本發(fā)明屬于基因工程疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火雞皰疹病毒株。

背景技術(shù)：

我國(guó)自1994年首次報(bào)道從雞群中分離到h9亞型禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)以來，該亞型禽流感在我國(guó)一直呈地方性流行，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。h9亞型aiv傳播能力強(qiáng)，流行范圍廣，感染家禽主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降，該亞型病毒雖然對(duì)雞低致病性，但并發(fā)或繼發(fā)感染其他病原可引起高發(fā)病率和死亡率，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前滅活疫苗的使用成為預(yù)防和控制禽流感的主要手段，但常規(guī)的滅活疫苗存在著一些難以克服的缺陷：滅活疫苗生產(chǎn)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且油乳佐劑會(huì)引起局部的不良反應(yīng)，導(dǎo)致動(dòng)物不適和肉質(zhì)下降；不能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答和粘膜免疫igg抗體的產(chǎn)生，因而無法有效地抑制呼吸道中流感病毒的復(fù)制；免疫效率低下，免疫劑量大，不能與自然感染區(qū)分，影響禽流感的監(jiān)控，而且存在著散毒的危險(xiǎn)等。因此，急需研制新型禽流感疫苗來克服現(xiàn)有疫苗的不足。而基因重組活載體疫苗在很大程度上可以避免上述情況。

目前用于構(gòu)建重組病毒的活載體有很多，如馬立克氏病毒(mdv-1)、火雞皰疹病毒(hvt)、新城疫病毒(ndv)、鴨瘟病毒(dev)、傳染性喉氣管炎病毒(iltv)、雞痘病毒(fpv)等。與其他禽病毒載體相比，hvt具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其優(yōu)勢(shì)主要包括：hvt有20多個(gè)可供外源基因插入的復(fù)制非必需區(qū)，因此其復(fù)制非必需區(qū)可以插入較長(zhǎng)外源基因，有利于構(gòu)建多價(jià)重組活疫苗，其中已報(bào)道的復(fù)制非必需區(qū)有us1、us2、us3、us6、us10、us7、ul23、ul44、ul45、ul46、tk、pk等；hvt可在雞體內(nèi)持續(xù)感染，為外源基因的表達(dá)提供良好的活載體，可以刺激機(jī)體持續(xù)的產(chǎn)生抗體；hvt作為疫苗對(duì)雞無致病性，不影響其生產(chǎn)性能，安全性好；hvt可刺激機(jī)體產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，接種一次可達(dá)到終生免疫的效果；hvt具有很強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合特性，可以在細(xì)胞間傳播；以hvt為載體的基因工程苗可以突破母源抗體的干擾等。因此，以hvt為載體的基因工程苗具有廣闊的應(yīng)用前景。

就aiv而言，ha蛋白作為主要免疫保護(hù)性抗原，是體液免疫的靶抗原，主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此如何能夠以火雞皰疹病毒(hvt)為載體進(jìn)行h9亞型禽流感病的活疫苗研究成為一項(xiàng)亟待攻克的難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)h9亞型禽流感病毒ha基因重組火雞皰疹病毒株，該病毒株可用于家禽中誘導(dǎo)針對(duì)h9亞型aiv的保護(hù)性免疫應(yīng)答。

本發(fā)明首先提供一種在火雞皰疹病毒中插入外源基因的方法，是將外源基因插入火雞皰疹病毒(hvt)的兩個(gè)插入位點(diǎn)us2和us10，

更具體的，所述的插入位點(diǎn)位于hvt基因組us2區(qū)的140276nt-140285nt之間。

本發(fā)明再一方面提供一種重組火雞皰疹病毒，是通過在火雞皰疹病毒的us2區(qū)和us10區(qū)分別插入h9亞型禽流感病毒ha基因和h9亞型禽流感病毒的ha2基因構(gòu)建的；

本發(fā)明所提供的表達(dá)h9亞型禽流感病毒ha基因重組火雞皰疹病毒(rhvt-h9-ha)株，于2017年1月18日保藏在位于中國(guó)武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:v201707。

