；
(9)用pbs洗3次，每次3min；
(10)將玻片進入檸檬酸緩沖液中，在微波爐中進行抗原修復(fù)15min，室溫冷卻；
(11)用pbs洗3次，每次3min；
(12)用正常山羊血清室溫封閉30min；
(13)甩干玻片上的山羊血清，滴加一抗(即制備的ccr12多克隆抗體)，置于濕盒中，4℃孵育過夜；
(14)取出濕盒，37℃復(fù)溫40min；
(15)用pbs洗3次，每次3min；
(16)滴加二抗，37℃孵育40min；
(17)用pbs洗3次，每次3min；
(18)dab顯色1min，蒸餾水沖洗5min；
(19)蘇木素37℃復(fù)染15min，自來水沖洗5min；
(20)1％鹽酸酸化5s，自來水沖洗5min；
(21)75％、80％、90％、95％、95％、100％、100％乙醇依次脫水3min；
(22)1/2100％乙醇+1/2100％二甲苯處理3min；
(23)二甲苯i、ii透明5min；
(24)中性樹脂封片，37℃過夜后，在顯微鏡下拍照觀察。
制備的趨化因子受體ccr12多克隆抗體通過免疫組化可標(biāo)記血涂片的陽性細(xì)胞，結(jié)果如圖7所示，ccr12陽性細(xì)胞直徑約為9μm，具有不同的核型，包括腎形和圓形。其中a、b分別顯示的是ccr12陽性細(xì)胞的不同核型，a為腎形，b為圓形。
附圖說明
圖1為石斑魚ccr12核苷酸和蛋白序列。
圖2為石斑魚ccr12進化樹分析圖。
圖3為ccr12重組表達載體的構(gòu)建結(jié)果圖。
圖4為ccr12重組蛋白表達條件的優(yōu)化示意圖。
圖5為ccr12重組蛋白的可溶性分析和純化結(jié)果圖。
圖6為ccr12多克隆抗體的特異性檢測結(jié)果。
圖7為血涂片ccr12陽性細(xì)胞免疫組化結(jié)果。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
一種斜帶石斑魚ccr12的多克隆抗體制備方法及其應(yīng)用，具體步驟如下：
(一)石斑魚ccr12基因克隆及序列分析：
1、石斑魚脾臟總rna的提取
(1)從液氮中快速取出凍存的脾臟，進行液氮研磨，待研磨充分后，加入3mltrizolreagent，待其快融化時，吸1ml至1.5mlep管中，冰上放置；
(2)每管中加入20％氯仿(即1mltrizolreagent加入0.2ml氯仿)，劇烈震蕩15s，冰上靜置3min可看到分層現(xiàn)象；
(3)4℃，12000g離心15min，管中液體分為三層，從上到下依次為水層、蛋白質(zhì)層、有機層，吸取上清至一新的1.5mlep管中；
(4)向管中加入0.5ml異丙醇，輕輕倒轉(zhuǎn)ep管，冰上靜置10min；
(5)4℃，12000g離心10min，棄上清(不要連續(xù)倒轉(zhuǎn))；
(6)每管中加入1ml75％乙醇(用depc水配制)，用槍頭輕輕吹起沉淀；
(7)4℃，7500g離心5min，去上清；
(8)重復(fù)(6)、(7)步驟一次；
(9)用15μlrnase-free水溶解rna；
(10)用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測rna的完整度，用核酸濃度測定儀測rna的濃度，a260/a280顯示其純度，剩余樣品-70℃放置待用。
2、一鏈cdna的合成
先去除基因組dna污染，再反轉(zhuǎn)錄為一鏈cdna。按照下表1添加各組分，輕輕混勻，短暫離心；
表1去除基因組dna污染配方
(1)pcr儀37℃孵育30min以去除基因組dna污染；
(2)加入1μl50mmedta，65℃孵育10min滅活dnasei；
(3)每微克總rna加入1μloligo(dt)20(10pmol/μl)，65℃孵育5min后立即放于冰上以消除rna的二級結(jié)構(gòu)，提高逆轉(zhuǎn)率的效率；
(4)按下表2配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)程序為：42℃、30min，99℃、5min，4℃、5min。產(chǎn)物-20℃待用。
表2反轉(zhuǎn)錄為cdna配方
3、ccr12序列的擴增
根據(jù)石斑魚轉(zhuǎn)錄組信息，將各contig放到ncbi上查找orf區(qū)，并進行序列比對，在orf區(qū)外側(cè)設(shè)計引物(表3)，以上一步驟獲得的組織cdna為模板pcr擴增目的基因的orf區(qū)。
