本發(fā)明涉及發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)基的優(yōu)化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵培養(yǎng)基及其優(yōu)化方法。

背景技術(shù)：

隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)在世界范圍內(nèi)的迅速興起，由于食品安全、環(huán)境保護(hù)的需要，國家對肥料、農(nóng)藥提出了一系列的要求和限制，因此，微生物肥料在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用越來越受到重視。而芽孢桿菌具有耐儲存，抗逆性強(qiáng)和耐鹽堿等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此，固氮類芽孢桿菌又在微生物肥料制備和應(yīng)用上起著至關(guān)重要的作用。固氮類芽孢桿菌(paenibacillussp.)1-49是一種具有高效固氮酶活性，可以固定空氣中的n2，并把它轉(zhuǎn)化成供農(nóng)作物直接利用的nh4⁺，從而達(dá)到減少化肥用量的目的，同時又能有效促進(jìn)作物生長的類芽孢桿菌。然而，固氮類芽孢桿菌在普通培養(yǎng)基中生長緩慢甚至不生長，或者產(chǎn)芽孢數(shù)很低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。為了在固氮類芽孢桿菌的工業(yè)生產(chǎn)中，降低生產(chǎn)成本而又能提高固氮類芽孢桿菌的產(chǎn)量，特此對固氮類芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵培養(yǎng)基及其優(yōu)化方法，該發(fā)酵培養(yǎng)基既能降低生產(chǎn)成本而又能提高固氮類芽孢桿菌的產(chǎn)量。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

一種固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵培養(yǎng)基，它由以下質(zhì)量的原料制成：豆餅粉15-20g，玉米淀粉5-8g，蔗糖6-10g，酵母粉5-8g，mgso4·7h2o0.2-0.5g，caco31-3g，mnso4·h2o0.01-0.03g，kh2po40.25-0.75g，蒸餾水1000ml，ph7.0-7.5。

優(yōu)選的，一種固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵培養(yǎng)基，它由以下質(zhì)量的原料制成：豆餅粉16-18g，玉米淀粉6-7g，蔗糖8-9g，酵母粉6-7g，mgso4·7h2o0.3-0.4g，caco32.0-3.0g，mnso4·h2o0.02-0.03g，kh2po40.4-0.6g，蒸餾水1000ml，ph7.2-7.4。

更為優(yōu)選的，一種固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵培養(yǎng)基，它由以下質(zhì)量的原料制成：豆餅粉17g，玉米淀粉6g，蔗糖8g，酵母粉6g，mgso4·7h2o0.4g，caco32.0g，mnso4·h2o0.02g，kh2po40.5g，蒸餾水1000ml，ph7.3。

上述固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法，它包括以下步驟：

1)、氮源的確定

在相等的氮含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母粉，豆餅粉，(nh4)2so4及不同組合作為氮源配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，檢測活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳氮源；

2)、碳源的確定

確定氮源后，在保持碳含量不變的條件下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為碳源配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，檢測活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳碳源；

3)、碳氮比的確定

確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料質(zhì)量比)配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，檢測活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳的c/n比；

4)、ph的確定

分別配制ph值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，檢測活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳ph。

其中，步驟1)-步驟4)中發(fā)酵培養(yǎng)具體為：接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為180-220r/min，28-36℃培養(yǎng)22-24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，28-36℃培養(yǎng)46-48h，制得固體種。

其中，步驟1)-步驟4)中發(fā)酵培養(yǎng)具體為：接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為200r/min，32℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48h，制得固體種。

其中，步驟1)-步驟4)中液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

其中，步驟1)-步驟4)中固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

其中，步驟1)-步驟4)中活菌的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，搖散得10^-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10^-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10^-2濃度稀釋液，取0.1ml10^-2濃度稀釋液到無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中并涂勻，37℃培養(yǎng)48h，然后數(shù)培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)，即可檢測得活菌。

