本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于水溶性熒光聚合物快速靈敏檢測(cè)microrna的方法。

背景技術(shù)：

微小rna(microrna)是一種堿基數(shù)目為19～23個(gè)的非編碼的小分子rna，廣泛存在于動(dòng)植物及病毒體內(nèi)，microrna與生物體的多種生理過程密切相關(guān)，包括生長發(fā)育、免疫防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和調(diào)亡、脂肪代謝、腫瘤發(fā)展等。了解microrna的調(diào)節(jié)作用及microrna表達(dá)與人類疾病之間的關(guān)系已經(jīng)引起了研究者極大興趣。calin等首次發(fā)現(xiàn)了microrna的表達(dá)與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)microrna的表達(dá)在多類腫瘤中發(fā)生改變，一些microrna可以直接或間接作為腫瘤抑制基因或者作為癌基因。發(fā)展microrna檢測(cè)方法對(duì)于理解microrna的功能、臨床診斷以及發(fā)現(xiàn)新的靶標(biāo)基因藥物是非常重要的。

基于核酸直接雜交檢測(cè)microrna的方法包括northern印跡法、微陣列芯片法及原位雜交法。由于microrna的一些固有特性：microrna的尺寸小、序列同源性高以及在細(xì)胞中的濃度低，基于核酸直接雜交檢測(cè)microrna方法具有操作繁瑣、耗時(shí)過長、樣品需要量大以及靈敏度和特異性不令人滿意等缺點(diǎn)。為了提高microrna檢測(cè)的靈敏度和特異性，研究者們開發(fā)了多種信號(hào)放大技術(shù)用于microrna檢測(cè)，例如反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rca)、恒溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)(iexpar)、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(sda)等。其中rt-pcr、lcr兩種技術(shù)為變溫反應(yīng)，需要依賴精密的熱循環(huán)儀，在升降溫過程中如果溫度控制不合適，會(huì)引起擴(kuò)增失敗。而且這些技術(shù)都需要有酶的參與，即一種擴(kuò)增技術(shù)需要一種酶甚至多種酶結(jié)合進(jìn)行催化，否則擴(kuò)增反應(yīng)不能發(fā)生，同時(shí)這些擴(kuò)增技術(shù)還需要對(duì)引物及探針序列進(jìn)行復(fù)雜精細(xì)的設(shè)計(jì)，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)操作提出較高專業(yè)性要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種成本低廉、操作簡單，基于水溶性熒光聚合物快速靈敏檢測(cè)microrna的方法。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：

1、設(shè)計(jì)合成探針sh-dna和探針acrydite-dna

根據(jù)目標(biāo)microrna的堿基序列，分別設(shè)計(jì)合成與目標(biāo)microrna中8～13個(gè)堿基序列互補(bǔ)的探針sh-dna和探針acrydite-dna，其中探針sh-dna的3’端修飾巰基，探針acrydite-dna的5’端修飾丙烯酰胺基，且這兩條探針的堿基數(shù)目相差0～3個(gè)；當(dāng)探針sh-dna和探針acrydite-dna與目標(biāo)microrna互補(bǔ)后，探針sh-dna的5′端和探針acrydite-dna的3′端相互毗鄰，且這兩條探針與目標(biāo)microrna互補(bǔ)的堿基數(shù)目之和與目標(biāo)microrna的堿基數(shù)目相同，同時(shí)探針sh-dna的3’端和探針acrydite-dna的5’端分別帶有3～5個(gè)與目標(biāo)microrna互補(bǔ)的堿基相毗鄰的堿基t。

2、巰基標(biāo)記金磁微粒

將探針sh-dna用磷酸三氯乙酯活化，活化后的sh-dna與金磁微粒結(jié)合，得到巰基標(biāo)記的金磁微粒(sh-金磁微粒)。

3、合成dna功能化的水溶性熒光聚合物

以過硫酸銨(aps)和n,n,n’,n’-四甲基乙二胺(temed)的混合物為引發(fā)劑，將丙烯酰胺、丙烯?；鶡晒馑?、探針acrydite-dna進(jìn)行無規(guī)共聚，得到dna功能化的水溶性熒光聚合物。

4、熒光檢測(cè)目標(biāo)microrna

將步驟2得到的巰基標(biāo)記的金磁微粒和步驟3得到的dna功能化的水溶性熒光聚合物與不同濃度的目標(biāo)microrna標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行雜交反應(yīng)，經(jīng)磁分離得到雜交產(chǎn)物，對(duì)雜交產(chǎn)物經(jīng)去雜交、磁分離后所得到的上清液進(jìn)行熒光檢測(cè)，繪制熒光強(qiáng)度隨目標(biāo)microrna標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線；按照該步驟檢測(cè)待測(cè)microrna樣品的熒光強(qiáng)度，結(jié)合繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)microrna的定性和定量檢測(cè)。