本發(fā)明的rhvt-h9-ha株用于表達(dá)ha基因蛋白，

本發(fā)明的rhvt-h9-ha株的另一方面的用途是用于制備疫苗；

本發(fā)明以火雞皰疹病毒(hvt)fc-126疫苗毒株為載體，分別以其復(fù)制非必需區(qū)us2和us10為插入位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)egfp標(biāo)記基因的重組病毒rhvt-egfp。本發(fā)明選擇h9亞型禽流感病毒yz140706株的ha基因完整的開放閱讀框和ha2基因分別構(gòu)建表達(dá)盒，再次利用同源重組原理，用上述兩個(gè)基因表達(dá)盒分別替換重組病毒rhvt-egfp的標(biāo)記基因egfp，分別篩選出表達(dá)完整ha基因和部分ha基因的重組hvt。

免疫保護(hù)評(píng)價(jià)結(jié)果表明，本發(fā)明的rhvt-h9-ha株對(duì)h9亞型禽流感病毒，可以提供100％攻毒保護(hù)。

附圖說明

圖1：轉(zhuǎn)移的構(gòu)建模式圖；

圖2：重組病毒rhvt-h9-ha的構(gòu)建示意圖；

圖3：ha基因及其表達(dá)盒pcr電泳圖；

圖4：重組病毒rhvt-egfp的熒光圖；

圖5：重組病毒rhvt-h9-ha的噬斑圖；

圖6：鑒定重組病毒rhvt-h9-ha外源基因表達(dá)的ifa試驗(yàn)；

圖7：鑒定重組病毒rhvt-h9-ha外源基因表達(dá)的western-blot試驗(yàn)圖片；

圖8：hvt親本毒和重組病毒在cef上的生長(zhǎng)曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面以構(gòu)建表達(dá)ha基因完整開放閱讀框的重組hvt為例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，。

實(shí)施例1

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1毒株、菌株和質(zhì)粒

hvtfc-126疫苗株由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。

h9亞型aiva/chicken/yangzhou/14/0706(h9n2)株(yz140706株)由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保藏。

感受態(tài)細(xì)胞trans-t1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；雞胚成纖維細(xì)胞系(df-1)由青島易邦生物工程有限公司保藏。

質(zhì)粒：peasy-t3，peasy-blunt，peasy-m1購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；pcr2.1、pt-egfp由本揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存，其中pt-egfp包含表達(dá)綠色熒光蛋白(gfp)的表達(dá)盒，表達(dá)盒兩端分別有notⅰ和avrⅱ酶切位點(diǎn)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1中間轉(zhuǎn)移載體pfr的構(gòu)建

2.1.1同源臂引物的設(shè)計(jì)

選擇hvt的us2區(qū)插入外源基因，參照genbank中登錄的hvtfc126株(登錄號(hào)：af291866)的全基因序列，用primerpremier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別pcr擴(kuò)增fwd、rev同源臂。fwd同源臂上游引入kpnⅰ酶切位點(diǎn)，下游引入speⅰ和avrⅱ酶切位點(diǎn)。rev同源臂上游引入notⅰ酶切位點(diǎn)，下游引入apaⅰ酶切位點(diǎn)。引物序列如下：

fwd-f:5'-gaaggtaccttctaaatggaaagaaaacaaggcg-3'

fwd-r:5'-aaaactagtcctaggacgttccccagctgcaggggctt-3'

rev-f:aaagcggccgcgagccgataatttgatatacgc

rev-r:tattgggcccggagcgagagatgaaagaatact

引物用超純水稀釋至10μm，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2轉(zhuǎn)移載體pfr的構(gòu)建

以hvtfc-126株感染cef病變細(xì)胞的總dna為模板，分別以fwd-f/fwd-r和rev-f/rev-r為引物擴(kuò)增fwd、rev同源臂，回收目的片段?；厥债a(chǎn)物與peasytm-t3克隆載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。測(cè)序鑒定正確的克隆，分別命名為pt-fwd和pt-rev，提取質(zhì)粒，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將質(zhì)粒pt-fwd和pcr2.1用kpnⅰ、speⅰ進(jìn)行酶切，1％凝膠電泳后切膠回收pt-fwd載體中的fwd片段和線性化pcr2.1載體。將回收后的fwd片段和線性化載體pcr2.1連接，構(gòu)建質(zhì)粒p-f。將質(zhì)粒pt-rev和p-f用notⅰ和apaⅰ進(jìn)行酶切，1％凝膠電泳后切膠回收pt-rev載體中的rev片段和線性化載體p-f，將回收后的rev片段和線性化載體p-f連接，構(gòu)建質(zhì)粒p-fr。

2.2真核表達(dá)載體pt-cmv-ha的構(gòu)建

2.2.1引物設(shè)計(jì)