其中，步驟1)-步驟4)中芽孢率的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，轉(zhuǎn)速為200r/min，20min搖散得10^-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10^-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10^-2濃度稀釋液，依次這樣稀釋到10^-3濃度稀釋液，取0.01ml10^-3濃度稀釋液滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找?guī)讉€清晰的畫面，數(shù)畫面中的芽孢數(shù)和桿數(shù)，取其平均值，即可得到其芽孢率。

本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明以固氮類芽孢桿菌1-49為出發(fā)菌株，通過單因素和正交試驗(yàn)進(jìn)行固體發(fā)酵的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以提高固氮類芽孢桿菌1-49產(chǎn)孢量；優(yōu)化后的培養(yǎng)基配料，能直接應(yīng)用于固氮類芽孢桿菌1-49發(fā)酵，大大提高生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)化；固氮類芽孢桿菌1-49作為一種新的微生物菌劑，在未來的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，將有良好的應(yīng)用前景。

(2)本發(fā)明針對固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵配方進(jìn)行優(yōu)化，克服了固氮芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量低的困難，大大提高了產(chǎn)孢量，增強(qiáng)了固氮類芽孢桿菌1-49的應(yīng)用效果；

(3)本發(fā)明針對固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵配方進(jìn)行優(yōu)化能夠有效地降低生產(chǎn)成本。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

固氮類芽孢桿菌(paenibacillussp.)1-49編號為strainnumbercgmccno.4966，是類芽孢桿菌屬的一種。呈桿狀，周生鞭毛，能運(yùn)動。革蘭氏陽性菌，芽孢橢圓到梭狀。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，好氧菌。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法，它包括以下步驟：

1)、氮源的確定

在相等的氮含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母粉，豆餅粉，(nh4)2so4及不同組合作為氮源配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為180r/min，28℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳氮源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1氮源對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)(nh4)2so4不利于培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢，發(fā)酵48h后的培養(yǎng)基的芽孢率都比較低；而蛋白胨和酵母粉同時作為氮源對培養(yǎng)基的活菌數(shù)和芽孢率都有提高。

2)、碳源的確定

確定氮源后，在保持碳含量不變的條件下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為碳源配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為180r/min，28℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳碳源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2碳源對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，葡萄糖有利于固氮類芽孢桿菌的生長，但產(chǎn)生芽孢少，發(fā)酵后培養(yǎng)基的芽孢率低。綜合考慮發(fā)酵后培養(yǎng)基中的活菌數(shù)和芽孢率，可以明顯地得出玉米淀粉和蔗糖同時作為碳源時對固氮類孢芽桿菌的生長和產(chǎn)芽孢都有利，適合于大規(guī)?；墓I(yè)化生產(chǎn)。

3)、碳氮比的確定

確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料質(zhì)量比)配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為180r/min，28℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳c/n比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3碳氮比對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中只有碳源和氮源中的一種時，發(fā)酵后檢測出的活菌數(shù)和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生產(chǎn)；而如果培養(yǎng)基中碳源和氮源都有時，可以看出發(fā)酵后培養(yǎng)基的芽孢率相差不大。而對于大規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)，需要的是活菌數(shù)和芽孢率都高的生產(chǎn)配方，當(dāng)碳氮比為2:1可以滿足生產(chǎn)需求。

4)、ph的確定

分別配制ph值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為180r/min，28℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳ph。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4ph對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)ph值對培養(yǎng)基的芽孢率影響不大，基本上都在90％左右，ph值主要是影響培養(yǎng)基的活菌數(shù)。綜合表中的活菌數(shù)和芽孢率兩項(xiàng)指標(biāo)，得出ph值為7.5時培養(yǎng)基的活菌數(shù)和芽孢率都很高，符合規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)。

步驟1)-步驟4)中活菌的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，搖散得10^-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10^-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10^-2濃度稀釋液，取0.1ml10^-2濃度稀釋液到無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中并涂勻，37℃培養(yǎng)48h，然后數(shù)培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)，即可檢測得活菌。

