本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段檢測(cè)微生物耐藥基因的方法，具體為一種用于檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1922年，細(xì)菌學(xué)家從鼻涕培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了一種“溶菌酶”，這便是青霉素的原型。1927年，弗萊明正式發(fā)表文章聲明青霉素的發(fā)現(xiàn)。但直到1939年澳大利亞人費(fèi)羅里和德國(guó)人錢(qián)恩，才發(fā)明了青霉素的提純技術(shù)，兩年之后青霉素開(kāi)始正式應(yīng)用于臨床。從此，細(xì)菌性疾病的治療進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代。在之后的數(shù)十年里，抗菌藥物家族不斷壯大，新型抗菌藥物不斷被用于感染性疾病的治療，為無(wú)數(shù)與疾病斗爭(zhēng)的人們帶來(lái)了福音。但隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，細(xì)菌耐藥突變菌株的出現(xiàn)再一次讓感染性疾病的治療成為世界難題。有研究表明，人類“超級(jí)細(xì)菌”——抗甲氧西林金黃色牛源大腸桿菌，其中部分變異菌株是來(lái)自于豬的一種新型細(xì)菌。全球因各類傳染病平均每年死亡1700多萬(wàn)人，其中耐藥菌株的廣泛傳播和多重耐藥菌株的出現(xiàn)為其主要原因之一。據(jù)報(bào)道，1972年墨西哥有1萬(wàn)余人感染耐氯霉素傷寒桿菌，導(dǎo)致一千多人治療無(wú)效死亡；1992年美國(guó)有1.3萬(wàn)余人死于耐藥突變菌的感染。大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道中最主要的一種共生菌，亦是危害人類及動(dòng)物健康的重要致病菌，其某些血清型具有強(qiáng)致病性，可引起人類和多種動(dòng)物發(fā)生腹瀉，甚至死亡。由于大腸桿菌并多并發(fā)或繼發(fā)于其他病毒或細(xì)菌性疾病，所以在畜禽養(yǎng)殖中抗菌藥物常常作為飼料添加劑使用，往往會(huì)給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種檢測(cè)喹諾酮類藥物對(duì)大腸桿菌突變選擇窗的影響，探明牛源大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀及流行的耐藥基因類型的方法，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個(gè)堿基t。表1分子標(biāo)記序列名稱序列(5’-3’)seqidno.p1-fnh2-t(10)gcaaaccggactacgtcacc1p1-rtcaatcctcttcggagttccc2p2-fnh2-t(10)acgtctatgccaaccgtcctg3p2-rgcagtgccaccgccaatgtcc4p3-fnh2-t(10)tgtaacacgcaagcacgatg5p3-raaccttctccgccccgagt6所述分子標(biāo)記在制備檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。優(yōu)選的，所述試劑盒檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的牛源大腸桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個(gè)菌落，向無(wú)菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋50～400倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標(biāo)記在細(xì)菌感染治療過(guò)程中可以實(shí)時(shí)檢測(cè)耐藥突變菌株的產(chǎn)生，能夠?qū)咕幬锏目咕Я捌浞滥退幫蛔兡芰M(jìn)行評(píng)價(jià)；(2)本發(fā)明所述分子標(biāo)記具有特異性高、靈敏度強(qiáng)、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例1～3檢測(cè)結(jié)果圖；其中，m為分子量為1000bp的maker；1為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；2為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；3為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種用于檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個(gè)堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的牛源大腸桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個(gè)菌落，向無(wú)菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例2一種用于檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個(gè)堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的牛源大腸桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個(gè)菌落，向無(wú)菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋400倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例3一種用于檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個(gè)堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的牛源大腸桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個(gè)菌落，向無(wú)菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。sequencelisting<110>蘇州喬納森新材料科技有限公司<120>一種用于檢測(cè)牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gcaaaccggactacgtcacc20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2tcaatcctcttcggagttccc21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3acgtctatgccaaccgtcctg21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4gcagtgccaccgccaatgtcc21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tgtaacacgcaagcacgatg20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6aaccttctccgccccgagt19當(dāng)前第1頁(yè)12