表3基因克隆引物
pcr擴增反應(yīng)液的配方如下表4所示。pcr反應(yīng)條件為：98℃，1min，(98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min)35個循環(huán)，最后72℃終延伸10min。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物。
表4pcr擴增體系配方
4、目的片段的膠回收
目的片段pcr產(chǎn)物的回收和純化按照如下步驟：
(1)在紫外燈下照膠，并盡可能快的切下目的條帶放置于一新的已稱重的1.5mlep管中；
(2)給ep管稱重，計算膠體的質(zhì)量和體積(膠體的體積按照1ml/g計算)；
(3)按照1倍體積的凝膠體積加入bindingbuffer(xp2)并置于60℃水浴鍋中孵育直至凝膠全部溶解，期間間隔2-3min輕輕混勻凝膠溶解液；
(4)將試劑盒中的
(5)將(3)中的溶解液轉(zhuǎn)移至minicolumn中，室溫10000g離心1min；
(6)去除流出液并重復(fù)(5)直至所有的凝膠溶解液都經(jīng)minicolumn底部的濾膜離心過濾；
(7)向minicolumn中加入300μlbindingbuffer(xp2)，室溫13000g離心1min，去流出液；
(8)向minicolumn中加入700μlspwwashbuffer，室溫13000g離心1min，去流出液；
(9)重復(fù)步驟(8)一次；
(10)室溫13000g離心2min使空的minicolumn的濾膜盡量脫水；
(11)將minicolumn放置于一新的1.5mlep管中，加入15-30μlelutionbuffer于濾膜中央，室溫靜置1min后，室溫13000g離心1min洗脫dna；
(12)將上述1.5mlep管于-20℃保存。
5、目的片段的克隆與轉(zhuǎn)化
按照表5進行操作：
表5平末端載體連接試劑盒使用配方
(1)25℃連接30min；
(2)將連接產(chǎn)物加至50μldh5α感受態(tài)(克隆菌)中，冰浴30min；
(3)42℃水浴熱激90s，冰浴2min；
(4)加入1ml新鮮lb培養(yǎng)液，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)90min；
(5)4000g離心5min，去掉800μl上清，將菌液重新吹打懸起，取100μl菌液涂布到含氨芐的lb固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜；
(6)挑取單克隆于10μllb培養(yǎng)液中作為模板，通過菌落pcr檢測插入的片段大??；
(7)將片段大小一致的陽性克隆接種于5ml含氨芐的lb液體培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜，吸1ml送測序。
6、序列分析
采用smart程序(http：//smart.embl-heidelberg.de/)對序列的信號肽和蛋白的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，用tmhmmserverv.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/tmh-mm/)對受體的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，克隆得到的各基因和其它物種相對應(yīng)氨基酸序列的比對用bioedit和clustalomega(http：//www.ebi.ac.uk/tools/msa/clust-alo/)進行，系統(tǒng)進化樹用mega5.04(beta2)軟件進行。
