本發(fā)明涉及一種麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體的制備及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

海藻糖(trehalose)是由兩個吡喃環(huán)葡萄糖以1,1-糖苷鍵連結(jié)而成，是一種穩(wěn)定的非還原性二糖，它有3種光學(xué)異構(gòu)體，即αα型、αβ型和ββ型。

海藻糖是一種安全的非還原性二糖，廣泛存在于自然界中，具有保濕性，抗凍抗干燥性，熱酸穩(wěn)定性等特殊的生物學(xué)功能，對生物大分子有著非特異性的保護(hù)作用，因此在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、化妝品、食品等行業(yè)應(yīng)用潛力巨大。自20世紀(jì)80年代后，各國相繼開展了海藻糖生理生化和分子生物學(xué)的研究，該糖現(xiàn)已成為國際上最近開發(fā)的主要低聚糖之一。

酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖是上世界90年代逐漸興起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和雙酶法這三種方法。當(dāng)前以淀粉為底物經(jīng)過麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生成海藻糖，即雙酶法生產(chǎn)海藻糖，受到廣泛關(guān)注。以該方法生產(chǎn)海藻糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)80％以上，在一定程度上降低了海藻糖的生產(chǎn)成本并極大的推動了海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程。

麥芽寡糖基海藻糖合成酶是雙酶法生產(chǎn)海藻糖的其中一種酶。淀粉經(jīng)過高溫液化后加入支鏈淀粉酶作用生成麥芽糊精，麥芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物還原性末端的α,α-1,4-糖苷，產(chǎn)生α,α-1,4-糖苷鍵到α,α-1,1-糖苷鍵的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷作用，形成中間產(chǎn)物麥芽寡糖基海藻糖，麥芽寡糖基海藻糖水解酶則專一的內(nèi)切該中間產(chǎn)物中麥芽寡糖基與海藻糖相連的α,α-1,4-糖苷鍵，使之分解產(chǎn)生海藻糖和減少兩個葡萄糖單位的新麥芽寡糖，減少兩個葡萄糖單位的新麥芽寡糖作為新底物進(jìn)行下一輪反應(yīng)，如此反復(fù)交替進(jìn)行兩種酶反應(yīng)就可以將麥芽寡糖轉(zhuǎn)化成主要為海藻糖，以及少量葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖的產(chǎn)物。

雙酶法生產(chǎn)海藻糖以淀粉為底物，轉(zhuǎn)化率高達(dá)80％以上，具有低成本的優(yōu)點，但是麥芽寡糖基海藻糖合成酶基因在宿主菌中的可溶性表達(dá)很低，產(chǎn)生較多的包涵體，酶活力低，不利于其工業(yè)化應(yīng)用。因此，本發(fā)明利用基因工程和酶工程手段，在不影響麥芽寡糖基海藻糖合成酶酶學(xué)性質(zhì)和轉(zhuǎn)化率的基礎(chǔ)上提高其可溶性表達(dá)，從而提高酶活，為其工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造條件。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體，該突變體是通過將sulfolobusacidocaldariusatcc33909來源的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的蛋白表面疏水區(qū)域相關(guān)氨基酸殘基進(jìn)行取代后得到的。與其親代的麥芽寡糖基海藻糖合成酶相比，突變體在宿主菌中的可溶性表達(dá)有一定程度的提高，宿主菌胞內(nèi)麥芽寡糖基海藻糖合成酶酶活提高。

所述sulfolobusacidocaldariusatcc33909來源的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第96位亮氨酸(leu)突變?yōu)樘K氨酸(thr)，突變體命名為l96t。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第96位亮氨酸(leu)突變?yōu)榻M氨酸(his)，突變體命名為l96h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第106位甲硫氨酸(met)突變?yōu)橘嚢彼?lys)，突變體命名為m106k。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第106位甲硫氨酸(met)突變?yōu)榻M氨酸(his)，突變體命名為m106h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第374位脯氨酸(pro)突變?yōu)楣劝彼?glu)，突變體命名為p374e。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第374位脯氨酸(pro)突變?yōu)榻M氨酸(his)，突變體命名為p374h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第520位異亮氨酸(ile)突變?yōu)榻M氨酸(his)，突變體命名為i520h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第520位異亮氨酸(ile)突變?yōu)榫彼?arg)，突變體命名為i520r。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第96位亮氨酸(leu)突變?yōu)樘K氨酸(thr)，同時將第106位甲硫氨酸(met)突變?yōu)橘嚢彼?lys)，突變體命名為l96t/m106k。

本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體的制備方法，包括如下步驟：

(1)根據(jù)確定的突變位點，設(shè)計定點突變的突變引物，以攜帶麥芽寡糖基海藻糖合成酶基因的載體為模板進(jìn)行定點突變；構(gòu)建含編碼突變體的基因的質(zhì)粒載體；

(2)將突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞；

(3)挑選陽性克隆進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞破壁上清即為麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體的粗酶液。

