技術(shù)領(lǐng)域:

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于對(duì)不同銀杏進(jìn)行基因分型的snp引物及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

銀杏(ginkgobilobal.)作為裸子植物銀杏綱(ginkgopsida)現(xiàn)存唯一種，典型的中生代孑遺物種，素有“活化石”之美譽(yù)。銀杏為落葉大喬木，樹干高大，雌雄異株。樹皮幼時(shí)淺綠色，老樹呈灰褐色，深縱裂，粗糙；分枝繁茂，分長短枝。種子核果狀，有臭味；中種皮骨質(zhì)，白色，具2～3棱；內(nèi)種皮膜質(zhì)淡褐色，子葉2片；花期4～5月，9～10月種子成熟。銀杏集材用、果用、葉用、園林綠化、觀賞于一體，是一種全能的樹種。銀杏葉中含有大量的銀杏黃酮類和銀杏內(nèi)酯類物質(zhì)，對(duì)治療神經(jīng)病，骨髓病和腦病有獨(dú)特的效用。銀杏葉的非凡藥用價(jià)值，已經(jīng)使銀杏葉制劑形成了一個(gè)巨大的產(chǎn)業(yè)。

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)是指單個(gè)核苷酸的變異引起的基因組水平上dna序列的多態(tài)性，其形式包括單堿基的插入、缺失、轉(zhuǎn)換和顛換。在群體中，其等位基因頻率大于1％，但有時(shí)也把cdna中頻率小于1％的單堿基變異稱之為snp。snp標(biāo)記是繼rflp和ssr之后發(fā)展起來的第三代分子標(biāo)記，并廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種中，具有遺傳穩(wěn)定性高；密度高、分布廣；二態(tài)性和等位基因性；富有代表性；易于實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化檢測(cè)的特點(diǎn)。因此，snp被認(rèn)為是應(yīng)用前景最好的遺傳標(biāo)記之一。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序質(zhì)量的提高和成本的降低，挖掘snp位點(diǎn)并借此進(jìn)行相關(guān)研究的例子越來越多。但該技術(shù)在植物中的應(yīng)用多集中于農(nóng)作物，在林木類方面的研究相對(duì)較少，且在銀杏這一物種上的研究更是未見報(bào)道。隨著時(shí)代的發(fā)展，野生資源的保護(hù)至關(guān)重要，對(duì)于孑遺樹種古銀杏保護(hù)不容忽視。因此，現(xiàn)急需一種快速、方便、可靠的銀杏古樹名木資源分子鑒定技術(shù)。利用dna分子標(biāo)記方法繪制dna指紋圖譜，能從本質(zhì)上反映生物個(gè)體間的差異。常規(guī)的dna指紋圖譜是采用第二代分子標(biāo)記簡(jiǎn)單序列重復(fù)(ssr)進(jìn)行的，但是第三代分子標(biāo)記snp，無須基于凝膠電泳進(jìn)行指紋圖譜的檢測(cè)，減少誤差，省時(shí)，且高通量，準(zhǔn)確性高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于對(duì)不同銀杏進(jìn)行基因分型的snp引物，為84株古樹名木建立指紋圖譜。本發(fā)明的另一目的是提供上述snp引物的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于對(duì)不同古銀杏進(jìn)行基因分型的snp引物，由22對(duì)引物組成，各引物的核苷酸序列如下表所示：

應(yīng)用所述的snp引物構(gòu)建銀杏古樹名木的指紋圖譜，獲得84個(gè)銀杏古樹名木對(duì)應(yīng)的指紋圖譜，如下表所示：

所述的應(yīng)用snp引物構(gòu)建銀杏古樹名木的指紋圖譜，所使用的引物為11，名稱分別：snp1，snp4，snp6，snp8，snp10，snp14，snp16，snp17，snp19，snp20，snp22。

所述snp引物在不同古銀杏基因組dna的snp位點(diǎn)基因分型檢測(cè)中的應(yīng)用。

所述的應(yīng)用，包括以下步驟：

1)待測(cè)銀杏樣品dna的提取；

2)使用相同反應(yīng)體系及程序?qū)︺y杏樣本基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到待測(cè)銀杏的pcr產(chǎn)物；

3)對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率溶解曲線分析確定snp位點(diǎn)的基因型；

