本發(fā)明屬于腫瘤光動(dòng)力治療用新型光敏劑領(lǐng)域，涉及一種以rgd多肽為靶向基團(tuán)的酞菁硅光敏劑及其制備方法和在腫瘤光動(dòng)力治療方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

作為光動(dòng)力治療(photodynamictherapy,pdt)用第二代光敏劑的典型代表—酞菁光敏劑由于具有優(yōu)越的光物理性質(zhì)，在紅外到近紅外區(qū)域(>650nm)具有較強(qiáng)的光吸收(消光系數(shù)ε>1×10⁵升/摩爾·厘米)和較高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率等諸多優(yōu)點(diǎn)，一直是光敏劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但是該類光敏劑結(jié)構(gòu)中含有疏水性極強(qiáng)的酞菁環(huán)，在水中溶解度很小，而且容易聚集導(dǎo)致光學(xué)淬滅，使得大多數(shù)酞菁光敏劑很難在pdt應(yīng)用中取得好的實(shí)際效果。

將酞菁環(huán)與多肽配基結(jié)合是一種非常有用的優(yōu)化酞菁類化合物物理性質(zhì)的方法，因?yàn)槎嚯念惻浠泻芎玫乃苄院褪荏w靶向能力，酞菁類化合物與多肽配基結(jié)合后可以明顯增加整個(gè)化合物的水溶性，同時(shí)也可大大降低酞菁類化合物的聚集趨勢(shì)，賦予其腫瘤靶向特異性。目前，國(guó)內(nèi)外研究大多集中在酞菁鋅-多肽相結(jié)合的化合物方面，雖然該類化合物具有一定的水溶性和腫瘤靶向性，但是由于酞菁鋅光活性較弱，ec50值僅在1-10μm之間，尚不能滿足作為光敏劑在體內(nèi)癌癥光動(dòng)力治療中應(yīng)用的性能要求。

相對(duì)于酞菁鋅，酞菁硅(sipc)具有更高的光動(dòng)力活性，ec50值在納摩(nm)的范圍內(nèi)。因此，用酞菁硅與多肽結(jié)合構(gòu)建的光敏劑比酞菁鋅類光敏劑會(huì)具有更好的光動(dòng)力活性。本發(fā)明中，我們以酞菁硅作為光敏部分，以arg-gly-asp-d-phe-lys(rgdfk多肽,簡(jiǎn)稱rgd)多肽環(huán)狀序列作為配基，合成出一系列新型光敏劑，并進(jìn)行了光物理以及體內(nèi)外生物活性評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，其中的一個(gè)偶聯(lián)化合物rgd-(linker)2-glu-sipc具有很好的光物理和光動(dòng)力學(xué)性能，對(duì)于受體陽性腫瘤細(xì)胞的ec50值在10-20nm之間，并可在一次給藥的情況下，可治愈小鼠身上的惡性膠質(zhì)瘤，且連續(xù)觀察35天沒有出現(xiàn)復(fù)發(fā)，在腫瘤光動(dòng)力治療領(lǐng)域顯示出了很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明以酞菁硅作為光敏部分，以arg-gly-asp-d-phe-lys(rgdfk多肽,簡(jiǎn)稱rgd)多肽環(huán)狀序列作為配基，合成出一系列新型光敏劑，并進(jìn)行了光物理以及體內(nèi)外生物活性表征。簡(jiǎn)稱為.rgd-sipcrgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc的一系列化合物的結(jié)構(gòu)式為：

4,rgd-sipc(此時(shí)r＝r1)

5.rgd-linker-sipc(此時(shí)r＝r2)

6.rgd-(linker)2-sipc(此時(shí)r＝r3)

7.rgd-(linker)2-glu-sipc(此時(shí)r＝r4)

r1:

r2:

r3:

r4:

