本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別是涉及水稻柱頭外露率主效qtl及其定位方法。

背景技術：

水稻是全球最為重要的糧食作物，解決了全球超過半數(shù)人口的口糧問題。在全球大緯度、多環(huán)境下均可種植。種植雜交水稻被認為是解決全球不斷增長的人口問題以及由此而引發(fā)的糧食短缺問題的有效策略。

柱頭外露是影響水稻異交結實率的主要因子之一。水稻開花期間，多種環(huán)境因子對柱頭外露均有所影響，例如風、溫度、濕度、機械損傷等等。外露的柱頭大約能保持6天，平均每天減少20％左右。因此，不管單柱頭外露率還是雙柱頭外露率都和其他開花性狀一樣，在雜交稻制種過程中受到育種家以及育種科研者的持續(xù)關注。

由于栽培稻是嚴格的自交作物并且花期性狀都不利于異交結實，因此在雜交稻制種過程中，要想辦法通過改變兩親本的表型性狀來提高天然的異交結實率。雜交稻制種過程中父母本的選擇會因為各自目標性狀的不同而選擇不同。雜交稻中父本的選擇會傾向于在雜交過程中具有高產(chǎn)量潛力的品種，而另一方面，母本的表型性狀選擇則會傾向于雄性不育性狀。通過應用遺傳雄性不育即光溫敏核不育，目前在水稻生產(chǎn)上已得到成功運用。但作為育種家，仍需考慮影響雜交稻制種產(chǎn)量的諸多表型性狀，例如水稻柱頭外露率就是最重要的影響因子之一。具有更高柱頭外露率的母本不僅可以從父本獲取更多花粉，而且可以更容易越過父母本之間的開花異步(非同步化)障礙。

到目前為止，在水稻中已經(jīng)定位到了多個柱頭外露相關的qtl，并且在水稻全部12條染色體上都有分布。基于水稻種間以及種內(nèi)多次雜交獨立試驗均檢測到了與開花習性相關性狀的數(shù)量性狀位點(qtls)，染色體3、4、6、8、11和12上共檢測到了9個控制柱頭外露的qtl(yamamoto,t.,takemori,n.,sue,n.,nitta,n.(2003).qtlanalysisofstigmaexertioninrice.ricegenetnewsl20,33-34)。通過秈稻栽培稻peikuh和野生稻w1944雜交衍生而來的重組自交系(ril)群體，在第5和第10染色體上分別定位到了1個控制柱頭外露的qtl(ugay,fukutay,caihw,iwatah,ohsawar,morishimah,fujimurat.2003.mappingqtlsinfluencingricefloralmorphologyusingrecombinantinbredlinesderivedfromacrossbetweenoryzasatival.andoryzarufipogongriff.theoreticalandappliedgenetics,107,218-226.doi:10.1007/s00122-003-1227-y.)。

rahman(mdhabiburrahman,yingxinzhang,lianpingsun,keqinzhang,md.sazzadurrahman,weixunwu，xiaodengzhan,liyongcao,shihuacheng.2016.geneticmappingofquantitativetraitlociforthestigmaexsertionrateinrice(oryzasatival).journalofintegrativeagriculture2017,16(0):1-10.)等利用一個來自于協(xié)青早b和中恢9308配組而成的134株系的重組自交系(ril)群體，定位柱頭外露qtl以及每穗粒數(shù)的qtl，結果顯示，在染色體1、6、10和11上共定位到了8個qtl。一些研究者通過表型以及基因型鑒定，在7號染色體上定位到了2個控制柱頭外露率qtls的聚集區(qū)(yan,w.g.,li,y.,agrama,h.a.,luo,d.,gao,f.,lu,x.,ren,g.(2009).associationmappingofstigmaandspikeletcharacteristicsinrice(oryzasatival.).molbreed.24,277-292.http://dx.doi.org/10.1007/s11032-009-9290-y)，另一些學者則在第7染色體上定位到了一個控制柱頭外露的qtl簇集區(qū)(louj,yuegh,yangwq,meihw,luolj,luhj.2014.mappingqtlsinfluencingstigmaexertioninrice.bulgarianjournalofagriculturalscience,20,1450-1456.)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種水稻柱頭外露率主效qtl。所述的主效qtl被定位于第7染色體上，位于分子標記rm5436-rm5499之間約1000kb物理距離上。