4)sanger測(cè)序再次驗(yàn)證snp基因型。

步驟2)中，pcr反應(yīng)體系10μl：25ng模板dna；1xforget-me-not^tmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o補(bǔ)齊。

步驟2)中，pcr反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃2min；95℃變性5s，45個(gè)循環(huán)；60℃復(fù)性30s。

步驟3)中，hrm的反應(yīng)程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明的引物共22對(duì)，其中11對(duì)snp引物組合可以用于構(gòu)建銀杏古樹名木的指紋圖譜。本發(fā)明利用銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的snp引物能夠?qū)︺y杏進(jìn)行基因分型，并且本發(fā)明操作方法簡(jiǎn)單，通量高，成本低。此外，本發(fā)明開發(fā)的11對(duì)snp引物構(gòu)建了不同銀杏古樹名木的指紋圖譜，驗(yàn)證的22個(gè)snp位點(diǎn)還可以用來分子標(biāo)記輔助育種，遺傳多樣性研究，基于snp的關(guān)聯(lián)分析，以及用于種質(zhì)資源鑒定與分類等。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1)結(jié)果高度準(zhǔn)確、可靠：利用本發(fā)明進(jìn)行檢測(cè)與鑒定，檢測(cè)結(jié)果100％準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果提供了高度的可靠性，為銀杏古樹名木提供指紋圖譜，對(duì)野生資源的保護(hù)意義重大。

2)操作快速簡(jiǎn)便：進(jìn)行不同個(gè)體間的樣本檢測(cè)，一般整個(gè)試驗(yàn)過程只需幾小時(shí)即可完成，與傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)相比，省時(shí)省力，可以實(shí)現(xiàn)高通量。

3)無需基于凝膠電泳進(jìn)行，減少試劑和耗材的使用，更佳環(huán)保，同時(shí)節(jié)省人力和減少人工誤差。

4)檢測(cè)結(jié)果靈敏度高：對(duì)待檢測(cè)樣品僅需提供模板dna25ng即可準(zhǔn)確進(jìn)行鑒定。

附圖說明

圖1是從銀杏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定出的snp及其變異類型和數(shù)目結(jié)果圖；

圖2是以引物snp18為例，在不同古銀杏個(gè)體表現(xiàn)出的擴(kuò)增曲線圖；

圖3是以引物snp18為例，利用高分辨率溶解曲線分析后，不同古銀杏個(gè)體表現(xiàn)出不同的溶解曲線峰圖；

圖4是以引物snp18為例，根據(jù)不同古銀杏個(gè)體表現(xiàn)出的差異溶解曲線峰，對(duì)其進(jìn)行基因分型結(jié)果的溶解曲線，紅色為cc，藍(lán)色為ct，綠色為tt。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

1、初步篩選對(duì)銀杏進(jìn)行基因分型的snp引物

1)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得

根據(jù)制造商的說明書使用rneasyplantminikit(qiagen，hilde，germany)進(jìn)行銀杏總rna提取。提取后，在1.0％的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)rna的降解和污染。使用分光光度計(jì)(implen，westlakevillage，ca，usa)檢查rna純度。使用2.0flurometer(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)中的rnaassaykit測(cè)定rna的濃度。使用anagilentbioanalyzer2100system(agilenttechnologies,santaclara,ca,usa)中的rnanano6000assaykit評(píng)估rna的完整性。

每個(gè)樣品的總量為3μgrna用作rna樣品制備的輸入材料。按照制造商的說明書，使用ultratmrnalibraryprepkit(neb，usa)生成測(cè)序文庫，并將索引代碼添加到每個(gè)樣品的屬性序列中。簡(jiǎn)而言之，使用poly-toligo附著磁珠從總rna純化mrna。在nebnextfirststrandsynthesisreactionbuffer(5×)中，在高溫下使用二價(jià)陽離子打斷成短片段。以mrna為模板，使用六堿基隨機(jī)引物和m-mulv逆轉(zhuǎn)錄酶(rnaseh-)合成第一鏈cdna。隨后使用dna聚合酶i和rna酶h進(jìn)行第二鏈cdna合成。通過外切核酸酶/聚合酶活性將剩余突出部分轉(zhuǎn)化為平端。在dna片段的3'末端腺苷酸化后，連接具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的nebnext適配子以進(jìn)行雜交。為了選擇長度優(yōu)先為150-200bp的cdna片段，文庫片段用ampurexp系統(tǒng)(beckmancoulter，beverly，usa)純化。然后將3μluserenzyme(neb，usa)與大小選擇的接頭連接的cdna在37℃下使用15min，然后在95℃下pcr5min。進(jìn)而使用phusion高保真dna聚合酶，通用pcr引物和index(x)引物進(jìn)行pcr。最后，將pcr產(chǎn)物純化(ampurexp系統(tǒng))，并在agilentbioanalyzer2100系統(tǒng)上評(píng)估文庫質(zhì)量。根據(jù)制造商的說明書，使用truseqpeclusterkitv3-cbot-hs(illumia)在cbot群集生成系統(tǒng)上進(jìn)行索引編碼樣本的聚類。集群生成后，在illuminahiseqtm2500高通量平臺(tái)上對(duì)其準(zhǔn)備進(jìn)行測(cè)序，并生成配對(duì)末端讀取。