在本發(fā)明中，我們用rgd多肽軸向取代與sipc偶聯(lián)，設(shè)計(jì)并合成出了新型具有腫瘤靶向性的光敏劑。用sipc作為光敏部分，其在近紅外區(qū)域有較強(qiáng)的吸收(吸收波長(zhǎng)為λ＝681nm，logε＝5.23)，并且具有較強(qiáng)的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率(0.32)。rgd多肽用于提高酞菁環(huán)的水溶性和靶向性。考慮到酞菁硅很強(qiáng)疏水性可能會(huì)影響rgd與受體的結(jié)合力，我們?cè)诮Y(jié)構(gòu)中引入一個(gè)或兩個(gè)peg連接鏈以增加配基和sipc之間的距離，同時(shí)引入了含有羧基的具有較強(qiáng)親水性的谷氨酸片段。我們利用三苯基二氯樹脂采用fmoc固相合成多肽的方法合成出了帶有和不帶peg和/或谷氨酸連接鏈的rgd配基(rgd,rgd-linker,rgd-(linker)2和rgd-(linker)2-glu)。利用商業(yè)上可以買到的sipccl2作為起始原料與1-(2-羥乙基)哌嗪進(jìn)行反應(yīng)合成出sipc-pq，再加入二甘醇酐合成出sipc-cooh。然后，sipc-cooh與rgd或peg改性的rgd多肽配基通過典型的縮合反應(yīng)得到產(chǎn)物rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc。產(chǎn)物經(jīng)hplc純化后加入乙醚沉淀，再用dmso溶解。產(chǎn)物利用hplc進(jìn)行純度分析。與沒有偶聯(lián)配基的酞菁類化合物相比，所有偶聯(lián)了配基的化合物都表現(xiàn)出了很好的水溶性，尤其是引入了谷氨酸片段的化合物rgd-(linker)2-glu-sipc。

我們進(jìn)一步研究了這些化合物在不同溶液中的光學(xué)特性，rgd-(linker)2-glu-sipc的吸收光譜幾乎完全沒有聚集，結(jié)果表明，與親水性多肽偶聯(lián)，并引入peg連接鏈和羧基官能團(tuán)能夠顯著提高sipcs的水溶性，并有助于解決sipcs在水溶液中的聚集問題。

通過mtt實(shí)驗(yàn)對(duì)這些偶聯(lián)物在腫瘤細(xì)胞水平上體外光動(dòng)力學(xué)活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。我們用人體膠質(zhì)瘤u87-mg細(xì)胞系、人前列腺癌22rv1和pc3細(xì)胞系，以及人類表皮鱗癌a431細(xì)胞系進(jìn)行了評(píng)估。rgd-(linker)2-glu-sipc具有最強(qiáng)的光活性，相比其他3個(gè)偶聯(lián)物而言在腫瘤光動(dòng)力治療中是一種比較好的光敏劑。這種光敏劑在細(xì)胞水平上有最強(qiáng)的細(xì)胞殺傷力，具有較好的水溶性，并且在水溶液中不易發(fā)生聚集。因此，我們選擇這個(gè)化合物進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物水平上的評(píng)價(jià)。我們采用已經(jīng)建立的u87-mg異種移植腫瘤模型進(jìn)行了體內(nèi)光動(dòng)力活性的研究。對(duì)于注射過化合物rgd-(linker)2-glu-sipc治療組經(jīng)光照后腫瘤的體積顯著縮小。所有的腫瘤在第14天被全部治愈，并且在觀察到第35天沒有復(fù)發(fā)。在整個(gè)治療過程中，沒有觀察到小鼠體重下降，表明光照和化合物rgd-(linker)2-glu-sipc都沒有對(duì)小鼠引起嚴(yán)重的毒副作用。rgd-(linker)2-glu-sipc在u87-mg腫瘤模型上的功效表現(xiàn)出其在腫瘤光動(dòng)力治療上具有的極大的臨床應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖1是rgd多肽的合成過程示意圖

圖2是rgd-linker,rgd-(linker)2和rgd-(linker)2-glu的合成過程示意圖

圖3是rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc的合成過程示意圖

圖4是rgd,rgd-linker,rgd-(linker)2和rgd-(linker)2-glu的高效液相色譜(hplc)分析(檢測(cè)器波長(zhǎng)為220nm)