通過以上方法，我們克隆得到了斜帶石斑魚ccr12的orf序列，全長1074bp，編碼357個氨基酸的多肽，理論等電點和分子量分別為8.87和41da。smart序列分析顯示：石斑魚ccr12有1個n-端區(qū)、3個胞外區(qū)、3個胞內(nèi)區(qū)和1個c-端區(qū)構(gòu)成，結(jié)果可以參見圖1：其中波浪線分別代表n-和c-端序列，細(xì)下劃線分別代表跨膜區(qū)，粗下劃線代表胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。多序列比對顯示：石斑魚ccr12與daniorerio和oryziaslatipes相似度分別為62％和73％，與d.rerio其他ccr12以及xenopustropicalis的相似度為47％-48％。進化分析顯示：石斑魚ccr12與其他魚類ccr12歸為一支(見圖2)，與序列比對結(jié)果一致。
(二)石斑魚ccr12原核表達及純化：
1、ccr12重組表達載體的構(gòu)建
(1)目的片段擴增
a.通過smart軟件分析，石斑魚ccr12是一種七次跨膜蛋白，由一個n-端區(qū)、3個胞外區(qū)、3個胞內(nèi)區(qū)和一個c-端區(qū)構(gòu)成；本研究表達的是石斑魚ccr12的n-端區(qū)和3個胞外區(qū)；
b.以ccr12nf/r、ccr12el1f/r、ccr12el2f/r和ccr12el3f/r為引物，以前面合成的cdna為模板，用高保真酶primestartmmix分別擴增ccr12的n-端區(qū)和3個胞外區(qū)；
c.再以ccr12nf/el1r為引物，步驟b擴增的ccr12n-端區(qū)和第1個胞外區(qū)為模板，通過重組pcr連接n-端區(qū)和第1個胞外區(qū)；同時，以ccr12el2f/el3r為引物，以步驟b擴增的ccr12的第2和第3個胞外區(qū)為模板，通過重組pcr連接第2和第3個胞外區(qū)；
d.最后，以ccr12nf/el3r為引物，以步驟c連接成功的兩個融合片段為模板，通過重組pcr將ccr12的n-端區(qū)和3個胞外區(qū)連接到一起，膠回收目的片段。所用的引物詳見表6，下劃線部分表示酶切位點。
表6ccr12擴增用引物
(2)表達載體的提取
復(fù)蘇轉(zhuǎn)化有pet32a表達載體的菌株，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，進行質(zhì)粒抽提，具體步驟如下：
m.室溫1000g、1min離心收集菌液；
n.向菌體沉淀中加入250μlsolutioni，槍頭吹打重懸菌體；
o.加入250μlsolutionii，輕輕顛倒混勻幾次直至細(xì)菌懸液變澄清；
p.加入350μlsolutioniii，輕輕顛倒混勻幾次直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀；
q.室溫1000g離心10min；
r.小心盡可能的吸盡上清于一新的hibinddna結(jié)合柱；
s.室溫10000g離心1min，去流出液；
t.向柱中加入500μlbufferhb，室溫10000g離心1min，去流出液；
u.向柱中加入700μlwashbuffer，室溫10000g離心1min，去流出液；
v.重復(fù)步驟i)一次；
w.室溫13000g離心2min使空的minicolumn的濾膜盡量脫水；
x.將hibinddna結(jié)合柱放置于一新的1.5mlep管中，加入15-30μlelutionbuffer于濾膜中央，室溫靜置1min后，室溫13000g離心1min洗脫dna；
m.將上述1.5mlep管于-20℃保存。
(3)雙酶切目的片段和表達載體
a.將步驟(1)膠回收的目的片段和步驟(2)提取的表達載體按表7的體系加樣；
b.混勻后，瞬時離心，37℃酶切0.5h；
c.膠回收酶切后的目的片段和表達載體；
表7quickcut酶切體系
(4)重組表達載體構(gòu)建
a.將步驟(3)雙酶切后回收的目的片段和表達載體按表8體系加樣；
b.16℃連接過夜；
c.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到表達菌bl21的感受態(tài)細(xì)胞中；
d.通過菌落pcr法鑒定陽性克隆，并進行測序。
表8重組表達載體的連接體系
用所設(shè)計的引物通過重組pcr，將趨化因子受體ccr12的n-端區(qū)和3個胞外區(qū)段拼接起來，經(jīng)過膠回收、雙酶切后，連接到pet32a原核表達載體上。轉(zhuǎn)化bl21后，挑取1個陽性克隆測序，此陽性克隆序列完全正確。結(jié)果見圖3，其中泳道1為ccr12的orf區(qū)的克隆，2、3、4、5分別為ccr12的胞外n-端、el1、el2、el3區(qū)段的克隆，泳道6為ccr12的胞外n端和el1重組pcr結(jié)果，泳道7為ccr12的el2和el3重組pcr結(jié)果，泳道8為泳道6和7產(chǎn)物重組pcr結(jié)果。