fastq格式的原始數(shù)據(jù)(rawreads)首先通過內(nèi)部perl腳本進(jìn)行處理。在此步驟中，通過刪除包含適配器的讀取，包含poly-n的讀取以及從原始數(shù)據(jù)讀取的低質(zhì)量來獲取干凈的數(shù)據(jù)(cleanreads)。同時(shí)，計(jì)算了cleandata的q20，q30，gc含量和序列重復(fù)水平。所有的下游分析都是以高質(zhì)量的cleandata為基礎(chǔ)。然后，將所有庫/樣本中的左文件(read1files)合并到一個(gè)大的left.fq文件中，將正確的文件(read2files)合并到一個(gè)大的right.fq文件中?；趌eft.fq和right.fq使用trinity(grabherretal.，2011)完成轉(zhuǎn)錄組組裝，默認(rèn)情況下min_kmer_cov設(shè)置為2，其他所有參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。選擇具有最長長度的每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本作為unigenes。

2)snp的識(shí)別

本實(shí)施例通過使用picard-toolsv1.41和samtoolsv0.1.18來排序，刪除重復(fù)讀取，對(duì)齊合并獲得每個(gè)樣本的bam結(jié)果。采用gatk2v3.2軟件用于執(zhí)行snpcalling(mckennaetal，2010)。原始的vcf文件使用gatk標(biāo)準(zhǔn)方法過濾(參數(shù)為clusterwindowsize:10；mq0>＝4and(mq0/(1.0*dp))>0.1；qual<10；qual<30.0orqd<5.0orhrun>5)，最后僅保留距離大于5的snp。通過該方法鑒定出65535個(gè)snp，snp變異的形式有多種，但類型主要有轉(zhuǎn)換和顛換，轉(zhuǎn)換是顛換的2倍左右，如圖1所示。

3)snp引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組unigenes序列，挑選60個(gè)snp位點(diǎn)，利用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)60對(duì)snp引物。設(shè)計(jì)的方法如下：首先確定snp位點(diǎn)所在序列的位置，然后在snp位點(diǎn)的上下游分別設(shè)計(jì)正向引物和反向引物，引物設(shè)計(jì)的參數(shù)為引物長度18-23bp；tm60℃左右，盡可能保證上下游引物的tm值一致，一般不超過2℃；gc含量在40-60％(45-55％最佳)；pcr產(chǎn)物大小為100-300bp；其它還應(yīng)注意引物3'端不應(yīng)出現(xiàn)超過3個(gè)的連續(xù)g或c；引物不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即不能有4bp以上的回文序列；引物自身、引物之間盡量不能有連續(xù)4個(gè)以上的堿基互補(bǔ)，尤其避免3'端的互補(bǔ)。

4)snp引物的有效性驗(yàn)證

提取銀杏基因組dna，以銀杏基因組dna為模板，采用待檢測(cè)snp引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；反應(yīng)結(jié)束后，取3μl的pcr產(chǎn)物加入4μlloadingbuffer，再加3μlddh2o，利用8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后采用銀染方法對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。能檢測(cè)到目的條帶且無其它雜帶和引物二聚體的，該待檢測(cè)引物即為有效引物。

10μl的pcr反應(yīng)體系中包括：10×buffer；0.2mmol/ldntps；2.5mmol/lmg²⁺；0.2μmol/lsnp引物；1utaqdna聚合酶和40ngdna模版；剩余ddh2o補(bǔ)齊。

pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃5min；30循環(huán)的94℃30s，最佳tm55℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最終4℃保存。