圖5是sipc-pq,sipc-cooh,rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc的高效液相色譜hplc分析(檢測(cè)器波長(zhǎng)為220nm)

圖6是sipc-pq,sipc-cooh,rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc紫外吸收光譜圖(吸收峰678nm)

表1sipc-pq,sipc-cooh,rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc的光譜數(shù)據(jù)

圖7是sipc-cooh,rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc在不同細(xì)胞系上對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖8是sipc-cooh,rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc在細(xì)胞水平上藥物活性研究

表2sipc-cooh,rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc在對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的ec50值

圖9是rgd-(linker)2-glu-sipc對(duì)u87-mg小鼠皮下異種移植瘤的體內(nèi)治療效果研究

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明但不意味著限制本發(fā)明。

實(shí)施例1rgd多肽的合成(附圖1)

我們首先利用固相的方法合成rgd多肽化合物。合成之前1h先用二氯甲烷對(duì)樹脂進(jìn)行溶脹處理，我們使用的是載量為0.5mmol/g三苯基氯樹脂。將fmoc-asp(oall)-oh(1.0g,1.0mmol)和n,n-二異丙基乙胺(diea)(680μl,4.0mmol)溶解于10mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中加入到固相合成器中，室溫反應(yīng)5h。然后將配置封閉液(二氯甲烷ch2cl2：甲醇meoh：diea＝17:1:2)，加入到固相合成器中封閉未反應(yīng)的氯。用含有20％哌啶的dmf溶液脫除fmoc保護(hù)基30min。四個(gè)氨基酸(fmoc-gly-oh,fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-lys(dde)-ohandfmoc-d-phe-oh)的偶聯(lián)反應(yīng)每步都用1.5eq.的fmoc保護(hù)的衍生物原位加入縮合劑o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)(2.0eq),1-羥基苯并三唑(hobt)(1.5eq),anddiea(4eq)，溶于dmf中，室溫反應(yīng)5h。每步都需要dmf洗脫3次。在最后一個(gè)fmoc去保護(hù)之前，加入苯基硅烷(phsih3)(24eq)，四三苯基膦鈀(pd(pph3)4)(0.25eq)溶于二氯甲烷中反應(yīng)1.5h。加入1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽(pybop)(1.5eq)，1-羥基苯并三唑(hobt)(1.5eq)和n,n-二異丙基乙胺diea(2equiv)溶于dmf溶液中室溫反應(yīng)過夜進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。

取環(huán)化后rgd(1.0g,0.5mmol)用2％的水合肼去保護(hù)，用dmf和二氯甲烷洗滌后真空干燥得產(chǎn)物resin-rgd。干燥后的樹脂加入500μl洗脫液(三氟乙酸t(yī)fa/三異丙基硅烷tris/水＝95:2.5:2.5)室溫下洗脫1h。洗脫液加無水乙醚(1.5ml)進(jìn)行沉淀，并洗滌三次后室溫干燥得到產(chǎn)物rgd(0.16g,收率52％)。(hrms-esi:m/zcalculatedforc27h41n9o7[m+h]⁺604.3202,found604.3202)

實(shí)施例2rgd-linker,rgd-(linker)2和rgd-(linker)2-glu的合成(附圖2)

1、簡(jiǎn)稱為rgd-linker的化合物的合成

去保護(hù)的resin-rgd(1.0g,0.5mmol)與二甘醇酐(116.1mg,1.0mmol)溶于5mldmf中震蕩反應(yīng)5h得到產(chǎn)物resin-cooh。然后用n,n'-羰基二咪唑(0.5mcdi)對(duì)resin-cooh進(jìn)行活化，反應(yīng)1h。活化后的resin-cooh，0.5m1-羥基苯并三唑(hobt)，雙(3-氨丙基)二乙二醇(1.1g,5mmol)混合震蕩反應(yīng)5h，然后用dmf和二氯甲烷洗滌后真空干燥得產(chǎn)物resin-rgd-linker。加入500μl洗脫液(三氟乙酸t(yī)fa/三異丙基硅烷tris/水＝95:2.5:2.5)室溫下洗脫1h。洗脫液加無水乙醚(1.5ml)進(jìn)行沉淀，并洗滌三次后室溫干燥得到產(chǎn)物rgd-linker(0.18g,產(chǎn)率39％)。(hrms-esi:m/zcalculatedforc41h67n11o13[m+h]⁺922.4993,found922.4987)

