本發(fā)明涉及基因工程和遺傳工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體及其基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

β-葡萄糖苷酶能水解結(jié)合于非還原性末端的β-d-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出β-d-葡萄糖和相應(yīng)的配基，是纖維素分解酶系中的重要組成成分。

β-葡萄糖苷酶在飼料工業(yè)、食品工業(yè)、生物合成以及生物燃料等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。農(nóng)業(yè)飼料豆粕中含有豐富的大豆異黃酮，且在天然大豆中大豆異黃酮主要以結(jié)合型存在。然而，研究表明結(jié)合型糖苷不能直接被小腸壁吸收，因此必須將結(jié)合型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為游離型大豆異黃酮才能發(fā)揮其藥理功效。β-葡萄糖苷酶可以將結(jié)合型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為游離型活性苷元，在豆粕飼料中添加一定的β-葡萄糖苷酶可以提高動(dòng)物對大豆異黃酮的利用率。

在以玉米豆粕型日糧為主的飼料行業(yè)，單胃動(dòng)物中胃腸道內(nèi)的大豆異黃酮的水解是在一個(gè)較高的葡萄糖濃度環(huán)境下進(jìn)行的，淀粉類能量物質(zhì)水解產(chǎn)生的葡萄糖濃度遠(yuǎn)大于大豆異黃酮的濃度，因此顯著抑制腸道內(nèi)β-葡萄糖苷酶的活性，通過外源添加具有高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶是提高單胃動(dòng)物腸道內(nèi)大豆異黃酮的水解效率，提高飼料利用率的一個(gè)有效途徑。

β-葡萄糖苷酶也被廣泛應(yīng)用于食品醫(yī)藥領(lǐng)域，在醫(yī)藥領(lǐng)域也具有重要應(yīng)用。另外，在纖維素乙醇行業(yè)，具有高耐受性的β-葡萄糖苷酶不僅可以減弱中間產(chǎn)物纖維二糖對上游eg和bgh的反饋抑制作用，也可以減弱產(chǎn)物葡萄糖對自身酶活的抑制。

因此，篩選或者改造得到較高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶對該酶的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體。

本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的基因。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發(fā)明的另一目的是提供一種較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用。

本發(fā)明以來源于嗜酸耐熱脂環(huán)酸芽孢桿菌alicyclobacillussp.a4的β-葡萄糖苷酶為母本，采用分子生物學(xué)技術(shù)對β-葡萄糖苷酶序列進(jìn)行定點(diǎn)突變表達(dá)。

根據(jù)本發(fā)明的較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體，是β-葡萄糖苷酶的催化通道非活性位點(diǎn)單點(diǎn)突變后得到的突變體，即β-葡萄糖苷酶的315位氨基酸由組氨酸“h”突變?yōu)榫彼帷皉”

所較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的氨基酸序列如seqidno.1所示。

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編碼上述高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

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本發(fā)明還提供一種制備較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶的方法：

1)以野生型重組質(zhì)粒asbg1-pet30a(+)為模板，采用over-lappcr的方法，一步擴(kuò)增得到含有較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體h315r-pet30a(+)；

2)將突變體重組載體轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得突變株，優(yōu)選為h315r-pet30a(+)-bl21(de3)。

本發(fā)明還提供了包含上述β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體，優(yōu)選為h315r-pet30a(+)。將本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶突變體基因與合適的表達(dá)載體進(jìn)行連接，作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選over-lappcr的方法，一步擴(kuò)增得到含有較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體h315r-pet30a(+)；

本發(fā)明還提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株h315r-pet30a(+)-bl21(de3)。

本發(fā)明還提供了上述較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的應(yīng)用，例如作為飼料添加劑，應(yīng)用于單胃動(dòng)物的玉米豆粕型日糧飼料中。

本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有β-葡萄糖苷酶的不足，提供一種在水解大豆異黃酮時(shí)，具有較高耐受性或具有更好酶活促進(jìn)效果的β-葡萄糖苷酶突變體。本發(fā)明的高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶突變體水解底物pnpg時(shí)，葡萄糖的半抑制濃度ic50為1200mm，比野生型高出400mm。在水解1mm大豆苷時(shí)，10mm葡萄糖對野生型和突變體的酶活促進(jìn)作用分別為163％和212％。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體與野生型β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受型曲線；

圖2為大豆苷水解時(shí)的葡萄糖耐受性hplc圖譜，其中，(a)未添加葡萄糖；(b)添加葡萄糖。

具體實(shí)施方式

試驗(yàn)材料和試劑

1、菌株及載體：表達(dá)宿主大腸桿菌bl21(de3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，表達(dá)質(zhì)粒載體pet30a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

2、酶類及其它生化試劑：kod-plus-neo高保真dna聚合酶購自toyobo公司，質(zhì)粒小提中量試劑盒購自tiangen，dmt酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。對硝基苯β-d-葡萄糖苷(p-nitrophenylβ-d-glucopy-ranoside，pnpg)購自sigma公司，大豆苷(daidzin)購自梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

實(shí)施例1高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的制備

本發(fā)明以來源于嗜酸耐熱脂環(huán)酸芽孢桿菌alicyclobacillussp.a4β-葡萄糖苷酶asbg1(其氨基酸序列如seqidno.3)為母本，采用分子生物學(xué)技術(shù)對asbg1進(jìn)行單點(diǎn)突變后表達(dá)。

seqidno.3如下所示：

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以野生型重組質(zhì)粒asbg1-pet30a(+)為模板，在β-葡萄糖苷酶突變位點(diǎn)的左右各17bp處設(shè)計(jì)長約34bp并包含突變位點(diǎn)序列的突變引物，一步擴(kuò)增得到含有較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體h315r-pet30a(+)。并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞bl21(de3)，獲得重組表達(dá)菌株h315r-pet30a(+)-bl21(de3)。

表1.較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的突變引物

a，下劃線表示突變位點(diǎn)序列

將構(gòu)建好的重組表達(dá)菌株h315r-pet30a(+)-bl21(de3)過夜活化，后按1％轉(zhuǎn)接至裝有300mllb培養(yǎng)液(含50μg/mlkana)的1l大瓶中，37℃，220rpm培養(yǎng)至od600值約為0.6-0.8(約2-3h)時(shí)加入終濃度為0.6mmiptg誘導(dǎo)表達(dá)，并轉(zhuǎn)至28℃，190rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)約8-10h。12,000rpm，10min離心收集菌體。粗酶液采用his-tag蛋白磁珠純化，經(jīng)酶活測定和sds-page驗(yàn)證，收集得到純蛋白洗脫峰。

實(shí)施例2重組高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體和野生型的比活分析

β-葡萄糖苷酶活性的測定：在405nm下測定酶水解底物pnpg所生成的產(chǎn)物對硝基苯酚(pnp)的量。

反應(yīng)步驟：125μl4mmpnpg底物與125μl緩沖液混勻，加入250μl適當(dāng)稀釋的酶液，于55℃反應(yīng)10min，加入1.5ml1mol/l的na2co3終止反應(yīng)，使用分光光度計(jì)測定od405值。

酶活單位的定義：1個(gè)β-葡萄糖苷酶活性單位(u)定義為在給定反應(yīng)條件下，每分鐘分解底物pnpg生成1μmol對硝基苯酚(pnp)所需的酶量。

酶活測定表明：在反應(yīng)條件下，測得野生型酶比活為54u/mg，重組較高葡萄糖耐受型突變體酶比活為52u/mg，兩者相差不大。

實(shí)施例3重組β-葡萄糖苷酶突變體和野生型的葡萄糖耐受性曲線測定

以pnpg為底物，分別測定重組β-葡萄糖苷酶突變體和野生型在不同葡萄糖濃度梯度(0-3mol/l)下突變體和野生型的酶比活，以添加葡萄糖的反應(yīng)組和未添加葡萄糖的對照組酶活的相對比值表征相應(yīng)濃度葡萄糖對突變體或野生型酶活的促進(jìn)作用。以相應(yīng)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，相對酶活為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖耐受性曲線。

測定結(jié)果(圖1)表明，重組較高葡萄糖耐受型突變體的葡萄糖耐受型顯著提高，野生型酶的ic50為800mm，重組較高葡萄糖耐受型突變體β-葡萄糖苷酶的ic50提高至1200mm。

實(shí)施例4重組β-葡萄糖苷酶突變體和野生型水解大豆苷時(shí)的葡萄糖耐受性測定

以大豆苷為底物測定重組β-葡萄糖苷酶突變體及野生型的葡萄糖耐受性，反應(yīng)體系為400μl，由終濃度為1mm的大豆苷、外源添加的終濃度0或10mm的葡萄糖和適當(dāng)稀釋的酶液組成，最適條件下反應(yīng)10min后，于沸水浴5min終止反應(yīng)。水解產(chǎn)物成分分析用反向高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，以底物大豆苷的水解率來表征酶活的高低。水解率＝100％×(ac-at)/ac,其中ac和at分別表示空白組(未加酶液)和處理組(加酶液)的底物峰面積。hplc圖譜如圖2，對圖譜進(jìn)行定量分析表明，葡萄糖對重組較高葡萄糖耐受型突變體的酶活促進(jìn)作用為212％，對野生型酶活促進(jìn)作用為163％，突變體的葡萄糖促進(jìn)作用高于野生型。

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所

<120>高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體及其基因和應(yīng)用

<160>3

<210>1

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<213>人工序列

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<213>嗜酸耐熱脂環(huán)酸芽孢桿菌alicyclobacillussp.a4

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