本發(fā)明涉及體外免疫診斷檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種igg抗體、igm抗體及方法。

背景技術(shù)：

1、病原體是一類能夠引起疾病的微生物或寄生生物，又稱病原微生物，包括細菌、病毒、真菌、寄生蟲、原生動物等。病原體通過直接侵入宿主體內(nèi)、釋放毒素、干擾宿主細胞的正常功能、引起免疫反應(yīng)等機制引起疾病，其中以細菌和病毒的危害性最大。常見的流行病原體包括：細菌，呼吸道類病毒和腸道類病毒。

2、病原體檢測是指通過實驗室技術(shù)和方法來識別、檢測和定量病原體的過程。病原體檢測對確定疾病的原因，監(jiān)控疾病的傳播，評估疾病的嚴重性上具有重要作用，還可以指導(dǎo)有效的治療和指導(dǎo)形成預(yù)防措施，現(xiàn)已成為臨床診斷中的一項重要工作。

3、隨著分子生物學診斷技術(shù)的進步，病原體（例如柯薩奇病毒）的檢測方法經(jīng)歷了病原體分離培養(yǎng)檢測法，pcr法和免疫學檢測法等階段。病原體分離培養(yǎng)檢測法需要對病原體先分離再培養(yǎng)，操作復(fù)雜，耗時較長，在結(jié)果的判定上有一定的主觀性。pcr法通過檢測目標的dna或者rna序列來檢測病原體，雖然在特異性和價格上具有較大優(yōu)勢，但擴增產(chǎn)物要通過瓊脂糖凝膠電泳進行判讀，其靈敏度較低且耗時長。免疫學檢測法是基于抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)原理進行病原體檢測，盡管有著操作簡單、方便快速等優(yōu)點，但仍未克服靈敏性不足，易造成假陽和假陰性結(jié)果的缺點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、第一方面，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合柯薩奇病毒的igg抗體，其特征在于，所述igg抗體的重鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrh1-cdrh3的氨基酸序列分別如seq?id?no：1、seqid?no：2和seq?id?no：3所示；輕鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrl1-cdrl3的氨基酸序列分別如seq?id?no：4、seq?id?no：5和seq?id?no：6所示。

2、在一些實施例中，所述igg抗體與磁珠偶聯(lián)。

3、在一些實施例中，所述igg抗體經(jīng)吖啶酯標記。

4、在一些實施例中，所述igg抗體與生物素偶聯(lián)。

5、第二方面，本發(fā)明還提供了一種igm抗體，其特征在于，所述igm抗體由第一方面的igg抗體改造而成，所述igm抗體包括重鏈恒定區(qū)、輕鏈恒定區(qū)、重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。

6、在一些實施例中，所述重鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrh1-cdrh3的氨基酸序列分別如seq?id?no：1、seq?id?no：2和seq?id?no：3所示；所述輕鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrl1-cdrl3的氨基酸序列分別如seq?id?no：4、seq?id?no：5和seq?id?no：6所示。

7、在一些實施例中，所述重鏈恒定區(qū)包括第一恒定區(qū)、第二恒定區(qū)、第三恒定區(qū)和第四恒定區(qū)，其中所述第一恒定區(qū)源自鼠igg抗體，所述第一恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?idno：13所示。

8、在一些實施例中，所述第二恒定區(qū)、所述第三恒定區(qū)和所述第四恒定區(qū)源自鼠igm抗體。

9、在一些實施例中，所述第二恒定區(qū)、所述第三恒定區(qū)和所述第四恒定區(qū)的氨基酸序列分別如seq?id?no：14、seq?id?no：15和seq?id?no：16所示。

10、在一些實施例中，所述igm抗體與磁珠偶聯(lián)。

11、在一些實施例中，所述igm抗體經(jīng)吖啶酯標記。

12、在一些實施例中，所述igm抗體與生物素偶聯(lián)。

13、第三方面，本發(fā)明還提供了一種特異性結(jié)合柯薩奇病毒的igg抗體，其特征在于，所述igg抗體的重鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrh1-cdrh3的氨基酸序列分別如seq?id?no：7、seq?id?no：8和seq?id?no：9所示；輕鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrl1-cdrl3的氨基酸序列分別如seq?id?no：10、seq?id?no：11和seq?id?no：12所示。