所述分子標記rm5436的引物為：上游引物tgagctgcacaagacagacaagc(seqidno.1所示)，下游引物accatttgaacaggatggactgg(seqidno.2所示)；所述分子標記rm5499的引物為：上游引物ggacgaaagggtatttgattgg(seqidno.5所示)，下游引物cctcaaggtggtctccttctcc(seqidno.6所示)。

本發(fā)明還提供所述的水稻柱頭外露率主效qtl的定位方法，包括以下步驟：a.以協(xié)青早b為供體親本，以中恢9308為受體親本和輪回親本，通過連續(xù)回交以及自交，最終在bc4f8代構建得到染色體片段代換系

cl-51，將所述代換系cl-51與中恢9308雜交，獲得f1雜交種，自交后獲得f2分離群體；b.考察f2分離群體的柱頭外露率相關表型數(shù)據(jù)；c.開發(fā)分子標記并篩選出具有多態(tài)性的引物，再利用f2分離群體構建遺傳連鎖圖譜；d.利用遺傳連鎖圖譜，結合表型數(shù)據(jù)進行qtl分析，定位出所述柱頭外露率主效qtl。

具體地，所述步驟b中的表型數(shù)據(jù)以及步驟c中遺傳連鎖圖譜的作圖群體來自于從所述代換系cl-51的4000株f2群體中隨機選取的300株水稻植株。

具體地，所述步驟b中柱頭外露率相關表型數(shù)據(jù)包括單柱頭外露率、雙柱頭外露率和總柱頭外露率。

具體地，所述步驟b中柱頭外露率的表型數(shù)據(jù)是通過采集水稻植株的主穗樣本后測算獲得的，所述主穗樣本在開花6-7天且等到主穗最底部也開花2-3天后進行采集。

由于采用上述技術方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明通過qtl定位將一種水稻柱頭外露率主效qtl定位于第7染色體上標記rm5436-rm5499之間約1000kb物理距離上，上述主效qtl的區(qū)域在以往有關柱頭外露的研究中從未見報道過，因此可以認為是發(fā)現(xiàn)了一個新基因。本發(fā)明的定位成果為今后精細定位及基因克隆提供了研究基礎。

由于水稻育種上高的柱頭外露率可明顯提高雜交結實率，因此，通過開發(fā)該主效qtl緊密連鎖的分子標記，來檢測水稻品種或品系中是否具有柱頭外露率相關qtl，可加快水稻優(yōu)異品種的選育進程。例如，將來該主效qtl含有的新基因可通過mas手段育成帶有遺傳改良性質(zhì)的細胞質(zhì)雄性不育系，通過提高其柱頭外露率來提升異交結實率，進而進一步增加雜交稻的制種效率。

附圖說明

上述僅是本發(fā)明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術手段，以下結合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明。

圖1是水稻柱頭外露率主效qtl定位方法中遺傳材料構建流程圖。

圖2是移栽80天后親本表型性狀圖。其中(a)為中恢9308，(b)為cl-51，(c)為協(xié)青早b。

圖3是f2群體柱頭外露率的分布圖。其中(a)為單柱頭外露率，(b)為雙柱頭外露率，(c)為總柱頭外露率。

圖4是第7染色體上qpsse-7的遺傳連鎖分析，黑色箭頭表示qpsse-7所在位置。

圖5是用4000作圖群體對qpsse-7所做的精細定位，黑色水平線下的數(shù)字代表標記和基因之間的重組子個數(shù)。

具體實施方式

本發(fā)明研究了一個在7號染色體上含有供體親本(即協(xié)青早b)插入片段的染色體片段代換系(cssl-51)，而供體親本(協(xié)青早b)可明顯提升柱頭外露的水平。初級qtl檢測共定位了3個與開花習性相關的性狀，包括psse(單柱頭外露率)、pdse(雙柱頭外露率)以及ptse(總柱頭外露率)，cl-51來自于親本協(xié)青早b和中恢9308，協(xié)青早b具有高柱頭外露率，而中恢9308柱頭外露率則更低。結果，我們檢測到了一個主效qtl并把它定位于第7染色體上的一個小區(qū)域內(nèi)(按命名規(guī)則將之命名為qpsse-7)，并大膽推測該qtl同時控制psse以及pdse。