2、ccr12重組蛋白表達條件的優(yōu)化和可溶性分析
(1)ccr12重組蛋白的誘導(dǎo)表達
a.將上一步驟測序正確的重組蛋白表達菌株接種到一新的含amplb液體培養(yǎng)液中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜；
b.將培養(yǎng)過夜的菌液按照1∶50比例接種到新鮮的lb培養(yǎng)液中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至od600為0.6-0.8；
c.添加iptg至終濃度為1mm，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)6h；
d.取1ml菌液，室溫4000r/min離心5min去掉上清后；
e.以100μl雙蒸水重懸，按照1∶4比例與5×sds-pageloadingbuffer混勻，水浴煮沸5min；
f.將上述樣品進行sds-page凝膠電泳，檢測ccr12重組蛋白是否表達，以pet32a的表達菌株的誘導(dǎo)組作為對照；
(2)重組蛋白表達條件的優(yōu)化
a.iptg的濃度：分別用終濃度0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm的iptg誘導(dǎo)表達菌6h，收集菌體，處理后上樣跑電泳；
b.誘導(dǎo)的時間：在最佳誘導(dǎo)濃度條件下，于誘導(dǎo)后的第0h、2h、4h和6h收集菌體，處理后上樣跑電泳。
將陽性克隆在37℃擴大培養(yǎng)至菌液的od600達到0.6-0.8時，加入0mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm的iptg在30℃誘導(dǎo)表達6h收集菌體，sds-page電泳分析表明，重組蛋白ccr12的最優(yōu)誘導(dǎo)濃度為0.5mm。在此基礎(chǔ)上對誘導(dǎo)的時間進行優(yōu)化。從圖4中可以看出，在誘導(dǎo)4h時，重組蛋白ccr12的表達量已經(jīng)達到最大。因此，大量誘導(dǎo)表達的條件為30℃、0.5mm、4h。
在圖4中，c為重組蛋白的表達量與iptg誘導(dǎo)濃度的關(guān)系，c則為在最優(yōu)的iptg誘導(dǎo)濃度下，蛋白的表達量隨時間變化的關(guān)系。m泳道表示蛋白marker，c中1-6泳道表示在30℃，iptg的使用量分別為0mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm誘導(dǎo)表達6h，重組蛋白的表達情況。c中1-4泳道分別表示在最優(yōu)iptg誘導(dǎo)濃度下，誘導(dǎo)時間為0h、2h、4h和6h時重組蛋白的表達情況，目的蛋白條帶用黑色箭頭標(biāo)出。
(3)重組蛋白可溶性分析
a.用步驟(2)優(yōu)化的條件，誘導(dǎo)重組蛋白表達，離心收集菌體；
b.按原始菌液50∶1比例加入pbs重懸后4℃、10000g離心3min，去上清；
c.加入等量的lysisbuffer重懸菌體，超聲破碎(超聲破碎條件為200w，超聲5s，間隔8s，超聲15min，3個循環(huán))；
d.超聲結(jié)束后，4℃、8000g離心15min，分別收集上清和沉淀；
e.經(jīng)處理后，sds-page檢測重組蛋白的可溶性。
最終sds-page分析表明，ccr12以可溶性形式存在于上清中，參見圖5，其中m泳道表示蛋白marker。1、2、3泳道分別表示全菌液、上清和沉淀。
3、ccr12重組蛋白的純化
(1)將含重組表達載體的bl21菌擴大培養(yǎng)至1000ml，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至od600為0.6-0.8，添加iptg至步驟2優(yōu)化的最優(yōu)終濃度，30℃、200r/min培養(yǎng)適當(dāng)時間；
(2)4℃、1000g離心1min收集全部菌體；