2、簡(jiǎn)稱為rgd-(linker)2的化合物的合成

resin-rgd-linker(1.0g,0.5mmol)與二甘醇酐(116.1mg,1.0mmol)一起溶于5mldmf中震蕩反應(yīng)5h得到產(chǎn)物resin-cooh。然后用n,n'-羰基二咪唑(0.5mcdi)對(duì)resin-cooh進(jìn)行活化，反應(yīng)1h。活化后的resin-cooh，0.5mhobt，雙(3-氨丙基)二乙二醇(1.1g,5mmol)混合震蕩反應(yīng)5h，然后用dmf和二氯甲烷洗滌后真空干燥得產(chǎn)物resin-rgd-(linker)2。加入500μl洗脫液(三氟乙酸t(yī)fa/三異丙基硅烷tris/水＝95:2.5:2.5)室溫下洗脫1h。洗脫液加無水乙醚(1.5ml)進(jìn)行沉淀，并洗滌三次后室溫干燥得到產(chǎn)物rgd-(linker)2(0.18g,產(chǎn)率30％)。(hrms-esi:m/zcalculatedforc55h93n13o19[m+h]⁺1240.6783,found1240.6788,[m+na]⁺1262.6603,found1262.6603)

3、簡(jiǎn)稱為rgd-(linker)2-glu的化合物的合成

resin-rgd-(linker)2(1.0g,0.5mmol)與fmoc-glu(otbu)-oh(0.32g,0.75mmol),hbtu(0.38g,0.1mmol),hobt(0.1g,0.75mmol)diea(0.26g,2mmol)一起溶于5mldmf中震蕩反應(yīng)5h，然后用dmf和二氯甲烷洗滌后真空干燥得到產(chǎn)物resin-rgd-(linker)2-glu-fmoc。取fmoc保護(hù)的resin-rgd-(linker)2-glu-fmoc(1.0g,0.5mmol)加入含有20％哌啶的dmf溶液脫除fmoc保護(hù)基得產(chǎn)物resin-rgd-(linker)2-glu再，加入500μl洗脫液(三氟乙酸t(yī)fa/三異丙基硅烷tris/水＝95:2.5:2.5)室溫下洗脫1h。洗脫液加無水乙醚(1.5ml)進(jìn)行沉淀，并洗滌三次后室溫干燥得到產(chǎn)物rgd-(linker)2-glu(0.15g,產(chǎn)率22％)。(hrms-esi:m/zcalculatedforc60h100n14o22[m+h]⁺1369.7209,found1369.7180)

實(shí)施例3簡(jiǎn)稱為rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc的合成(附圖3)

1、簡(jiǎn)稱為sipc-pq的化合物的合成

1-(2-羥乙基)哌嗪(20.8mg,0.016mmol)和sipccl2(10.0mg,0.016mmol)加入到甲苯和吡啶的混合溶液中(1ml,v/v＝5:1)回流10h后，減壓脫除溶劑，加入二氯甲烷(ch2cl2)稀釋，再用飽和食鹽水洗滌三次，合并有機(jī)相，加入無水硫酸鈉(na2so4)干燥，脫除溶劑，硅膠柱進(jìn)行純化，洗脫液為甲醇(meoh)，二氯甲烷(ch2cl2)，并加入少量三乙胺(tea)，得到產(chǎn)物sipc-pq(5.0mg,收率42％)。(hrms(esi):m/zcalculatedforc44h42n12o2si[m+h]⁺799.3396,found799.3392)