以下通過具體的實施例對本發(fā)明進行說明，應當理解，此處所描述的實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。并且以下實施例中所涉及的藥品或試劑，如無特殊說明，均能夠通過正常商業(yè)途徑進行購買。以下實施例中所涉及實驗技術或操作方法，如無特殊說明，均為本領域已知的常規(guī)實驗技術或操作方法。

1.1試驗材料以及田間試驗

如圖1所示，通過協(xié)青早b與中恢9308配組，協(xié)青早b是具有高柱頭外露率的母本保持系，中恢9308則是低柱頭外露率的恢復系，利用這兩者配組構建rils，并用此群體與中恢9308回交、再自交，發(fā)展成bc1f1，再回交、自交形成bc2f2……直至形成bc4f8，最終得到了75株系的cssls群體(染色體片段代換系群體)。本研究利用其中的一個株系(cl-51)來進行控制柱頭外露率qtl的遺傳定位，此株系第7染色體目標區(qū)段含來自于協(xié)青早b的插入片段。最終將含有qpsse-7的區(qū)間縮小至1000kb左右，介于rm5436和rm5499之間。

cssls的f2群體2015年12月10日種植于海南島陵水，f2-3則與2016年6月15日種植于浙江省杭州市的中國水稻研究所試驗田內(nèi)。每株系種6行，每行種8株，30×20cm的行間距，標準田間管理。

1.2性狀檢測

共檢測了柱頭外露率的3個性狀值：單柱頭外露率psse、雙柱頭外露率pdse以及總柱頭外露率ptse。開花6-7天后，親本以及群體中每行每植株取3個主穗進行分別取樣，等到主穗最底部也開花2-3天后開始取樣，用于測算柱頭外露率值。

柱頭外露率值用以下公式計算：

單柱頭外露率(％)＝[單柱頭外露率/(單柱頭外露率+雙柱頭外露率+無柱頭外露率)]×100；

雙柱頭外露率(％)＝[雙柱頭外露率/(單柱頭外露率+雙柱頭外露率+無柱頭外露率)]×100；

總柱頭外露率(％)＝[總柱頭外露率/(單柱頭外露率+雙柱頭外露率+無柱頭外露率)]×100。

1.3dna提取以及pcr產(chǎn)物分析

參照婁等的方法(lou,q.j.,l.chenandl.j.luo,2005.comparisonofthreerapidmethodsofdnaextractionfromrice.molecularplantbreeding,3:749-752.)，用ctab法分別提取f2群體及其親本新鮮葉片的總dna。提取后的總dna溶于te緩沖液中，并用du640核酸蛋白分析儀(貝克曼計算公司)進行質(zhì)量及濃度分析。所有dna樣品用超純水稀釋至25ng/μl，-20℃保存用于pcr檢測。

參照婁等(lou,q.j.,l.chenandl.j.luo,2005.comparisonofthreerapidmethodsofdnaextractionfromrice.molecularplantbreeding,3:749-752.)的方法在pcr熱循環(huán)儀(美國費希爾科技公司生產(chǎn))上進行pcr反應。

所得產(chǎn)物在8％變性聚丙烯酰胺凝膠上跑膠，并用銀染法染色檢測。

1.4開發(fā)新標記

我們在先的研究利用cssl群體在第7染色體上rm5436和rm5875之間定位了一個控制水稻柱頭外露的qtl。此qtl在我們先前的初定位工作中被定位于第7染色體ssr標記rm5436和rm5875之間(圖4)。