(3)50ml0.01mmpbs重懸菌體，4℃、1000g離心10min去上清；
(4)50mllysisbuffer重懸菌體，超聲破碎，4℃、1000g離心10min收集上清；
(5)通過washbuffer和含不同濃度咪唑的elutionbuffer依次對鎳柱進行洗滌并收集流出液，用sds-page檢測洗脫效果；
(6)純化的蛋白液在pbs中透析過夜后，用超濾離心管進行濃縮，濃縮液-80℃保存。
最終重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后，得到較純的單一目的條帶，參見圖5，其中m泳道表示蛋白marker，泳道4為經(jīng)親和層析處理得到的純化樣品，目的蛋白條帶用黑色箭頭標(biāo)出。
(三)斜帶石斑魚ccr12的多克隆抗體制備及其應(yīng)用：
1、ccr12多克隆抗體制備：
(1)將從廣東省實驗動物中心購買的兩只新西蘭雄兔在無菌動物房適應(yīng)飼養(yǎng)2周；
(2)取約2mg重組蛋白，加入pbs至2ml，加入2ml弗氏完全佐劑，反復(fù)推拉共軛注射器使重組蛋白乳化；
(3)用無菌注射器吸取已與弗氏完全佐劑乳化的重組蛋白，對新西蘭雄兔分多個位點進行皮下注射(注射位點需先用75％酒精棉消毒)，注射劑量為1ml/只；
(4)兩周后，進行加強免疫，以初始免疫一半重組蛋白量與等量的弗氏不完全佐劑乳化混勻后，對新西蘭雄兔進行皮下注射，共加強免疫3次，每次間隔時間均為2周；
(5)最后一次加強免疫7天后，對免疫新西蘭雄兔進行頸動脈采血，室溫靜置2h，4℃過夜，4℃、4000r/min離心30min后小心吸取上層血清，56℃處理30min以滅活補體，用proteina柱子進行純化，分裝后-20℃保存(首免之前采血作為陰性對照)。
2、elisa測定多抗效價：
(1)用包被液稀釋純化的蛋白抗原至20μg/ml，在96孔酶標(biāo)板中每孔加入100μl，4℃過夜包被；
(2)拍干孔中的液體，加入200μl洗滌液，振蕩洗滌3次，每次3min，棄去，拍干；
(3)每孔中加入200μl封閉液，室溫封閉1h；
(4)棄去孔中封閉液，拍干，加入200μl洗滌液，振蕩洗滌3次，每次3min，棄去，拍干；
(5)將多克隆抗體與pbs按照1∶10比例進行連續(xù)的梯度稀釋，每孔中加入100μl，設(shè)置3個平行，以pbs作為陰性對照組，37℃孵育2h；
(6)棄去孔中一抗，拍干，加入200μl洗滌液，振蕩洗滌3次，每次3min，棄去，拍干；
(7)每孔加入100μl稀釋的二抗，避光，37℃孵育2h；
(8)棄去孔中二抗，拍干，加入200μl洗滌液，振蕩洗滌3次，每次3min，棄去，拍干；
(9)配制新鮮底物液，每孔中加入100μl，避光，37℃孵育20min；
(10)每孔中加入50μl終止液，用酶標(biāo)儀檢測450nm波長時各孔的吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)為p/n≥2.1或p≥n+3d。
最終經(jīng)elisa檢測，多克隆抗體的效價為1∶128000，此效價較高，可以滿足后續(xù)免疫組化實驗的需求。
3、westernblotting檢測多抗的特異性：
a：為了檢測制備的多克隆抗體是否能夠識別天然蛋白，分別提取斜帶石斑魚頭腎的總蛋白和膜蛋白進行westernblotting實驗。石斑魚用丁香酚進行麻醉后，取其頭腎組織快速置于一新的1.5mlep管中，置于液氮中保存，用于進行后續(xù)的總蛋白和膜蛋白提取，具體步驟如下。
(3)組織總蛋白的提?。?/p>
e)液氮環(huán)境下充分研磨組織直至成為勻漿狀；
f)向研磨充分的組織中加入組織裂解液，冰浴30min(裂解液實驗前加入pmsf至終濃度為1mm)；
g)超聲破碎儀對裂解樣品進行超聲破碎(程序為超聲破碎5是，間隔10s，2次)；
h)4℃，14000r/min離心15min后小心吸取上清，-80℃保存。
(4)組織膜蛋白的提取
i)往樣品中加入10mmtris-hcl至覆蓋樣品；
j)加入等體積預(yù)冷的tritonx-114抽提緩沖液(緩沖液用前需混勻)，加入pmsf蛋白酶抑制劑至其終濃度為1mm；
k)用漩渦震蕩儀震蕩樣品1min，冰浴5min，如此反復(fù)10次；
l)4℃，12000r/min離心15min后小心吸取上清；
m)向上清中加入等體積的蔗糖緩沖液，30℃水浴5min至出現(xiàn)云霧狀渾濁；