上述步驟3中，優(yōu)選丙烯酰胺、丙烯?；鶡晒馑?、探針acrydite-dna的摩爾比為10000:1000:1。

上述步驟4中，優(yōu)選雜交反應(yīng)的溫度為30～40℃，雜交時(shí)間為60～120分鐘。

上述步驟4中，所述熒光檢測(cè)的激發(fā)波長為494nm、發(fā)射波長為512nm。

本發(fā)明的檢測(cè)原理如圖1所示，sh-dna通過au-s鍵自組裝到金磁微粒的表面，形成sh-金磁微粒；acrydite-dna、丙烯酰基熒光素及丙烯酰胺在引發(fā)劑aps和temed存在下發(fā)生聚合反應(yīng)，形成可識(shí)別目標(biāo)microrna的dna功能化的水溶性熒光聚合物。當(dāng)有目標(biāo)microrna存在時(shí)，microrna同時(shí)與sh-dna及acrydite-dna發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，經(jīng)過磁分離去掉未配對(duì)的熒光聚合物后，用naoh水溶液去雜交，去雜交后dna功能化的水溶性熒光聚合物從金磁微粒上脫離，分散在naoh水溶液中，磁分離后，收集上清液，測(cè)定上清液的熒光強(qiáng)度，目標(biāo)microrna的濃度越大，熒光強(qiáng)度越大。

本發(fā)明的有益效果如下：

1、本發(fā)明建立了一種基于水溶性熒光聚合物信號(hào)放大作用直接檢測(cè)目標(biāo)microrna的熒光分析方法，該方法所用dna功能化的水溶性熒光聚合物的聚合物鏈中標(biāo)記的熒光素基團(tuán)多，可以將檢測(cè)的熒光信號(hào)進(jìn)行多倍放大，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)信號(hào)的第一級(jí)放大。同時(shí)，由于熒光報(bào)告基團(tuán)受到聚合物的包裹和保護(hù)，降低了碰撞猝滅，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信號(hào)的第二級(jí)放大。

2、本發(fā)明根據(jù)目標(biāo)microrna的不同可以設(shè)計(jì)不同acrydite-dna與sh-dna序列，達(dá)到檢測(cè)不同種類microrna的目的，而且本發(fā)明檢測(cè)方法的檢出限低、選擇性高。同時(shí)，該方法無需對(duì)目標(biāo)microrna進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)成本和專業(yè)性要求低，操作步驟簡單，分析速度快。

附圖說明

圖1是本發(fā)明方法檢測(cè)microrna的原理圖。

圖2是本發(fā)明方法檢測(cè)microrna-21的工作曲線。

圖3是本發(fā)明方法的選擇性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

以檢測(cè)microrna-21(其堿基序列為5'-uagcuuaucagacugauguuga-3')為例，具體檢測(cè)方法如下：

1、設(shè)計(jì)合成探針sh-dna和探針acrydite-dna

根據(jù)目標(biāo)microrna-21的堿基序列，分別設(shè)計(jì)合成探針sh-dna和探針acrydite-dna，其中探針sh-dna的堿基序列為5'-ctgataagctattttt-sh-3'，探針acrydite-dna的堿基序列為5'-acrydite-ttttttcaacatcagt-3'，acrydite代表丙烯酰胺基。

2、巰基標(biāo)記金磁微粒

將10μl100μmol/l探針sh-dna的pbs緩沖液(ph＝7.4，10mmol/l)置于500μl離心管中，再加入10μl10mmol/l磷酸三氯乙酯的水溶液，常溫活化1小時(shí)，然后將活化后的sh-dna溶液加入到1ml1mg/ml金磁微粒分散液(金磁微粒分散于水中制成)中，常溫振蕩16小時(shí)后，加入100mmol/lph＝7.4的pbs緩沖液使所得混合液中pbs濃度為10mmol/l，繼續(xù)振蕩1小時(shí)，分三次加入1mol/lnacl水溶液，每次加完后靜置6小時(shí)，使最終混合液中nacl的濃度為0.1mol/l；最后在磁分離架上靜置并進(jìn)行磁分離，將所得上清液用移液槍吸出，固體用10mmol/lph＝7.4的pbst緩沖液(含體積分?jǐn)?shù)為0.05％吐溫-20、0.1mol/lnacl)洗滌3次后分散于1ml10mmol/lph＝7.4的pbs緩沖液中，得到巰基標(biāo)記的金磁微粒分散液。

3、合成dna功能化的水溶性熒光聚合物

將3.0000g(9×10^-3mol)熒光素完全溶解于盛有20.00ml干燥的二氯甲烷的圓底燒瓶中，再加入3.00ml三乙胺，磁力攪拌，在冰水浴中充分冷卻；將0.90ml丙烯酰氯溶解于20.00ml二氯甲烷后滴加至圓底燒瓶中，待其在冰水浴中滴加完成后，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去部分二氯甲烷后，傾入大量水中，析出沉淀，過濾，干燥后，在乙醇中重結(jié)晶，得到橙黃色的丙烯?；鶡晒馑亍?/p>