具體地，先前的初定位工作中，通過在bc4f8代換系cl-51的4000株f2群體中隨機選取300株水稻植株，考察基因型和表型數(shù)據(jù)，利用作圖軟件windowsqtlcartographerv2.5(wangs,bastencj,zengzb(2012)windowsqtlcartographer2.5.departmentofstatistics.available:http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/wqtlcart.htm.)處理計算相應數(shù)據(jù),lod值取2.0，計算所得數(shù)據(jù)顯示此處存在qtl，并得到相應表型變異等數(shù)據(jù)。用了9個ssr標記和1個indel標記檢測到包含qpsse-7的區(qū)段位于rm5436-rm5875之間。其中，分子標記rm5436的引物為：上游引物tgagctgcacaagacagacaagc(seqidno.1所示)，下游引物accatttgaacaggatggactgg(seqidno.2所示)；分子標記rm5875的上游引物為：aataaagcgagatggacgaacc(seqidno.3所示)，下游引物為：tttcccaccagaggaagatgg(seqidno.4所示)。

在進一步地研究中，我們在qtl初定位區(qū)間rm5436和rm5875之間發(fā)掘ssr新標記(http://www.gramene.org/)。參照文獻(mccouchsr.2002.developmentandmappingof2240newssrmarkersforrice(oryzasatival.).naturednaresearch9:199–207(2002).)，每隔上一段物理距離合成3-4對ssr引物，在親本協(xié)青早b和中恢9308之間篩多態(tài)，篩到多態(tài)的ssr標記則可直接應用于該群體。

新開發(fā)的ssr標記均在擎科生物技術公司合成。

1.5目標區(qū)段的精細定位及其驗證

定位了目標區(qū)間之后，結合新開發(fā)標記的雜合子以及目標基因座位的信息，最終錨定了目標基因區(qū)間以及與之連鎖的分子標記信息。

從整個群體的所有4000株植株中，隨機選取300株作為對初期定位結果的驗證以及目標區(qū)間的盡可能縮短。為驗證此區(qū)間，我們總共在rm5476和rm5875之間檢測了58對新ssr引物。這些引物中僅有8對引物在父母親本間呈現(xiàn)多態(tài)性。因此我們在這300個隨機植株中應用了此8個多態(tài)性標記建立了連鎖圖，結合基因型及表型數(shù)據(jù)做了qtl的初定位。用軟件windowsqtlcartographerv2.5計算，lod值取2.0。

2結果

2.1cssl群體及其父母本的柱頭外露率

cssl群體父母本的柱頭外露率為：p-51(cl-51親本)具低柱頭外露率，為6.24％，而中恢9308柱頭外露率則更高，為11.07％。協(xié)青早b則具有明顯更高的柱頭外露率，為36.8％(表1，圖2)。為何此cl-51親本相對父本材料中恢9308而言，其柱頭外露率反而更低？我們大膽推測，該區(qū)間含有控制水稻柱頭外露率qtl的染色體片段來自于協(xié)青早b，且具有負向調(diào)控作用，降低了植株的柱頭外露率，能有效降低柱頭外露率高達43.63％。f2群體所有柱頭外露率的性狀表型值分布圖示于圖3。

表1.cssl群體親本的柱頭外露性狀數(shù)據(jù)

注：表中xqzb指協(xié)青早b，zh9308指中恢9308，p-51指cl-51親本。

2.2縮小qtlqpsse-7區(qū)間

qpsse-7的遺傳分析及其精細定位。

結合表型數(shù)據(jù)，將包含qpsse-7的染色體區(qū)段進一步定位于rm5436到indel103之間，可解釋1.51％的表型變異。最終通過進一步分析群體雜合子數(shù)據(jù)，包含qpsse-7的染色體區(qū)段被進一步定位于rm5436和rm5499之間，大約涵蓋1000kb物理距離。所述分子標記rm5499的引物為：上游引物ggacgaaagggtatttgattgg(seqidno.5所示)，下游引物cctcaaggtggtctccttctcc(seqidno.6所示)。

為縮小qpsse-7區(qū)間，我們共檢測了58對ssr引物，其中僅有8對引物在cl-51兩親本間顯示多態(tài)性。引物檢測結果顯示于表2中(表2中ind103是indel，即插入缺失標記)。

表2.用于進一步縮短qpsse-7區(qū)間所使用的引物

注：表中rm5499、rm21360、rm542、rm214、ind103、rm21470、rm6449、rm5543的上下游引物分別對應序列表中seqidno.5和no.6，seqidno.7和no.8，seqidno.9和no.10，seqidno.11和no.12，seqidno.13和no.14，seqidno.15和no.16，seqidno.17和no.18，seqidno.19和no.20所示。