14、在一些實施例中，所述igg抗體與磁珠偶聯(lián)。

15、在一些實施例中，所述igg抗體經(jīng)吖啶酯標記。

16、在一些實施例中，所述igg抗體與生物素偶聯(lián)。

17、第四方面，本發(fā)明還提供了一種igm抗體，其特征在于，所述igm抗體由第三方面的igg抗體改造而成，所述igm抗體包括重鏈恒定區(qū)、輕鏈恒定區(qū)、重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。

18、在一些實施例中，所述重鏈恒定區(qū)包括第一恒定區(qū)、第二恒定區(qū)、第三恒定區(qū)和第四恒定區(qū)，其中所述第一恒定區(qū)源自鼠igg抗體，所述第一恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?idno：13所示。

19、在一些實施例中，所述第二恒定區(qū)、所述第三恒定區(qū)和所述第四恒定區(qū)源自鼠igm抗體。

20、在一些實施例中，所述第二恒定區(qū)、所述第三恒定區(qū)和所述第四恒定區(qū)的氨基酸序列分別如seq?id?no：14、seq?id?no：15和seq?id?no：16所示。

21、在一些實施例中，所述igm抗體與磁珠偶聯(lián)。

22、在一些實施例中，所述磁珠包被表面為羧基表面，可替代為原始表面、修飾表面(氨基、羥基和硫酸鹽)、預(yù)激活表面(甲苯磺?；h(huán)氧樹脂和氯甲基基團)和生物激活表面(蛋白質(zhì)a、蛋白質(zhì)g、鏈霉菌素、生物素)。

23、在一些實施例中，所述igm抗體經(jīng)吖啶酯標記。

24、在一些實施例中，所述igm抗體與生物素偶聯(lián)。

25、第五方面，本發(fā)明還提供了一種檢測試劑，其特征在于，所述檢測試劑包括第二方面所述的igm抗體和/或與第四方面所述的igm抗體。

26、在一些實施例中，所述檢測試劑包括與磁珠偶聯(lián)的第二方面所述的igm抗體和/或與磁珠偶聯(lián)的第四方面所述的igm抗體。

27、在一些實施例中，所述檢測試劑的制備方法包括：(a)?300μl?0.01m?pbs加入50μl羧基磁珠，渦旋震蕩5?min，磁吸去上清，重復(fù)2次；(b)?加入150μl?ph?6.0?mes溶解，渦旋30s混勻；(c)?加入20mg/ml?edc和20mg/ml?sulfo-nhs，再次旋渦震蕩混勻，37℃活化30min；(d)?加入300μl?0.01m的pbs，渦旋30?s，磁吸去上清，重復(fù)3次；(e)?加入300μl0.5mg/ml的第二方面或第四方面所述的igm抗體，37℃震蕩混勻2?h，磁吸去上清；(f)?加入5ml封閉液(1%bsa)重懸，37℃震蕩10min磁吸去上清，重復(fù)2次；(g)?加入5ml封閉液(1%bsa)重懸，得到所述檢測試劑，4℃?zhèn)溆谩?/p>

28、在一些實施例中，所述檢測試劑包括與磁珠偶聯(lián)的第二方面所述的igm抗體和經(jīng)吖啶酯標記的第四方面所述的igm抗體；或者

29、與磁珠偶聯(lián)的第四方面所述的igm抗體和經(jīng)吖啶酯標記的第二方面所述的igm抗體。

30、第六方面，本發(fā)明還提供了一種檢測試劑，其特征在于，所述檢測試劑包括：

31、磁珠-鏈霉親和素偶聯(lián)物；

32、生物素修飾的第一igm抗體；和

33、吖啶酯標記的第二igm抗體；

34、其中所述第一igm抗體和所述第二igm抗體選自第二方面或第四方面所述的igm抗體，且所述第一igm抗體和所述第二igm抗體不同。

35、在一些實施例中，所述磁珠-鏈霉親和素偶聯(lián)物和所述生物素修飾的第一igm抗體的質(zhì)量比為1:2。

36、在一些實施例中，所述生物素修飾的第一igm抗體的制備方法包括：將所述第一igm抗體與生物素混合，其中所述第一igm抗體與所述生物素的投料比（質(zhì)量比）包括1:2-10。