結(jié)果表明：挑選的60對(duì)snp引物中，有45對(duì)引物能夠擴(kuò)增出條帶，說明引物設(shè)計(jì)的方法較好，但其中的18對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶不單一，可能存在多個(gè)snp位點(diǎn)，暫不考慮進(jìn)行hrm分析，另外27對(duì)引物擴(kuò)增條帶單一且產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，暫為有效snp引物，用于hrm分析。1對(duì)引物對(duì)應(yīng)1個(gè)目標(biāo)snp位點(diǎn)，1對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為含有對(duì)應(yīng)snp位點(diǎn)的dna片段。

2、再次篩選對(duì)銀杏進(jìn)行基因分型的snp引物

1)pcr擴(kuò)增及高分辨率溶解曲線(hrm)分析進(jìn)行基因分型

以90個(gè)銀杏個(gè)體(其中6個(gè)銀杏個(gè)體為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的銀杏；84棵銀杏古樹名木，分別來自3個(gè)群體，貴州盤縣28株，浙江天目山28株和湖北安陸28株)的基因組dna為模板，分別采用上述27對(duì)snp有效性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到每個(gè)個(gè)體的27個(gè)引物對(duì)應(yīng)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，每個(gè)引物對(duì)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為含有某個(gè)snp位點(diǎn)的dna片段。

pcr反應(yīng)體系10μl：25ng模板dna；1×forget-me-not^tmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o補(bǔ)齊。采用viia7中的highresolutionmelt進(jìn)行pcr及基因分型。第一步，10μl的pcr反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃2min；45個(gè)循環(huán)的95℃變性5s，60℃復(fù)性30s；第二步，hrm的反應(yīng)程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

結(jié)果表明：有22對(duì)引物能夠進(jìn)行基因分型，其余5對(duì)引物(snp23，snp24，snp25，snp26，snp27)因有雜峰或基因分型時(shí)可信度不高，所以被淘汰。采用appliedhrmsoftwarev2.0進(jìn)行溶解曲線分析。22對(duì)引物對(duì)應(yīng)的snp位點(diǎn)得到hrm驗(yàn)證，其中，高分辨率溶解曲線部分結(jié)果如下：

圖2為以snp18為例，在不同銀杏個(gè)體表現(xiàn)出的擴(kuò)增曲線；圖3為以snp18為例，利用高分辨率溶解曲線分析后，不同銀杏個(gè)體表現(xiàn)出不同的溶解曲線峰；圖4為以snp18為例，根據(jù)不同銀杏個(gè)體表現(xiàn)出的差異溶解曲線峰，對(duì)其進(jìn)行基因分型結(jié)果的溶解曲線，紅色為cc，藍(lán)色為ct，綠色為tt。22對(duì)snp引物對(duì)90個(gè)銀杏個(gè)體的基因分型結(jié)果如下表所示：

其中，11對(duì)snp引物組合(snp1，snp4，snp6，snp8，snp10，snp14，snp16，snp17，snp19，snp20，snp22)構(gòu)建銀杏古樹名木指紋代碼，獲得84個(gè)銀杏古樹名木對(duì)應(yīng)的指紋圖譜，序號(hào)1-28為貴州盤縣這個(gè)群體的28株古銀杏，序號(hào)29-56為浙江天目山這個(gè)群體的28株古銀杏，序號(hào)57-84為湖北安陸這個(gè)群體的28株古銀杏，如下表所示:

2)高分辨率溶解曲線分析結(jié)果的驗(yàn)證

通過對(duì)pcr產(chǎn)物測(cè)序?qū)Ω叻直媛嗜芙馇€分析得到的基因分型的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。具體步驟如下：挑選snp的不同分型的pcr產(chǎn)物10μl，進(jìn)行sanger測(cè)序，根據(jù)測(cè)序峰圖和等位基因出現(xiàn)的頻率確定基因型，并與hrm技術(shù)的snp基因分型結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證引物基因分型的準(zhǔn)確性。

經(jīng)過sanger測(cè)序驗(yàn)證本發(fā)明的引物通過hmr分析對(duì)銀杏進(jìn)行基因分型的結(jié)果100％正確，結(jié)果可靠。