參照genbank中登錄的h9亞型aiv的ha基因序列和peasy-m1載體序列，用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別用于pcr擴(kuò)增ha基因和peasy-m1載體表達(dá)盒。ha基因下游去掉終止密碼子后，添加v5標(biāo)簽。擴(kuò)增peasy-m1載體表達(dá)盒引物的5’端引入notⅰ位點(diǎn)，引物3’端引入avrⅱ位點(diǎn)。

cmv-pa-f:5’-gtatagcggccgccgatgtacgggccagatatacg-3’

cmv-pa-r:5’-gaaatcctaggtggggataccccctagagccc-3’

ha-f：5’-aagatggagacagtatcactaataac-3’

ha-r:5’-tatacaaatgttgcatctgcaagac-3’

ha2-f:5’-aagatgtctgctaggtcttatcaaa-3’

ha2-r:5’-gatccaaatgttgcaatcgcaagac-3’

引物用超純水稀釋至10μm，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2ha基因的擴(kuò)增

取禽流感病毒h9亞型yz140706株無菌尿囊液400μl，提取rna，以ha-f/ha-r為引物，進(jìn)行rt-pcr，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，回收產(chǎn)物放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；其中ha基因的核苷酸序列為seqidno:1，ha2的核苷酸序列為seqidno:2。

2.2.3pcr產(chǎn)物連接與陽性克隆的鑒定

將上述回收的目的片段定向連接到真核表達(dá)載體peasy-m1中，pcr鑒定陽性克隆送測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為pm1-h9-ha。

2.2.4克隆載體pt-cmv-ha的構(gòu)建

以質(zhì)粒pm1-h9-ha為模板，以cmv-pa-f/cmv-pa-r為引物，pcr擴(kuò)增ha基因表達(dá)盒。反應(yīng)結(jié)束后，pcr產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳?；厥沾笮〖s為3000bp左右目的條帶?；厥债a(chǎn)物連接peasytm-t3克隆載體，鑒定正確的陽性克隆命名為pt-cmv-h9-ha。

2.3轉(zhuǎn)移載體pfr-egfp和pfr-ha的構(gòu)建

質(zhì)粒pt-egfp、pt-cmv-h9-ha和p-fr用notⅰ、avrⅱ進(jìn)行雙酶切。1％凝膠電泳后，回收notⅰ-egfp-avrⅱ、notⅰ-h9-ha-avrⅱ片段，與同樣經(jīng)notⅰ、avrⅱ酶切的線性化載體p-fr進(jìn)行連接。構(gòu)建的陽性克隆分別命名為pfr-egfp、pfr-h9-ha。

2.4轉(zhuǎn)移載體的鑒定表達(dá)

2.4.1載體pfr-egfp的鑒定

將構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)移載體pfr-egfp瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到長(zhǎng)至80％的df1細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)18～24h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

2.4.2載體pfr-h9-ha的鑒定

①western-blot試驗(yàn)

轉(zhuǎn)移載體pfr-h9-ha轉(zhuǎn)染df1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。western-blot試驗(yàn)鑒定蛋白表達(dá)。

②間接免疫熒光試驗(yàn)(ifa)

轉(zhuǎn)移載體pfr-h9-ha瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于鋪有df1細(xì)胞的96孔板中，24h后進(jìn)行簡(jiǎn)接免疫熒光，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光情況。

2.5表達(dá)egfp的重組火雞皰疹病毒(rhvt-egfp)構(gòu)建

2.5.1hvtfc-126株基因組的提取

按常規(guī)方法制備cef，hvtfc-126毒株接種于長(zhǎng)滿單層cef的細(xì)胞瓶中，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60～84h，待80％的細(xì)胞產(chǎn)生典型蝕斑病變后，收集細(xì)胞，用于提取病毒dna。具體操作步驟如下：棄掉培養(yǎng)液，pbs洗三次，每t75細(xì)胞瓶加入5mlpk(20mmtris-hcl，ph8.0；0.5％sds；150mmnacl；2mmedta，ph8.0；0.2mg/ml胰蛋白酶)溶液，37℃培養(yǎng)箱靜置2h；細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，加入1/2體積的飽和酚(使蛋白變性)，輕輕顛倒混勻，作用1min；加入1/2體積的的氯仿/異戊醇(24:1)溶液，輕輕混勻，8000r/min離心15min；吸取上清于新離心管中，再次加入等體積的氯仿/異戊醇抽提雜蛋白，8000r/min離心5min；吸取上清于新離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積的3m醋酸鈉(ph5.2)，-20℃靜置30min；4500r/min離心5min，棄上清，加入10ml預(yù)冷的70％乙醇清洗dna沉淀物，4500r/min離心10min，棄上清，瞬離吸干上清；自然干燥后，加適量te緩沖液溶解dna；紫外分光光度計(jì)測(cè)定dna的濃度及純度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2表達(dá)egfp的重組病毒拯救