2、簡(jiǎn)稱為sipc-cooh的化合物的合成

sipc-pq(10.0mg,0.013mmol)和二甘醇酐(9.0mg,0.078mmol)加入到200μl無水dmf中，室溫?cái)嚢?h后，加入無水乙醚沉淀，洗滌得到產(chǎn)物sipc-cooh3(10.0mg,收率76％)。(hrms(esi):m/zcalculatedforc52h51n12o10si[m+h]⁺1031.3615,found1031.3613)

3、簡(jiǎn)稱為rgd-sipc的光敏化合物的合成

sipc-cooh(10.0mg,0.010mmol),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc)(1.8mg,0.009mmol)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)(1.1mg,0.010mmol)加入到1.0ml無水dmf中，室溫?cái)嚢?h后，再加入diea(2.5mg,0.019mmol)和rgd(1.7mg,0.003mmol)繼續(xù)室溫?cái)嚢柽^夜。經(jīng)無水乙醚沉淀洗滌，再用二氯甲烷洗滌三次，經(jīng)hplc純化后得產(chǎn)物rgd-sipc(3.8mg，收率78％)。(hrms(esi):m/zcalculatedforc79h90n21o16si[m+h]⁺1616.6638,found1616.6705)

4、簡(jiǎn)稱為rgd-linker-sipc的光敏化合物的合成

sipc-cooh(10.0mg,0.010mmol),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc)(1.8mg,0.009mmol)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)(1.1mg,0.010mmol)加入到200μl無水dmf中，室溫?cái)嚢?h后，再加入diea(2.5mg,0.019mmol)和rgd-linker(2.6mg,0.003mmol)繼續(xù)室溫?cái)嚢柽^夜。經(jīng)無水乙醚沉淀洗滌，再用二氯甲烷洗滌三次，經(jīng)hplc純化后得產(chǎn)物rgd-linker-sipc(3.3mg，收率57％)。(hrms(esi):m/zcalculatedforc93h116n23o22si[m+h]⁺1934.8429,found1934.8512)

5、簡(jiǎn)稱為rgd-(linker)2-sipc的光敏化合物的合成

sipc-cooh(10.0mg,0.010mmol),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc)(1.8mg,0.009mmol)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)(1.1mg,0.010mmol)加入到200μl無水dmf中，室溫?cái)嚢?h后，再加入diea(2.5mg,0.019mmol)和rgd-(linker)2(3.6mg,0.003mmol)繼續(xù)室溫?cái)嚢柽^夜。經(jīng)無水乙醚沉淀洗滌，再用二氯甲烷洗滌三次，經(jīng)hplc純化后得產(chǎn)物rgd-(linker)2-sipc(2.6mg，收率40％)。

6、簡(jiǎn)稱為rgd-(linker)2-glu-sipc的光敏化合物的合成

sipc-cooh(10.0mg,0.010mmol),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc)(1.8mg,0.009mmol)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)(1.1mg,0.010mmol)加入到200μl無水dmf中，室溫?cái)嚢?h后，再加入diea(2.5mg,0.019mmol)和rgd-(linker)2-glu(4.0mg,0.003mmol)繼續(xù)室溫?cái)嚢柽^夜。經(jīng)無水乙醚沉淀洗滌，再用二氯甲烷洗滌三次，經(jīng)hplc純化后得產(chǎn)物rgd-(linker)2-glu-sipc(2.5mg，收率32％)。

實(shí)施例4rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc的光譜性質(zhì)(附圖6，附表1)

(1)uv-vis光譜

我們利用美國(guó)cary5000型紫外光譜儀進(jìn)行紫外吸收光譜的測(cè)定。這些化合物配置成濃度為10μm的溶液，溶劑分別為dmso，含有10％聚乙二醇辛基苯基醚的水溶液，含有1％聚氧乙烯蓖麻油(cel)的水溶液(vcel/vwater＝1:99)，和磷酸鹽緩沖液(pbs)。室溫條件下，掃描波長(zhǎng)范圍從500nm到900nm，分辨率為1nm，掃描速率為每分鐘600nm。