從cl-51的4000株群體中隨機選取300株，并用帶有多態(tài)性的上述8個標記進行監(jiān)測，結合表型數(shù)據(jù)，在第7染色體區(qū)段上定位到了一個控制柱頭外露率的qtl(圖4)，命名為qpsse-7，具有1.82％的顯性效應，并可解釋1.51％的表型變異，增效等位基因來自于協(xié)青早b，可降低43.63％的柱頭外露率值。包含此位點qpsse-7的物理距離約為1000kb，介于rm5436和rm5499之間。

結合300個隨機選取植株的表型及基因型數(shù)據(jù)?？ǚ綑z測顯示單柱頭外露率的分離比符合孟德爾因子3：1的分離比(x²＝0.25＜x²0.05＝3.19)(圖4)。

將ssr標記rm5436和rm5875應用于cl-51的4000群體植株中，結果檢測出了95個雜合子。進一步應用新開發(fā)的8個ssr標記，我們發(fā)現(xiàn)越來越少的雜合子個數(shù)，諸如65、63、58以及38個(圖5)。

綜上所述，本發(fā)明利用一個次級分離群體，對先前已檢測到的柱頭外露率主效qtl進行進一步的遺傳定位。該次級分離群體供體親本為協(xié)青早b，受體親本為中恢9308，群體由134個自交株系組成，并且不斷回交、自交，最終衍生而成bc4f8，僅在目標區(qū)段雜合。

在先前的研究中，用了9個ssr標記和1個indel標記檢測到包含qpsse-7的區(qū)段位于rm5436-rm5875之間。結合表型數(shù)據(jù)，包含qpsse-7的染色體區(qū)段進一步定位于rm5436到indel103之間，可解釋1.51％的表型變異。在本研究中，通過進一步分析群體雜合子數(shù)據(jù)，包含qpsse-7的染色體區(qū)段被進一步定位于rm5436和rm5499之間，大約涵蓋1000kb物理距離。

3、討論

通過研究，我們在第7染色體上定位到了一個控制柱頭外露率的qtl。利用cl-51群體，將包含此qtl的區(qū)間進一步縮小定位并命名為qpsse-7。此前從未報道過此區(qū)間，因此可認為該區(qū)間包含新基因。我們將包含此qpsse-7的區(qū)域定位于約1000kb左右的物理距離上。眾所周知，水稻外露的柱頭非常脆弱，在開花期間極易受環(huán)境所影響，例如溫度、風、水壓以及物理折損等等。本研究中，我們在以往的研究基礎之上對柱頭外露的測量方法進行了一系列的改進。一些學者的研究中，集中于開花期收集主穗，以避免外露的柱頭遭遇不測并保證數(shù)據(jù)的準確性，然而另一些學者則傾向于在抽穗7-10天后就收集主穗。盡管外露的柱頭非常脆弱，但直至灌漿前，雌蕊形狀還是保持不變的。在我們以往的研究中，通常于大約開花6天左右收集父母本的3個主穗以及cssl群體每行每株系的3個主穗以做記錄。本發(fā)明中，我們采用在開花6-7天，且等到主穗最底部也開花2-3天后選取主穗樣本。