轉(zhuǎn)染前制備次代cef細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)于加入m199培養(yǎng)基(含3％類胎牛血清)的60mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿單層的80％時(shí)，配制轉(zhuǎn)染體系，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用磷酸鈣共沉淀法拯救重組病毒，配制體系如下：

上述體系混勻后，從管底緩慢加入2mcacl231μl；緩慢加入2×hbsp溶液(10mg/mlherpes；0.74mg/mlkcl；16mg/mlnacl；0.25mg/mlna2hpo4；2mg/ml葡萄糖，ph值調(diào)至6.96)250μl，輕輕顛倒混勻，室溫靜置30min；向制備次代cef的60mm培養(yǎng)皿中加入上述混合物，37℃，5％co2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)4h后，配制甘油休克液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行休克。配制2.5ml體系如下：

取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄掉培養(yǎng)基，用m199培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2～3次；加甘油休克液靜置1min；再次用m199培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2～3次；加適量3％m199培養(yǎng)基(含3％類胎牛血清)；37℃，5％co2條件下培養(yǎng)5～7d，熒光顯微鏡下觀察，挑選帶有綠色熒光的病毒蝕斑。

2.5.3重組病毒rhvt-egfp的純化

熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用記號(hào)筆標(biāo)注出帶有綠色熒光的病毒蝕斑，胰酶消化法挑取標(biāo)記的病變細(xì)胞，接種于次代cef單層細(xì)胞上，37℃，5％co2條件下培養(yǎng)3～4d；重復(fù)上述步驟，至所有蝕斑均顯示熒光，完全純化的重組病毒命名為rhvt-egfp。

2.6表達(dá)h9亞型aiv重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建

將重組病毒rhvt-egfp接種于原代cef細(xì)胞上，待80％細(xì)胞出現(xiàn)特征性病變時(shí)，提取細(xì)胞基因組，提取步驟同上。依據(jù)同源重組原理，將轉(zhuǎn)移載體pfr-h9-ha與rhvt-egfp基因組磷酸鈣法轉(zhuǎn)染次代cef細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同上。若rhvt-egfp基因組dna與轉(zhuǎn)移載體在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，即轉(zhuǎn)移載體中ha基因表達(dá)盒將重組病毒rhvt-egfp基因組中的egfp表達(dá)盒替換，產(chǎn)生新的重組病毒蝕斑將不含有綠色熒光。篩選不帶熒光的病毒蝕斑，采用有限稀釋法不斷篩選純化，直至培養(yǎng)皿中所有蝕斑均不帶有熒光，拯救成功重組病毒命名為rhvt-h9-ha；于2017年1月18日保藏在位于中國(guó)武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:v201707。

2.7重組病毒的傳代及鑒定

2.7.1pcr鑒定

rhvt-h9-ha在cef連續(xù)傳20代，每隔5代次，以rhvt-h9-ha基因組為模板，以ha-f和ha-r為引物進(jìn)行pcr，均可擴(kuò)增出1700bp左右的目的條帶，表明ha基因成功插入到hvt基因組中，并未出現(xiàn)基因丟失現(xiàn)象。

2.7.2western-blot試驗(yàn)鑒定

重組病毒rhvt-h9-ha接種原代cef細(xì)胞，3～4d后收集病變細(xì)胞制備蛋白樣品。western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，試驗(yàn)中用h9亞型禽流感病毒陽性血清作為一抗，用hrp標(biāo)記的羊抗雞igg作為二抗。試驗(yàn)中設(shè)置陰性對(duì)照(用rhvt-egfp細(xì)胞毒制備蛋白樣品)。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(ecl)顯色，結(jié)果表明，由接種rhvt-h9-ha的cef制備的蛋白樣品可以擴(kuò)增出預(yù)期的特異性條帶，而陰性對(duì)照樣品未出現(xiàn)特異性條帶出現(xiàn)。