通過紫外吸收光譜對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc進(jìn)行了表征，在dmso溶液中均有較強(qiáng)的吸收峰，吸收波長(zhǎng)為λ＝680nm，表現(xiàn)出了典型的非聚集形式，嚴(yán)格符合beer–lambert定律。眾所周知，dmso可以防止酞菁類化合物的聚集，然而，dmso并不是進(jìn)行生物評(píng)價(jià)時(shí)一種合適的溶劑。與沒有偶聯(lián)配基的酞菁類化合物相比，所有偶聯(lián)了配基的化合物都表現(xiàn)出了很好的水溶性，尤其是引入了谷氨酸片段的化合物rgd-(linker)2-glu-sipc。因此，我們進(jìn)一步研究了這些化合物在不同溶液中的光學(xué)特性，包括：含有10％聚乙二醇辛基苯基醚的水溶液，含有1％聚氧乙烯蓖麻油(cel)的水溶液(vcel/vwater＝1:99)，和磷酸鹽緩沖液(pbs)。如圖6所示，所有的化合物在pbs溶液中都發(fā)生了聚集，吸收峰變寬，吸收波長(zhǎng)范圍為λ＝600-700nm。然而，在含有10％聚乙二醇辛基苯基醚的水溶液中的光譜圖與dmso溶液的光譜圖相似，特別是rgd-(linker)2-glu-sipc，其吸收光譜幾乎完全沒有聚集。使用相對(duì)較弱的脂環(huán)境的含有1％聚氧乙烯蓖麻油(cel)的水溶液作為溶劑，其中一些偶聯(lián)物仍會(huì)聚集，然而rgd-(linker)2-glu-sipc的吸收光譜幾乎完全沒有聚集，與dmso溶液的光譜圖相同。以上結(jié)果表明，與親水性多肽偶聯(lián)，并引入peg連接鏈和羧基官能團(tuán)能夠顯著提高sipcs的水溶性，并幫助解決了sipcs在水溶液中的聚集問題。盡管這些sipcs與多肽的偶聯(lián)物在pbs溶液中仍然會(huì)聚集，但是含有10％聚乙二醇辛基苯基醚的水溶液，和含有1％聚氧乙烯蓖麻油(cel)的水溶液可以顯著消除其聚集問題，尤其是引入了peg連接鏈和羧基官能團(tuán)的rgd-(linker)2-glu-sipc。引入一個(gè)谷氨酸片段不僅能夠明顯提高偶聯(lián)物的水溶性，而且可以很容易消除聚集問題。與純水溶液相比脂質(zhì)水溶液能夠更好地模擬細(xì)胞膜的環(huán)境，尤其是脂質(zhì)濃度較低的含有1％聚氧乙烯蓖麻油(cel)的水溶液。由于只有消除聚集的光敏劑才有光活性，因此，光敏劑在生理?xiàng)l件下消除聚集在生物應(yīng)用中非常重要。

(2)熒光激發(fā)和發(fā)射光譜

熒光發(fā)射光譜的記錄范圍從波長(zhǎng)600nm到900nm，激發(fā)波長(zhǎng)為680nm。熒光激發(fā)光譜的記錄掃描范圍從波長(zhǎng)500nm到900nm，發(fā)射波長(zhǎng)為695nm。樣品均為2.0μm的dmso溶液。激發(fā)和發(fā)射光譜寬度分別為1nm和2nm。

如表1所示，rgd對(duì)酞菁環(huán)的光學(xué)性能沒有明顯的影響。與沒有偶聯(lián)rgd多肽的酞菁硅sipc-pq和andsipc-cooh相比這些偶聯(lián)產(chǎn)物的最大發(fā)射，激發(fā)波長(zhǎng)和熒光量子產(chǎn)量非常接近，熒光衰減時(shí)間稍有減少。所有的偶聯(lián)物都有相當(dāng)好的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率，但與多肽和連接鏈連接后似乎還增加了其單線態(tài)氧量子產(chǎn)率。rgd-(linker)2-glu-sipc具有最高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率，為0.39。單線態(tài)氧量子產(chǎn)率是pdt中影響細(xì)胞殺傷力最主要的因素，因此提高單線態(tài)氧量子產(chǎn)率對(duì)pdt非常有幫助。