水稻中有關sse、dse以及tse的qtl研究都有報道。在一些研究中(liwh,donggj,huxm,tengs,guolb,zhengdl,qianq.2003.qtlanalysisforpercentageofexertedstigmainrice(oryzasatival.).yichuanxuebao,30,637-640)，第2和第3染色體上共發(fā)現(xiàn)了5個qtl；1、2、5和8號染色體上報道發(fā)現(xiàn)了9個qtl；1、5、6、7、8、9、10和11染色體上發(fā)現(xiàn)了15個qtl，其中第7染色體上發(fā)現(xiàn)的3個qtl分別是控制柱頭長/寬比、雙柱頭外露率以及總柱頭外露率的。控制水稻柱頭長寬比的qtl與rm118連鎖，另兩個控制雙柱頭外露率以及總柱頭外露率的qtl與rm455連鎖，在第7染色體底部物理距離為22298054bp的位置，與本研究中包含qpsse-7位點的區(qū)間距離非常遙遠。li等(lip,fengf,zhangq,chaoy,gaog,hey.2014.geneticmappingandvalidationofquantitativetraitlociforstigmaexertionrateinrice.molecularbreeding,34,2131-2138.http://dx.doi.org/10.1007/s11032-014-0168-2)在染色體1、3、6、7、9、10和12上共檢測到11個qtl。在這些qtl中，li將在第7染色體上定位到的qtl命名為qsse-7，其位置在第7染色體的底部，與yan等人(yan,w.g.,li,y.,agrama,h.a.,luo,d.,gao,f.,lu,x.,ren,g.(2009).associationmappingofstigmaandspikeletcharacteristicsinrice(oryzasatival.).molbreed.24,277-292.http://dx.doi.org/10.1007/s11032-009-9290-y)發(fā)現(xiàn)的qtl位置接近。lou等人(louj,yuegh,yangwq,meihw,luolj,luhj.2014.mappingqtlsinfluencingstigmaexertioninrice.bulgarianjournalofagriculturalscience,20,1450-1456；lip,fengf,zhangq,chaoy,gaog,hey.2014.geneticmappingandvalidationofquantitativetraitlociforstigmaexertionrateinrice.molecularbreeding,34,2131-2138.)發(fā)現(xiàn)的qtl位置距離此區(qū)間不很近，在第7染色體上19530534bp處，同樣也距離本研究中的qpsse-7位置非常遙遠，本研究所涉及的區(qū)域在以往報道中從未提及，因此可認為qpsse-7是個新基因。

在以往研究中，人們往往將具有較大效應的qtl作為數(shù)量性狀遺傳改良的重要資源。本研究中，我們在第7染色體上定位到一個基因簇，并利用cl-51群體，將此區(qū)域精細定位于標記rm5436和rm5499之間，覆蓋大約1000kb。qpsse-7、qpdse-7和qptse-7是緊密連鎖的qtl，假設此3個qtl能結合在一起那么就可以同時提升sse、dse以及tse，從而提高雜交稻的制種潛力。水稻中雙柱頭相比較于單柱頭而言，兩者一樣重要，即dse和sse一樣，在水稻雜交稻制種中起到非常重要的作用，可以提升制種的異交結實潛力。sse、dse和tse三者具有極顯著正相關。

本研究中qpsse-7來自于協(xié)青早b，具有負向效應，能降低sse達43.63％。協(xié)青早b的單柱頭外露率要顯著高于中恢9308，這一現(xiàn)象的原因是這是協(xié)青早b上所有12條染色體基因位點共同綜合協(xié)同作用的結果。盡管協(xié)青早b上所有基因位點共同綜合作用的結果是正向的，但qpsse-7位點是負向效應。因此，對育種家而言，可以通過mas(分子標記輔助育種)手段避免使用協(xié)青早b第7染色體上qpsse-7區(qū)段的位置，進而在育種實踐中通過提升柱頭外露率有效提高雜交稻的育種產(chǎn)量潛力。

4、結論：

本研究中，我們利用cl-51在第7染色體上定位到了一個qtl，將其命名為qpsse-7，并定位于標記rm5436和rm5499之間約1000kb的物理距離內(nèi)。此區(qū)域在以往有關柱頭外露的研究中從未見報道過，因此可以認為是發(fā)現(xiàn)了一個新基因。水稻育種上高的柱頭外露率可明顯提高雜交結實率。因此，將來可通過mas手段育成帶有遺傳改良性質(zhì)的cms(細胞質(zhì)雄性不育系)，通過提高其柱頭外露率來提升異交結實率，進而進一步增加雜交稻的制種效率。此研究將qpsse-7精細定位于第7染色體上約320kb物理距離的位置，并為將來進一步利用mas手段遺傳改良新作物以及克隆等后續(xù)工作提供依據(jù)。伴隨雜交稻育種高新技術的不斷發(fā)展，通過提升cms的柱頭外露率來提高雜交稻制種效率的技術策略將在未來雜交稻育種工作中得到越來越廣泛的應用。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，本領域技術人員利用上述揭示的技術內(nèi)容做出些許簡單修改、等同變化或修飾，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國水稻研究所

<120>水稻柱頭外露率主效qtl及其定位方法

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