37、在一些實施例中，所述吖啶酯標記的第二igm抗體的制備方法包括：將所述第二igm抗體與吖啶酯混合，其中所述第二igm抗體與所述吖啶酯的投料比（質(zhì)量比）包括1:10-30。

38、第七方面，本發(fā)明還提供了一種提升病原微生物的檢測靈敏度的方法，其特征在于，包括以下步驟：

39、獲得待檢測樣本；

40、將檢測試劑加入到所述待檢測樣本中；

41、使用化學發(fā)光方法檢測所述待檢測樣本中的病原微生物的濃度；

42、其中所述檢測試劑包括上述igm抗體或檢測試劑。

43、在一些實施例中，所述病原微生物為柯薩奇病毒。

44、在一些實施例中，所述檢測試劑具體包括：

45、磁珠-鏈霉親和素偶聯(lián)物；

46、生物素修飾的第一igm抗體；和

47、吖啶酯標記的第二igm抗體；

48、其中所述第一igm抗體和所述第二igm抗體選自第二方面或第四方面所述的igm抗體，且所述第一igm抗體和所述第二igm抗體不同。

49、在一些實施例中，所述方法具體包括：

50、將所述磁珠-鏈霉親和素偶聯(lián)物和所述生物素修飾的第一igm抗體混合，得到預(yù)混物；

51、將所述預(yù)混物和所述待檢測樣本混合，得到磁珠-第一igm抗體-抗原偶聯(lián)物；

52、將所述磁珠-第一igm抗體-抗原偶聯(lián)物與所述吖啶酯標記的第二igm抗體混合，得到第一igm抗體-抗原-第二igm抗體夾心復(fù)合物；

53、使用化學發(fā)光方法檢測所述待檢測樣本中的柯薩奇病毒的濃度。

54、第八方面，本發(fā)明還提供了一種提升對生物標志物的檢測靈敏度的方法，其特征在于，包括以下步驟：

55、s101?使用抗原、cpg和氯化錳對動物進行免疫，誘導(dǎo)所述動物產(chǎn)生igg抗體；

56、s102?將所述動物的b淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得雜交瘤細胞；

57、s103?對所述雜交瘤細胞進行篩選，獲得陽性的雜交瘤細胞；

58、s104?從所述陽性的雜交瘤細胞的培養(yǎng)物中收集igg單克隆抗體；

59、s105?對所述igg單克隆抗體進行測序，獲得所述igg單克隆抗體的可變區(qū)的序列；

60、s106?將所述igg單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的序列、鼠源或兔源的igg抗體的恒定區(qū)序列片段ch1、與鼠源或兔源的igm抗體恒定區(qū)片段ch2-ch4進行基因重組，獲得重鏈表達載體；

61、s107?將所述重鏈表達載體和輕鏈表達載體于細胞中表達并對培養(yǎng)上清液進行純化，獲得純化的igm重組抗體；

62、s108?使用所述igm重組抗體檢測生物標志物。

63、在一些實施例中，所述s102的所述動物的抗體滴度≥104。

64、在一些實施例中，所述可變區(qū)包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。

65、在一些實施例中，所述生物標志物包括病原微生物，例如細菌、病毒、真菌和寄生蟲中的一種或多種。

66、在一些實施例中，所述病原微生物為柯薩奇病毒。

67、在一些實施例中，所述純化為protein?g一步法純化。

68、在一些實施例中，所述igm抗體包括重鏈恒定區(qū)、輕鏈恒定區(qū)、重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。