將7.1mg(1×10^-4mol)丙烯酰胺、26μl(1×10^-5mol)丙烯酰基熒光素、30μlph＝8的tris-hcl緩沖液、5μl2mol/l的nacl水溶液、5μl0.1mol/l的十二烷基磺酸鈉水溶液、100μl100μmol/l探針acrydite-dna的tris-hcl緩沖液(ph＝8)加入1.5ml離心管中，通氬氣2分鐘后，加入5μl引發(fā)劑(按每毫升水中加入0.1g過硫酸銨和0.1mln,n,n’,n’-四甲基乙二胺配制而成)，常溫聚合24小時(shí)后，將所得聚合液依次用乙醇和水透析，直到透析液中沒有熒光為止，以除去未聚合的單體，最后將其冷凍干燥24小時(shí)，得到橘黃色dna功能化的水溶性熒光聚合物。經(jīng)高效凝膠色譜儀(ultimate3000)測(cè)定，該水溶性熒光聚合物的數(shù)均分子量為109883，多分散指數(shù)2.86。

4、熒光檢測(cè)microrna

向5個(gè)1.5ml離心管中分別加入10μl步驟2得到的巰基標(biāo)記的金磁微粒分散液，再依次向5個(gè)離心管中加入10μl10^-14mol/l、10^-13mol/l、10^-12mol/l、10^-11mol/l、10^-10mol/lmicrorna-21水溶液，然后再加入20μl步驟3得到的dna功能化的水溶性熒光聚合物的pbs緩沖液(10mmol/l，ph＝7.4)和160μl10mmol/lph＝7.4的pbs緩沖液(含100mmol/lnacl、10mmol/lmgcl2)，所得混合溶液在30℃水浴中孵育90分鐘，使探針sh-dna和探針acrydite-dna與microrna-21充分雜交。待雜交完成后，將離心管放在磁分離架上靜置3分鐘進(jìn)行磁分離，將所得上清液用移液槍吸出，雜交產(chǎn)物用10mmol/lph＝7.4的pbst緩沖液(含體積分?jǐn)?shù)為0.05％吐溫-20、0.1mol/lnacl)洗滌3次，再加入200μl0.15mol/l的naoh水溶液將其浸泡15分鐘進(jìn)行去雜交，去雜交后再進(jìn)行磁分離，所得上清液采用rf-5301型熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長為494nm、發(fā)射波長為512nm下進(jìn)行熒光檢測(cè)，繪制熒光強(qiáng)度隨microrna-21濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

由圖2可見，熒光強(qiáng)度與microrna-21的濃度之間存在良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y＝83.17lgc+1231.62，式中c為microrna-21的濃度(單位mol/l)，y為熒光強(qiáng)度，相關(guān)系數(shù)r²為0.9943。按iupac建議，根據(jù)3σ，計(jì)算出該方法的檢出限為1.44fmol/l。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)microrna-21具有高靈敏檢測(cè)的能力。

為了證明本發(fā)明檢測(cè)方法的選擇性，發(fā)明人采用實(shí)施例1的方法分別對(duì)microrna-21(5'-uagcuuaucagacugauguuga-3')、單堿基錯(cuò)配的microrna(5'-uagcuuaucagaccgauguuga-3')、三堿基錯(cuò)配的microrna(5'-uagccuaucagaccgaaguuga-3')、任意序列的microrna(5'-cugaccuaugaauugacagcca-3')進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見圖3。由圖3可見，microrna-21對(duì)應(yīng)體系產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，將其定為100％時(shí)，單堿基錯(cuò)配的microrna以及三堿基錯(cuò)配的microrna對(duì)應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度分別為33％和14％，任意序列的microrna對(duì)應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度與空白基本相同，表明該方法能夠很好的區(qū)分這四種核酸序列，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)microrna的選擇性檢測(cè)。

核苷酸或氨基酸序列表

[0001]

序列表

<110>陜西師范大學(xué)

<120>基于水溶性熒光聚合物快速靈敏檢測(cè)microrna的方法

<160>6

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>待測(cè)microrna-21序列

<400>1

uagcuuaucagacugauguuga22

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>根據(jù)待測(cè)microrna-21序列設(shè)計(jì)的探針sh-dna，以用作磁分離雜交產(chǎn)物

<400>2

ctgataagctattttt16

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>根據(jù)待測(cè)microrna-21序列設(shè)計(jì)的探針acrydite-dna，以用作識(shí)別檢測(cè)microrna-21

<400>3

ttttttcaacatcagt16

<210>4

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>單堿基錯(cuò)配的microrna，作為檢測(cè)microrna-21時(shí)的選擇性的對(duì)比序列

<400>4

uagcuuaucagaccgauguuga22

<210>5

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>三堿基錯(cuò)配的microrna，作為檢測(cè)microrna-21時(shí)的選擇性的對(duì)比序列

<400>5

uagccuaucagaccgaaguuga22

<210>6

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>任意序列的microrna，作為檢測(cè)microrna-21時(shí)的選擇性的對(duì)比序列

<400>6

cugaccuaugaauugacagcca22