實(shí)施例5rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc在細(xì)胞水平上藥物活性的評(píng)價(jià)

我們用人體膠質(zhì)瘤u87-mg細(xì)胞系、人前列腺癌22rv1和pc3細(xì)胞系，以及人類表皮鱗癌a431細(xì)胞系在細(xì)胞水平上體外光動(dòng)力學(xué)活性進(jìn)行了評(píng)估。首先以1×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度鋪于96孔板上，培養(yǎng)24h后加入含有偶聯(lián)化合物rgd-sipc,rgd-linker-sipc,rgd-(linker)2-sipc和rgd-(linker)2-glu-sipc不同濃度(溶解在1.0％cel水溶液)的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4h后，用波長(zhǎng)670nm，40mw/cm²的功率密度給予光照15min。4h后，更換含0.5mg/mlmtt的新鮮培養(yǎng)基在37℃下繼續(xù)孵育4h。形成的藍(lán)紫色的甲臜結(jié)晶沉積在細(xì)胞中，結(jié)晶物被dmso溶解，用多功能酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm處測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)，我們?cè)诟骷?xì)胞系上也進(jìn)行了不給光照的暗毒性實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)我們都重復(fù)3次。根據(jù)測(cè)定的吸光度計(jì)算細(xì)胞的存活率，然后繪制細(xì)胞存活率和加藥濃度之間關(guān)系的藥物活力抑制曲線，并計(jì)算相應(yīng)的半抑制濃度(ec50值)。

u87-mg,22rv1和pc3都是ανβ3蛋白受體高表達(dá)的細(xì)胞系，而a431是對(duì)ανβ3蛋白受體低表達(dá)細(xì)胞系。圖7為不光照只給藥和只給光照不給藥條件下細(xì)胞存活率與相應(yīng)劑量的曲線；圖8為光照給藥條件下不同細(xì)胞系細(xì)胞存活率與相應(yīng)劑量的曲線；表2為這些偶聯(lián)物在對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的ec50值。四個(gè)偶聯(lián)化合物對(duì)以上細(xì)胞系都沒有表現(xiàn)出明顯的暗毒性，然而，在有光照條件下，四個(gè)偶聯(lián)化合物在濃度很低的情況下，細(xì)胞的生存能力被顯著地降低。所有的偶聯(lián)化合物ec50值均在nm范圍，并且rgd-(linker)2-glu-sipc具有最強(qiáng)的光活性，其ec50值對(duì)應(yīng)u87-mg、22rv1、pc3以及a431細(xì)胞系分別為17.1nm,16.7nm,16.2nm和50.4nm。含有羧基官能團(tuán)的谷氨酸片段似乎對(duì)提高活性起到了非常重要的作用。

這些偶聯(lián)物對(duì)受體陽性和受體陰性的細(xì)胞系活性差異并不明顯。在最近的報(bào)道中我們也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，rgd多肽與酞菁鋅進(jìn)行偶聯(lián)的化合物，對(duì)于ανβ3⁺u87-mg受體陽性的細(xì)胞系和ανβ3⁺a431或mcf-7受體陰性的細(xì)胞系在藥物孵育后有相似的光毒性。這些偶聯(lián)化合物被細(xì)胞攝取可能不僅與細(xì)胞膜表面受體的數(shù)目有關(guān)系，可能還有其他途徑。

實(shí)施例6rgd-(linker)2-glu-sipc的體內(nèi)治療效果的評(píng)價(jià)