69、在一些實施例中，所述重鏈恒定區(qū)包括第一恒定區(qū)、第二恒定區(qū)、第三恒定區(qū)和第四恒定區(qū)，其中所述第一恒定區(qū)源自鼠igg抗體。

70、在一些實施例中，所述第一恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：13所示。

71、在一些實施例中，所述第二恒定區(qū)、所述第三恒定區(qū)和所述第四恒定區(qū)源自鼠igm抗體。

72、在一些實施例中，所述第二恒定區(qū)、所述第三恒定區(qū)和所述第四恒定區(qū)的氨基酸序列分別如seq?id?no：14、seq?id?no：15和seq?id?no：16所示。

73、在一些實施例中，所述重鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrh1-cdrh3的氨基酸序列分別如seq?id?no：1、seq?id?no：2和seq?id?no：3所示；所述輕鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrl1-cdrl3的氨基酸序列分別如seq?id?no：4、seq?id?no：5和seq?id?no：6所示。

74、在一些實施例中，所述重鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrh1-cdrh3的氨基酸序列分別如seq?id?no：7、seq?id?no：8和seq?id?no：9所示；所述輕鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)cdrl1-cdrl3的氨基酸序列分別如seq?id?no：10、seq?id?no：11和seq?id?no：12所示。

75、在一些實施例中，所述igm抗體與磁珠偶聯(lián)。

76、在一些實施例中，所述igm抗體經(jīng)吖啶酯標記。

77、在一些實施例中，所述igm抗體與生物素偶聯(lián)。

78、在一些實施例中，所述重組igm抗體包括第一igm抗體和第二igm抗體。

79、在一些實施例中，所述第一igm抗體與磁珠偶聯(lián)。

80、在一些實施例中，所述第二igm抗體經(jīng)吖啶酯標記。

81、在一些實施例中，所述第一igm抗體與親和素偶聯(lián)。

82、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果至少包括以下方面：

83、雖然基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學檢測方法具備操作簡單、方便快速等優(yōu)點，但仍存在靈敏性不足，易造成假陽和假陰性結(jié)果等缺點。為提高對柯薩奇病毒的檢測靈敏度，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合柯薩奇病毒的igg抗體，其不僅特異性好，能夠特異性識別柯薩奇病毒，而且靈敏度和穩(wěn)定性也可以達到較高水平。

84、基于上述igg抗體，本發(fā)明還提供了經(jīng)上述igg抗體改造而成的igm抗體。諸多現(xiàn)有技術(shù)（例如cn112538111a、cn117821510a）在將igg抗體改造成igm抗體時，igm抗體的重鏈恒定區(qū)通常不涉及重鏈恒定區(qū)ch1部分，或者完全沿用igm抗體的重鏈恒定區(qū)ch1-ch4。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，igm抗體的重鏈恒定區(qū)ch1實際上對于igm抗體的表達純化、空間結(jié)構(gòu)以及對抗原的親和力等方面至關(guān)重要，本發(fā)明提供的igm抗體不僅保留了重鏈恒定區(qū)ch1部分，而且將其創(chuàng)造性地替換為igg抗體的重鏈恒定區(qū)ch1（例如如seq?id?no：13所示的氨基酸序列）。結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的igm抗體可以經(jīng)protein?g一步法純化即可達到95%以上的純度（在實際操作中該純度往往需要兩步以上的純化方法才能實現(xiàn)），可以直接用于后續(xù)的化學發(fā)光檢測。

85、此外，經(jīng)實驗驗證，與現(xiàn)有方法制備得到的igm抗體相比（例如cn118772272a），本發(fā)明提供的igm抗體在保證igg抗體原有的穩(wěn)定性、特異性和親和力的前提下，對檢測柯薩奇病毒的靈敏度相較于igg抗體可以提升4-5倍，與生物素偶聯(lián)的igm抗體對檢測柯薩奇病毒的靈敏度相較于igg抗體可以提升16-20倍，即靈敏度和準確性高且非特異性吸附和檢測限低，避免了假陽和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，適用于對柯薩奇病毒的低豐度檢測。