步驟1)-步驟4)中芽孢率的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，轉(zhuǎn)速為200r/min，20min搖散得10^-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10^-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10^-2濃度稀釋液，依次這樣稀釋到10^-3濃度稀釋液，取0.01ml10^-3濃度稀釋液滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找?guī)讉€清晰的畫面，數(shù)畫面中的芽孢數(shù)和桿數(shù)，取其平均值，即可得到其芽孢率。

本發(fā)明采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，對固氮類芽孢桿菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究，確定固氮類芽孢桿菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：豆餅粉15g，玉米淀粉5g，蔗糖6g，酵母粉5g，mgso4·7h2o0.2g，caco31g，mnso4·h2o0.01g，kh2po40.25g，ph7.5，蒸餾水1000ml。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法，它包括以下步驟：

1)、氮源的確定

在相等的氮含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母粉，豆餅粉，(nh4)2so4及不同組合作為氮源配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為200r/min，32℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳氮源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1氮源對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)(nh4)2so4不利于培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢，發(fā)酵48h后的培養(yǎng)基的芽孢率都比較低；而蛋白胨和酵母粉同時作為氮源對培養(yǎng)基的活菌數(shù)和芽孢率都有提高。

2)、碳源的確定

確定氮源后，在保持碳含量不變的條件下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為碳源配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為200r/min，32℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳碳源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2碳源對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，葡萄糖有利于固氮類芽孢桿菌的生長，但產(chǎn)生芽孢少，發(fā)酵后培養(yǎng)基的芽孢率低。綜合考慮發(fā)酵后培養(yǎng)基中的活菌數(shù)和芽孢率，可以明顯地得出玉米淀粉和蔗糖同時作為碳源時對固氮類孢芽桿菌的生長和產(chǎn)芽孢都有利，適合于大規(guī)模化的工業(yè)化生產(chǎn)。

3)、碳氮比的確定

確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料質(zhì)量比)配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為200r/min，32℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳c/n比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3碳氮比對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中只有碳源和氮源中的一種時，發(fā)酵后檢測出的活菌數(shù)和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生產(chǎn)；而如果培養(yǎng)基中碳源和氮源都有時，可以看出發(fā)酵后培養(yǎng)基的芽孢率相差不大。而對于大規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)，需要的是活菌數(shù)和芽孢率都高的生產(chǎn)配方，當(dāng)碳氮比為2:1可以滿足生產(chǎn)需求。

4)、ph的確定

分別配制ph值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為200r/min，32℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳ph。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4ph對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)ph值對培養(yǎng)基的芽孢率影響不大，基本上都在90％左右，ph值主要是影響培養(yǎng)基的活菌數(shù)。綜合表中的活菌數(shù)和芽孢率兩項(xiàng)指標(biāo)，得出ph值為7.5時培養(yǎng)基的活菌數(shù)和芽孢率都很高，符合規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)。

步驟1)-步驟4)中活菌的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，搖散得10^-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10^-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10^-2濃度稀釋液，取0.1ml10^-2濃度稀釋液到無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中并涂勻，37℃培養(yǎng)48h，然后數(shù)培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)，即可檢測得活菌。

步驟1)-步驟4)中芽孢率的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，轉(zhuǎn)速為200r/min，20min搖散得10^-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10^-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10^-2濃度稀釋液，依次這樣稀釋到10^-3濃度稀釋液，取0.01ml10^-3濃度稀釋液滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找?guī)讉€清晰的畫面，數(shù)畫面中的芽孢數(shù)和桿數(shù)，取其平均值，即可得到其芽孢率。