2.7.3間接免疫熒光試驗(yàn)(ifa)鑒定

將重組病毒rhvt-h9-ha接種于長(zhǎng)滿單層cef的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5％co2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)典型蝕斑后，將培養(yǎng)液棄掉，用80％丙酮固定10min，pbs洗3次，每個(gè)空中加入50μl(1:100稀釋)flag單抗，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1h，用pbs洗3次，每孔加50μlfitc標(biāo)記抗鼠igg熒光抗體，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1h，用pbs洗3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察，rhvt-h9-ha感染孔出現(xiàn)特異性綠色熒光，而hvt感染孔無熒光，表明rhvt-h9-ha病毒株中ha基因能夠正確的表達(dá)。

2.8重組病毒對(duì)h9亞型aiv的免疫保護(hù)評(píng)價(jià)

將120只1日齡spf雞隨機(jī)分成6組，分別為rhvt-us2-h9-ha組、rhvt-us10-h9-ha組、rhvt-us2-h9-ha2組、rhvt-us10-h9-ha2組、滅活疫苗免疫組、攻毒對(duì)照組；其中rhvt-us2-h9-ha組于1日齡時(shí)通過頸部皮下接種5000pfu保藏編號(hào)為cctccno:v201707的重組疫苗、rhvt-us10-h9-ha組于1日齡時(shí)通過頸部皮下接種5000pfurhvt-us10-h9-ha、rhvt-us2-h9-ha2組于1日齡時(shí)通過頸部皮下接種5000pfurhvt-us2-h9-ha2、rhvt-us10-h9-ha2組于1日齡時(shí)通過頸部皮下接種5000pfurhvt-us10-h9-ha2，滅活疫苗免疫組于14日齡時(shí)通過肌肉注射接種1羽份的青島易邦生物工程有限公司滅活疫苗ybf003株，攻毒對(duì)照組均接種無菌pbs。各組于28日齡用1×10⁵eld50劑量的h9亞型aiv經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼途徑進(jìn)行攻毒。攻毒后3d、5d，各試驗(yàn)組隨機(jī)抽取10只雞采集喉頭、泄殖腔棉拭樣品，監(jiān)測(cè)各組試驗(yàn)雞的排毒情況，從表中可以看出rhvt-us2-h9-ha組于攻毒后3d、5d均不排毒，攻毒保護(hù)率可達(dá)100％，而rhvt-us2-h9-ha2組、rhvt-us10-h9-ha組、rhvt-us2-h9-ha2組有部分雞排毒，攻毒對(duì)照組全部排毒，保護(hù)率為0。

每組隨機(jī)挑選10羽spf雞，從1日齡開始，每隔7天采血，分離血清用于血凝抑制試驗(yàn)抗體效價(jià)的測(cè)定；通過抗體效價(jià)的監(jiān)測(cè)來揭示雞群免疫重組疫苗后外源基因在體內(nèi)的表達(dá)水平。

免疫評(píng)價(jià)結(jié)果表明，在hvt基因組的us2區(qū)，構(gòu)建的表達(dá)ha基因完整開放閱讀框的重組hvt可以提供更好的免疫保護(hù)效果。

2.9重組病毒在體外生長(zhǎng)特性評(píng)價(jià)

將hvt親本毒(fc126株)、表達(dá)禽流感ha基因的重組病毒(保藏編號(hào)為cctccno:v201707的重組病毒rhvt-us2-h9-ha、rhvt-us10-h9-ha、rhvt-us2-h9-ha2、rhvt-us10-h9-ha2)以100pfu的毒量接種于長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的35mmdish中，37℃，5％co2條件下培養(yǎng)，分別在病毒感染的不同時(shí)間點(diǎn)(0h，24h，48h，72h，84h和96h)用胰酶消化法收集細(xì)胞，檢測(cè)病毒滴度：用m199培養(yǎng)基將收集的細(xì)胞毒定容至1ml，采用有限稀釋法對(duì)病毒液進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，設(shè)置6個(gè)稀釋度；分別接種于長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)；96h后顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)板，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度，從而繪制出hvt和重組病毒在cef上的生長(zhǎng)曲線(圖8)。結(jié)果表明，在us2區(qū)構(gòu)建表達(dá)完整ha基因開放閱讀框的重組病毒rhvt-h9-ha具有更好的體外生長(zhǎng)特性。

sequencelisting

<110>揚(yáng)州大學(xué)青島易邦生物工程有限公司

<120>一種表達(dá)h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火雞皰疹病毒株

<130>

<160>2

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<211>1683

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