所述質(zhì)粒載體為puc系列，pet系列，或pgex中的任意一種。

所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌或真菌細(xì)胞。

所述的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌。

本發(fā)明提供了一系列在宿主菌中可溶性表達(dá)強(qiáng)度提高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，突變體l96t、l96h、m106k、m106h、i520h、i520r、l96t/m106k麥芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活分別為野生酶的2.69倍、1.16倍、2.45倍、1.92倍、1.07倍、1.09倍、3.04倍。

附圖說明

圖1野生型麥芽寡糖基海藻糖合成酶和突變體(l96t、l96h、m106k、m106h、i520h、i520r、l96t/m106k)重組菌搖瓶酶活力測定

具體實施方式

實施例1野生麥芽寡糖基海藻糖合成酶的制備

(1)麥芽寡糖基海藻糖合成酶重組菌的構(gòu)建

根據(jù)ncbi上的trey氨基酸序列(ncbi編號：wp_015385613.1)，將ncbi上的trey基因序列(ncbi編號：nc_020247.1)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，采用化學(xué)全合成方法合成麥芽寡糖基海藻糖合成酶的基因序列trey。用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的質(zhì)粒是pet24a(+)。將pet24a(+)質(zhì)粒和帶有trey基因的質(zhì)粒分別進(jìn)行ndeⅰ和hindⅲ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用t4連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mg/l卡那霉素的lb平板，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，平板上挑取3個單菌落，接入lb液體培養(yǎng)基，8h后抽提質(zhì)粒驗證，結(jié)果正確，得到富集的trey/pet24a質(zhì)粒。將質(zhì)粒trey/pet24a轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子在lb液體培養(yǎng)基(含100mg/l卡那霉素)中37℃培養(yǎng)過夜，保存甘油管，命名為trey/pet24a/bl21(de3)。

(2)麥芽寡糖基海藻糖合成酶的表達(dá)

從甘油管接種trey/pet24a/bl21(de3)于lb液體培養(yǎng)基(含100mg/l卡那霉素)生長8h，按5％接種量將種子接入tb液體發(fā)酵培養(yǎng)基(含100mg/l卡那霉素)。大腸桿菌在37℃培養(yǎng)2h后，加入0.01mm終濃度的iptg(異丙基硫代-β-d半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)，并在25℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵24h后，將一定體積發(fā)酵液于4℃、12000r·min^-1離心10min去上清液，收集菌體，菌體沉淀用50mmol·l^-1ph8.5na2hpo4-nah2po4緩沖液重新懸浮，混勻。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎菌體懸浮液的細(xì)胞壁(超聲細(xì)胞破碎機(jī)的工作條件：工作探頭，工作時間5min，工作3s停3s，工作功率為20％)，然后12000r·min^-1離心10min，離心后上清即為發(fā)酵胞內(nèi)粗酶液。

實施例2麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體的制備及表達(dá)

(1)突變體的制備

來源于sulfolobusacidocaldariusatcc33909的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的八種突變體酶l96t、l96h、m106k、m106h、p374e、p374h、i520h、i520r：根據(jù)sulfolobusacidocaldariusatcc33909麥芽寡糖基海藻糖合成酶的基因序列，分別設(shè)計并合成引入l96t、l96h、m106k、m106h、p374e、p374h、i520h、i520r突變的引物，對麥芽寡糖基海藻糖合成酶基因進(jìn)行定點突變，測定dna編碼序列，分別鑒別出第96位的leu密碼子變成thr密碼子和his密碼子，第106位的met密碼子變成lys密碼子和his密碼子，第374位的pro密碼子變成glu密碼子和his密碼子，第520位的ile密碼子變成his密碼子和arg密碼子。將突變體基因置于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體并導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到單突變麥芽寡糖基海藻糖合成酶。單突變l96t、l96h、m106k、m106h、p374e、p374h、i520h、i520r的定點突變：利用快速pcr技術(shù)，以表達(dá)載體trey/pet24a(+)為模板。

引入l96t突變的定點突變引物為：

正向引物：5’-ggttaacagcacgaattggcgc-3’(下劃線為突變堿基)

反向引物：5’-gcgccaattcgtgctgttaacc-3’(下劃線為突變堿基)

引入l96h突變的定點突變引物為：

正向引物：5’-ggttaacagccacaattggcgc-3’(下劃線為突變堿基)

反向引物：5’-gcgccaattgtggctgttaacc-3’(下劃線為突變堿基)

引入m106k突變的定點突變引物為：

正向引物：5’-atgttctgaagaagggtaagaa-3’(下劃線為突變堿基)

反向引物：5’-ttcttacccttcttcagaacat-3’(下劃線為突變堿基)

引入m106h突變的定點突變引物為：

正向引物：5’-atgttctgaagcacggtaagaa-3’(下劃線為突變堿基)

反向引物：5’-ttcttaccgtgcttcagaacat-3’(下劃線為突變堿基)