n)12000r/min室溫離心3min混合液將分層，冰上保存油層；
o)油層中加入9倍體積的預(yù)冷丙酮，冰上孵育1h，-20℃過夜；
p)去除丙酮，tris-hcl溶解沉淀蛋白，-80℃保存。
b：多抗的特異性檢測：
(11)抗原蛋白sds-page電泳后，將凝膠按照點樣泳道切割成適當(dāng)大小浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中；
(12)將pvdf膜裁剪成與凝膠相匹配的大小，浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中；
(13)按照黑板(負(fù)極)、泡沫墊、濾紙、凝膠、pvdf膜、濾紙、泡沫墊、白板(正極)的順序固定凝膠和pvdf膜(注意排除氣泡)；
(14)將裝置放入轉(zhuǎn)印槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，100v轉(zhuǎn)膜23min；
(15)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下pvdf膜，加入10％脫脂奶粉室溫封閉1h；
(16)加入適當(dāng)一抗(即制備的ccr12多克隆抗體)，4℃孵育過夜；
(17)棄去一抗，用pbst洗滌3次，每次5min；
(18)加入用10％脫脂奶粉稀釋的二抗室溫孵育1h；
(19)棄去二抗，用pbst洗滌3次，每次5min；
(20)用化學(xué)發(fā)光法進行顯示拍照。
通過westernblotting檢測ccr12多克隆抗體的特異性，結(jié)果如圖6所示，該多克隆抗體能特異性的識別重組蛋白，也能識別天然蛋白(約為41kda)。其中，泳道m(xù)表示marker，泳道1、2、3分別表示趨化因子受體ccr12的重組蛋白純化樣品、頭腎組織全蛋白、頭腎膜蛋白的sds-page結(jié)果，泳道a、b、c則分別為泳道1、2、3的樣品用制得的多抗進行westernblotting的結(jié)果，箭頭分別標(biāo)記多克隆抗體識別的天然蛋白和重組蛋白。
4、多抗的初步應(yīng)用(斜帶石斑魚外周血細(xì)胞免疫組化)：
(25)用適當(dāng)劑量的丁香酚(50mg/ml)將斜帶石斑魚麻醉，用肝素鈉處理過的注射器從尾靜脈采血；
(26)取一干凈的載玻片，滴加一滴抗凝血；
(27)用另一干凈玻片，一端接觸玻片上的血滴，兩玻片成45°角，輕輕移動，使血滴成一直線，由玻片的一端移向另一端，成為均勻的薄層；
(28)血涂片在空氣中干燥后，立即用4％多聚甲醛室溫固定15min；
(29)用pbs洗3次，每次3min；
(30)用0.5％tritonx-100破膜處理20min；
(31)用pbs洗3次，每次3min；
(32)用3％h2o2室溫封閉15min；
(33)用pbs洗3次，每次3min；
(34)將玻片進入檸檬酸緩沖液中，在微波爐中進行抗原修復(fù)15min，室溫冷卻；
(35)用pbs洗3次，每次3min；
(36)用正常山羊血清室溫封閉30min；
(37)甩干玻片上的山羊血清，滴加一抗(即制備的ccr12多克隆抗體)，置于濕盒中，4℃孵育過夜；
(38)取出濕盒，37℃復(fù)溫40min；
(39)用pbs洗3次，每次3min；
(40)滴加二抗，37℃孵育40min；
(41)用pbs洗3次，每次3min；
(42)dab顯色1min，蒸餾水沖洗5min；
(43)蘇木素37℃復(fù)染15min，自來水沖洗5min；
(44)1％鹽酸酸化5s，自來水沖洗5min；
(45)75％、80％、90％、95％、95％、100％、100％乙醇依次脫水3min；
(46)1/2100％乙醇+1/2100％二甲苯處理3min；
(47)二甲苯i、ii透明5min；
(48)中性樹脂封片，37℃過夜后，在顯微鏡下拍照觀察。
制備的趨化因子受體ccr12多克隆抗體通過免疫組化可標(biāo)記血涂片的陽性細(xì)胞，結(jié)果如圖7所示，ccr12陽性細(xì)胞直徑約為9μm，具有不同的核型，包括腎形和圓形。其中a、b分別顯示的是ccr12陽性細(xì)胞的不同核型，a為腎形，b為圓形。
- 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊！