本發(fā)明涉及檢測黃曲霉毒素m1的核酸適配體，本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有該核酸適配體的傳感器及用其制備的檢測黃曲霉毒素m1的試劑盒，本發(fā)明還涉及它們在檢測黃曲霉毒素m1中的應(yīng)用，屬于黃曲霉毒素m1的檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素m1(afm1)是奶產(chǎn)品中毒性最強(qiáng)的霉菌毒素之一，對人類健康帶來巨大的危害。afm1被世界衛(wèi)生組織(who)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)指定為1類致癌物。當(dāng)奶牛采食了含有afb1的發(fā)霉飼料后，就會在牛奶里產(chǎn)生代謝物afm1。為了阻止由于污染的飼料和食品的召回帶來的食品安全恐慌和經(jīng)濟(jì)損失，很多國家對afm1進(jìn)行了限量。不同食品afm1的限量范圍為0.05-0.5μgkg^-1。因此，為確保食品安全，開發(fā)簡單，靈敏和特異性的afm1檢測方法非常重要。

目前已有的黃曲霉毒素檢測方法主要有：

定量檢測afm1的液相色譜結(jié)合熒光檢測器和液相色譜結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，這些儀器檢測方法需要專業(yè)的操作人員和昂貴的儀器設(shè)備。

一些快速免疫學(xué)方法如elisa，免疫傳感器方法也得到了廣泛的應(yīng)用。但是在運(yùn)輸和貯存過程中抗體的穩(wěn)定性難以保證限制了這類方法的應(yīng)用。

與抗體有著類似功能的核酸適配體，具有低價格，高穩(wěn)定性，易修飾和易合成等優(yōu)點(diǎn)，可以重復(fù)使用和長時間保存。經(jīng)體外篩選獲得的核酸適配體能與目標(biāo)物質(zhì)高特異性地結(jié)合，因此被廣泛應(yīng)用于生物傳感器檢測領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種用于檢測黃曲霉毒素m1的核酸適配體；

本發(fā)明的目的之二是提供一種檢測黃曲霉毒素m1的核酸適配體傳感器；

本發(fā)明的目的之三是提供一種含有所述核酸適配體傳感器的用于檢測黃曲霉毒素m1的試劑盒；

本發(fā)明的目的之四是將所述的核酸適配體、核酸適配體傳感器以及試劑盒用于檢測黃曲霉毒素m1，實(shí)現(xiàn)靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單的檢測黃曲霉毒素m1的效果。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先提供一種黃曲霉毒素m1核酸適配體，其為如下所示核苷酸序列：

5′-atccgtcacacctgctctgacgctggggtcgacccg-3′(seqidno:1)。

本發(fā)明還提供一種檢測黃曲霉毒素m1的核酸適配體傳感器，該核酸適配體傳感器由以下四部分組成：

(1)dna序列a：由以下dna序列構(gòu)成的dna模板：5′-ggtgtgacggatxaxb-3′；其中，xa和xb分別代表a個和b個任意堿基，a＝b＝20—30；

優(yōu)選的，所述dna序列a為如下核苷酸序列：

5′-ggtgtgacggataatctggtttagctacgccttccccgtggcgatgtttcttagcgccttac-3′(seqidno:2)。

(2)dna序列b：seqidno:1所述的黃曲霉毒素m1核酸適配體，其中，在3’端修飾生物素；

(3)pcr引物1，所述pcr引物1的長度為20-30nt，且序列具有如下特征：5’-xc-3’，5’端的20-30個堿基與dna序列a的xb段互補(bǔ)配對；其中，x為任意堿基，c或b為堿基數(shù)量，c＝b＝20-30；

優(yōu)選的，所述pcr引物1的核苷酸序列如下：

5′-gtaaggcgctaagaaacatcg-3′(seqidno:3)。

(4)pcr引物2，所述pcr引物2的長度為20-30nt，且序列具有如下特征：5’-xd-3’，5’端的20-30個堿基與dna序列a的xa段相同；其中，x代表任意堿基，a或d代表堿基數(shù)量，d＝a＝20-30。

優(yōu)選的，所述pcr引物2的核苷酸序列如下：

5′-aatctggtttagctacgccttc-3′(seqidno:4)。

本發(fā)明所述黃曲霉毒素m1核酸適配體傳感器通過混合上述四種組分進(jìn)行組裝即可獲得。

本發(fā)明還提供一種檢測黃曲霉毒素m1的試劑盒，該試劑盒包括以下組分：

(1)pcr管修飾溶液；

(2)傳感器溶液；

(3)pcr體系溶液；

(4)黃曲霉毒素m1提取溶液；

其中，所述pcr管修飾溶液包括以下組分：戊二醛溶液、碳酸鹽緩沖液、鏈霉親和素；其中，所述戊二醛溶液、碳酸鹽緩沖液的濃度分別優(yōu)選為0.8％、0.01m，鏈霉親和素的濃度優(yōu)選為2.5-5ngml^-1，進(jìn)一步優(yōu)選為2.5ngml^-1。

所述傳感器溶液包括以下各組分：

所述黃曲霉毒素m1核酸適配體傳感器、pbst緩沖液、雜交緩沖液、tris緩沖液；其中，所述傳感器溶液中dna序列a的濃度優(yōu)選為1×10^-3-10nm，進(jìn)一步優(yōu)選為10nm；所述傳感器溶液中dna序列b的濃度優(yōu)選為5-40nm，進(jìn)一步優(yōu)選為10nm；所述傳感器溶液中pcr引物1和pcr引物2的濃度優(yōu)選為5-20μm，進(jìn)一步優(yōu)選為10μm。

所述的pcr體系溶液，可以為商購dna聚合酶時所帶的反應(yīng)液，也可以為根據(jù)反應(yīng)原理配制而成的反應(yīng)液，其中包括以下組分：sybrgreen染料，taqdna聚合酶，pcr緩沖液，dntp，水。

所述黃曲霉毒素m1提取液可以為任意能溶解黃曲霉毒素m1的溶液，優(yōu)選為甲醇溶液，所述甲醇溶液的濃度可以根據(jù)需要確定，例如，可以為70％甲醇溶液。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了所述試劑盒檢測黃曲霉毒素m1的方法，包括以下步驟：

(1)將含有黃曲霉毒素m1的待測樣品與黃曲霉毒素m1提取液混合，渦旋震蕩，離心并取上清液；

(2)將所述上清液與傳感器溶液混合并孵育；

(3)棄去步驟(2)所述混合液，并用tris緩沖液洗脫；

(4)加入pcr體系溶液，經(jīng)定量pcr檢測熒光信號。

優(yōu)選的，步驟(1)中所述待測樣品與黃曲霉毒素m1提取液的重量比為1:3—1:100。

步驟(2)中所述孵育的溫度優(yōu)選為45℃，孵育時間優(yōu)選為1h。

所述pcr體系溶液可以根據(jù)商購聚合酶時的使用說明確定。

本發(fā)明的試劑盒采用定量pcr法，其檢測原理如下：

首先利用pcr管修飾溶液將pcr管表面修飾上鏈霉親和素；將生物素修飾的黃曲霉毒素m1核酸適配體與pcr管表面修飾的鏈霉親和素結(jié)合，從而將黃曲霉毒素m1核酸適配體固定到pcr管表面；將dna序列a與黃曲霉毒素m1核酸適配體dna(b)通過互補(bǔ)組裝成傳感器。樣品中游離的黃曲霉毒素m1與黃曲霉毒素m1核酸適配體dna(b)特異性結(jié)合，使得dna序列a從pcr管表面脫落，釋放到溶液中，從而觸發(fā)傳感器，通過pcr技術(shù)擴(kuò)增得到信號的放大。如果樣品中游離的黃曲霉毒素m1量多，則脫落下來的dna序列a多，pcr管表面剩余的dna序列a少，則需更多的循環(huán)數(shù)才能達(dá)到熒光閾值。反之，則少。設(shè)置不同濃度梯度的黃曲霉毒素m1標(biāo)準(zhǔn)品，通過上述方法檢測出信號，將檢測不同濃度的黃曲霉毒素m1得到的信號做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)際樣品中的的黃曲霉毒素m1濃度可通過對比標(biāo)準(zhǔn)曲線得到。

本發(fā)明所述的黃曲霉毒素m1核酸適配體、所述黃曲霉毒素m1核酸適配體傳感器和所述試劑盒可應(yīng)用于檢測黃曲霉毒素m1。

本發(fā)明使用核酸適配體作為識別單元，具有選擇性好的特點(diǎn)。采用本發(fā)明的核酸適配體制備的傳感器測定黃曲霉毒素m1靈敏度高，使用pcr技術(shù)作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行信號放大，大大的降低了檢測限，可達(dá)0.03ng/l。

本發(fā)明中，所述pcr是指聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction)，該術(shù)語的含義和技術(shù)步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。

附圖說明

圖1本發(fā)明核酸適配體傳感器檢測黃曲霉毒素m1的原理圖。

圖2定量pcr檢測黃曲霉毒素m1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3定量pcr檢測黃曲霉毒素m1的擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

通過下列實(shí)施例將更具體說明本發(fā)明的實(shí)施方式，但是應(yīng)理解所述實(shí)例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明中的pcr體系溶液中premixex和roxreferencedyeii(50×)反應(yīng)液均為商購。

實(shí)施例1傳感器溶液的制備

將dna序列a和dna序列b反應(yīng)液混合。其中，dna序列a、dna序列b的濃度均為10nm。

其中，dna序列a的序列為：

5′-ggtgtgacggataatctggtttagctacgccttccccgtggcgatgtttcttagcgccttac-3′。

dna序列b的序列為：

5′-atccgtcacacctgctctgacgctggggtcgacccg-biotin-3′。

制備pcr體系溶液：

將pcr引物1、pcr引物2、premixex和roxreferencedyeii(50×)反應(yīng)液混合；其中，pcr引物1、pcr引物2的濃度均為10μm。

其中，pcr引物1的序列為：

5′-gtaaggcgctaagaaacatcg-3′。

pcr引物2的序列為：

5′-aatctggtttagctacgccttc-3′。

實(shí)施例2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

50μl0.8％戊二醛溶液處理pcr管37℃5h；超純水洗三次之后，添加0.01m碳酸鹽緩沖液溶解的鏈霉親和素50μl孵育2h(37℃)；

磷酸鹽緩沖液洗兩次之后，適配體和互補(bǔ)dna1:1(v/v)充分混合，50μl的混合物添加到每個管中孵育1h(37℃)；

雜交緩沖液洗三次，50μl不同濃度梯度(濃度分別為0.1ng/l、1ng/l、0.01μg/l、0.1μg/l、1μg/l)的黃曲霉毒素m1標(biāo)準(zhǔn)品；

tris緩沖液洗三次之后添加pcr體系溶液，經(jīng)定量pcr檢測熒光信號，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

實(shí)施例3檢測樣品中黃曲霉毒素m1的含量

稱取0.5g被檢測樣品，加入2.5ml0.05ngml^-1黃曲霉毒素m1標(biāo)準(zhǔn)溶液與其充分混勻，然后加入2.5ml70％甲醇?；旌衔餃u旋震蕩5min后于10000g離心10min。收集上清液氮吹濃縮至0.5ml。加入2ml5％甲醇復(fù)溶；定量pcr檢測熒光信號。

定量pcr檢測黃曲霉毒素m1的擴(kuò)增曲線見圖3，根據(jù)實(shí)施例2測出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定檢測樣品中黃曲霉毒素m1的含量為0.045ngml^-1。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所

<120>檢測黃曲霉毒素m1的核酸適配體、傳感器、試劑盒及應(yīng)用

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