本發(fā)明采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，對固氮類芽孢桿菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究，確定固氮類芽孢桿菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：豆餅粉17g，玉米淀粉6g，蔗糖8g，酵母粉6g，mgso4·7h2o0.4g，caco32.0g，mnso4·h2o0.02g，kh2po40.5g，蒸餾水1000ml，ph7.5。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的固氮類芽孢桿菌1-49的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法，它包括以下步驟：

1)、氮源的確定

在相等的氮含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母粉，豆餅粉，(nh4)2so4及不同組合作為氮源配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為220r/min，36℃培養(yǎng)22h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)46h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳氮源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1氮源對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)(nh4)2so4不利于培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢，發(fā)酵48h后的培養(yǎng)基的芽孢率都比較低；而蛋白胨和酵母粉同時作為氮源對培養(yǎng)基的活菌數(shù)和芽孢率都有提高。

2)、碳源的確定

確定氮源后，在保持碳含量不變的條件下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為碳源配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為220r/min，36℃培養(yǎng)22h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)46h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳碳源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2碳源對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，葡萄糖有利于固氮類芽孢桿菌的生長，但產(chǎn)生芽孢少，發(fā)酵后培養(yǎng)基的芽孢率低。綜合考慮發(fā)酵后培養(yǎng)基中的活菌數(shù)和芽孢率，可以明顯地得出玉米淀粉和蔗糖同時作為碳源時對固氮類孢芽桿菌的生長和產(chǎn)芽孢都有利，適合于大規(guī)?；墓I(yè)化生產(chǎn)。

3)、碳氮比的確定

確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料質(zhì)量比)配制液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為220r/min，36℃培養(yǎng)22h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)46h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳c/n比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3碳氮比對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中只有碳源和氮源中的一種時，發(fā)酵后檢測出的活菌數(shù)和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生產(chǎn)；而如果培養(yǎng)基中碳源和氮源都有時，可以看出發(fā)酵后培養(yǎng)基的芽孢率相差不大。而對于大規(guī)模化的工業(yè)生產(chǎn)，需要的是活菌數(shù)和芽孢率都高的生產(chǎn)配方，當(dāng)碳氮比為2:1可以滿足生產(chǎn)需求。

4)、ph的確定

分別配制ph值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養(yǎng)基的其他組分包括以下質(zhì)量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)具體為：用接種環(huán)接種1環(huán)固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為220r/min，36℃培養(yǎng)22h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)46h，制得固體種。

檢測固體種的活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳ph。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4ph對固氮類芽孢桿菌生長的影響

通過對比觀察，可以發(fā)現(xiàn)ph值對培養(yǎng)基的芽孢率影響不大，基本上都在90％左右，ph值主要是影響培養(yǎng)基的活菌數(shù)。綜合表中的活菌數(shù)和芽孢率兩項(xiàng)指標(biāo)，得出ph值為7.5時培養(yǎng)基的活菌數(shù)和芽孢率都很高，符合規(guī)模化的工業(yè)生產(chǎn)。

步驟1)-步驟4)中活菌的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，搖散得10^-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10^-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10^-2濃度稀釋液，取0.1ml10^-2濃度稀釋液到無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中并涂勻，37℃培養(yǎng)48h，然后數(shù)培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)，即可檢測得活菌。

步驟1)-步驟4)中芽孢率的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，轉(zhuǎn)速為200r/min，20min搖散得10^-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10^-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10^-2濃度稀釋液，依次這樣稀釋到10^-3濃度稀釋液，取0.01ml10^-3濃度稀釋液滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找?guī)讉€清晰的畫面，數(shù)畫面中的芽孢數(shù)和桿數(shù)，取其平均值，即可得到其芽孢率。

本發(fā)明采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，對固氮類芽孢桿菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究，確定固氮類芽孢桿菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：豆餅粉20g，玉米淀粉8g，蔗糖10g，酵母粉8g，mgso4·7h2o00.5g，caco33g，mnso4·h2o0.03g，kh2po40.75g，ph7.5，蒸餾水1000ml。

最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)地說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。