我們采用已經(jīng)建立的u87-mg異種移植腫瘤模型對(duì)偶聯(lián)物rgd-(linker)2-glu-sipc進(jìn)行了體內(nèi)光動(dòng)力活性的研究。腫瘤模型的建立是通過給8周齡的雌性balb/c裸鼠右側(cè)腿部接種3×10⁶個(gè)u87-mg腫瘤細(xì)胞，當(dāng)小鼠腫瘤體積達(dá)到100mm³時(shí)，這些小鼠被隨機(jī)分成兩組，每組5只。治療組每只小鼠通過尾靜脈注射rgd-(linker)2-glu-sipc(50nmol)，給藥4h后給予波長(zhǎng)為670nm，強(qiáng)度為200mw/cm²的光照16min。對(duì)照組注射相同劑量的pbs，給予相同光照。在觀察的35天內(nèi)，對(duì)所有小鼠的腫瘤體積和體重進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。每隔一天用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄各組小鼠腫瘤的體積變化，腫瘤體積的計(jì)算公式：腫瘤體積＝長(zhǎng)×寬²×0.5。每隔兩天對(duì)小鼠進(jìn)行拍照，以更直觀地觀察腫瘤的變化。當(dāng)腫瘤達(dá)到1500mm²以上時(shí)，老鼠被認(rèn)為死亡。

rgd-(linker)2-glu-sipc相比其他3個(gè)偶聯(lián)物而言在腫瘤光動(dòng)力治療中是一種更好的光敏劑。這種光敏劑在細(xì)胞水平上有最強(qiáng)的細(xì)胞殺傷力，具有較好的水溶性，并且在水溶液中不易發(fā)生聚集。因此，我們選擇這個(gè)化合物進(jìn)行動(dòng)物水平上的評(píng)價(jià)。由于ανβ3受體在u87-mg腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，因此可以選擇性的結(jié)合偶聯(lián)物上的rgd配基。在這個(gè)模型中，我們?cè)赽alb/c裸鼠右側(cè)皮下注射u87-mg細(xì)胞。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100mm³時(shí)，將化合物rgd-(linker)2-glu-sipc和生理鹽水通過尾靜脈分別注射，然后給予強(qiáng)度為200mw/cm²的光照16min。如圖9所示，對(duì)照組經(jīng)過光照后，腫瘤體積顯著增加，在不到25天的時(shí)間里增大到1500mm²。相對(duì)應(yīng)的，治療組經(jīng)光照后腫瘤的體積顯著縮小。所有的腫瘤在第14天被全部治愈，并且在觀察到第35天沒有復(fù)發(fā)。在整個(gè)治療過程中，沒有觀察到小鼠體重下降，表明光照和化合物rgd-(linker)2-glu-sipc都沒有對(duì)小鼠引起嚴(yán)重的毒副作用。rgd-(linker)2-glu-sipc在u87-mg腫瘤模型上的功效表現(xiàn)出其在腫瘤光動(dòng)力治療上具有的極大的臨床應(yīng)用潛力。

本發(fā)明中，為了開發(fā)新型具有腫瘤靶向性的光動(dòng)力治療用光敏劑，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一系列rgd多肽軸向取代與sipc偶聯(lián)的產(chǎn)物。與rgd多肽偶聯(lián)極大地提高了sipc的水溶性，又引入了兩個(gè)peg連接鏈和一個(gè)含有強(qiáng)親水性的羧酸官能團(tuán)進(jìn)一步提高了其親水性能，制備出的rgd-(linker)2-glu-sipc產(chǎn)物顯示出了很強(qiáng)的光活性，其對(duì)于各種受體陽性細(xì)胞系其ec50值在10-20nm。在u87-mg異種移植腫瘤模型治療中，一次給藥后進(jìn)行光動(dòng)力治療即可完全治愈，并且在觀察到第35天沒有復(fù)發(fā)。研究結(jié)果表明，rgd-(linker)2-glu-sipc在腫瘤光動(dòng)力治療上具有的極大的臨床應(yīng)用潛力。如何進(jìn)行用peg連接鏈和羧酸官能團(tuán)對(duì)光敏劑進(jìn)行修飾來提高其光活性仍是一個(gè)有待探索的問題。