引入p374e突變的定點突變引物為：

正向引物：5’-ccaaacgtaatgaggaagcgta-3’(下劃線為突變堿基)

反向引物：5’-tacgcttcctcattacgtttgg-3’(下劃線為突變堿基)

引入p374h突變的定點突變引物為：

正向引物：5’-ccaaacgtaatcacgaagcgta-3’(下劃線為突變堿基)

反向引物：5’-tacgcttcgtgattacgtttgg-3’(下劃線為突變堿基)

引入i520h突變的定點突變引物為：

正向引物：5’-tgaagcgaaacacaatacgagc-3’(下劃線為突變堿基)

反向引物：5’-gctcgtattctttgaggcttca-3’(下劃線為突變堿基)

引入i520r突變的定點突變引物為：

正向引物：5’-tgaagcgaaacggaatacgagc-3’(下劃線為突變堿基)

反向引物：5’-gctcgtattccgtttcgcttca-3’(下劃線為突變堿基)

pcr反應(yīng)體系均為：5×psbuffer10μl，dntpsmix(2.5mm)4μl，正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板dna1μl，primerstarhs(5u/μl)0.5μl，加入雙蒸水至50μl。

pcr擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；隨后30個循環(huán)(98℃10s，55℃5s，72℃7min30s)；72℃繼續(xù)延伸10min。

pcr產(chǎn)物經(jīng)dpnⅰ消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)，感受態(tài)細(xì)胞在lb固體培養(yǎng)基(含100mg/l氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜后，挑克隆于lb液體培養(yǎng)基(含100mg/l氨芐青霉素)中培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，所有突變質(zhì)粒均測序正確。

(2)突變體酶的表達(dá)

突變體表達(dá)過程如實施例1所述。

實施例3麥芽寡糖基海藻糖合成酶酶活力分析

(1)酶活單位定義

采用3，5-二硝基水揚酸法(dns法)測定麥芽寡糖基海藻糖合成酶酶活時，每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol麥芽五糖為麥芽三糖基海藻糖所需的酶量作為一個活力單位。

(2)酶活力測定步驟

預(yù)熱：取0.5ml的1％麥芽五糖溶液(50mmph5.5磷酸鹽緩沖液)于試管中，置于60℃水浴鍋中預(yù)熱10min。

反應(yīng)：加入0.05ml發(fā)酵胞內(nèi)粗酶液，振蕩均勻，準(zhǔn)確計時10min，沸水浴煮沸10min終止反應(yīng)，冷卻。加入1mldns振蕩均勻，沸水浴煮沸7min，冷卻。

測量：向上述反應(yīng)體系中加入蒸餾水并定容至10ml，混勻。在540nm波長下測定吸光值并計算酶活力。

野生型麥芽寡糖基海藻糖合成酶和突變體酶的搖瓶培養(yǎng)24hod600nm及酶活力列于表1，其中l(wèi)96t和m106k效果最顯著，酶活分別為野生酶的2.69倍和2.45倍。此外，酶學(xué)定性實驗結(jié)果表明，各突變體的酶學(xué)性質(zhì)均與野生酶相似。

表1野生型麥芽寡糖基海藻糖合成酶和突變體酶的搖瓶od600nm及酶活

實施例4麥芽寡糖基海藻糖合成酶雙突變體的制備

由實施例3發(fā)現(xiàn)，在眾多突變體中突變體l96t和突變體m106k可溶性表達(dá)顯著提高，由此將麥芽寡糖基海藻糖合成酶leu96位點和met106位點進(jìn)行雙突變，設(shè)計突變體l96t/m106k。

雙突變l96t/m106k的定點突變：利用快速pcr技術(shù)，以表達(dá)載體l96t/pet24a(+)為模板。

引入m106k突變的定點突變引物為：

正向引物：5’-atgttctgaagaagggtaagaa-3’(下劃線為突變堿基)

反向引物：5’-ttcttacccttcttcagaacat-3’(下劃線為突變堿基)

pcr反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及突變基因的測序方法同單突變體的方法。

實施例5麥芽寡糖基海藻糖合成酶雙突變體l96t/m106k酶活力分析

酶活測定方法如實施例3所述。

野生型麥芽寡糖基海藻糖合成酶和雙突變體酶的搖瓶培養(yǎng)24hod600nm及酶活力列于表2，酶學(xué)定性實驗結(jié)果表明，雙突變體的酶學(xué)性質(zhì)與野生酶相似。

表2野生型麥芽寡糖基海藻糖合成酶和雙突變體酶的搖瓶od600nm及酶活

突變體l96t、l96h、m106k、m106h、i520h、i520r、l96t/m106k麥芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活力分別為野生酶的2.69倍、1.16倍、2.45倍、1.92倍、1.07倍、1.09倍、3.04倍。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>湖南匯升生物科技有限公司

<120>一種麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體的制備及其應(yīng)用

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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