本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種糖苷酶輔助的dna中微量修飾堿基的單堿基分辨率測序方法。

背景技術：

1、dna中除a、g、c、t四種堿基外，還包含大量含有共價修飾的非常規(guī)核苷酸，即修飾核苷酸。修飾核苷酸的存在增加了dna對遺傳信息的編碼能力。dna修飾核酸中存在多種含量較低的微量修飾，包括尿嘧啶（uracil，u）、ap位點（apyrimidinic/apurinic?sites，ap）、8-氧鳥嘌呤（8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine，8og）和次黃嘌呤等。這些微量修飾可以由核酸的自發(fā)水解，細胞氧化應激和環(huán)境污染物暴露等因素產生，亦可以通過細胞內的脫氨反應、堿基切除反應及核苷酸的錯誤摻入等酶催化產生。研究表明，微量修飾會增加dna斷裂產生的風險，對基因組的穩(wěn)定性有重大威脅，例如ap位點和尿嘧啶等微量修飾的修復過程中會產生dna斷裂，阻礙dna復制酶的進行，影響基因組的穩(wěn)定性和完整性。研究還發(fā)現，微量修飾積極參與多種生物過程，包括乳腺癌、肺癌、巨幼細胞貧血的發(fā)生與發(fā)展等，微量修飾的異常變化是多種疾病發(fā)生的重要誘因。

2、為了深入研究微量修飾在多種生物過程中的作用機制，需要對基因上微量修飾進行高效且精確的單堿基分辨率測序。目前針對微量修飾的全基因組測序方法已經開發(fā)了很多，例如染色質免疫沉淀或者化學標記的方法將含有微量修飾的dna富集出來并結合二代測序技術（next-generation?sequence，ngs）來實現基因組dna中微量修飾的定位分析。但是，抗體富集或者化學分子富集的方法存在諸多缺陷，包括定量能力差、分辨率低、靈敏度低、特異性不足且定位分析僅局限于特定的修飾等。目前還報道了一些糖苷酶輔助的斷點測序方法，例如檢測尿嘧修飾的ucaps-seq、檢測8og的claps-seq等。這些方法雖然都實現單堿基分辨率測序微量修飾，但是均存在一定的缺陷和不足。由于微量修飾在dna中含量較低，這些方法仍需要通過抗體富集等手段將含有微量修飾的dna富集出來，但是對于不同微量修飾的的富集方式差異巨大，需要針對單一修飾開發(fā)針對性的富集策略，開發(fā)難度較大。因此，需要開發(fā)一種操作簡單、準確性高、普適性高的微量修飾富集后測序分析方法。

3、由于糖苷酶udgx-h109s能夠特異性識別并切割尿嘧啶，糖苷酶pab-agog能夠特異性識別并切割8og，內切酶ape1能夠特異性識別并切割ap位點，并且，切割后均能形成單鏈斷裂，且斷點位置5’末端為磷酸根。基于此特性，本技術提供一種糖苷酶輔助的dna中微量修飾堿基的單堿基分辨率測序方法。

技術實現思路

1、針對以上現有技術的不足，本發(fā)明提供一種達到單堿基分辨率、靈敏度高、高特異性、操作簡單的基于糖苷酶輔助的dna中位點特異性微量修飾堿基的測序方法。

2、本發(fā)明的原理見圖1，在此方法中，首先通過片段化的dna進行末端修復和接頭連接，使dna雙鏈的兩端均連接接頭1，且連接后的產物末端只含有羥基；利用糖苷酶或ape1酶特異性切割dna上的微量修飾（糖苷酶特異性切割尿嘧啶或8og；ape1酶特異性切割內源性ap位點），形成一個5’-po4和3’-oh末端的單堿基間隙，而不含有微量修飾的dna不會被切割；然后，以接頭1為模板進行延伸，含微量修飾的dna延伸得到終止于微量修飾前一位且斷點5’端為磷酸根的截短dna，而不包含微量修飾的dna延伸得到5’端為羥基的全長dna；在dna連接酶的作用下，僅微量修飾所在dna的延伸產物可以與末端為羥基的第二種接頭p5的3’端羥基連接；使用與p5接頭相對應的引物進行pcr擴增，此時僅微量修飾所在dna的延伸產物可以被擴增，即實現了特異性擴增含微量修飾dna的目標，且擴增產物中與p5連接的位置即為修飾核苷的前一位；最終通過測序技術（例如：ngs）實現單堿基分辨率測序微量修飾。只要修飾位點在生物酶的處理下形成5’磷酸末端的單鏈斷裂，利用本發(fā)明的方法便可實現微量修飾dna的富集，本方法普適性高、推廣性高，有潛力成為測序微量修飾的有力工具。

3、單堿基分辨率測序微量修飾的原理如下：羥基末端接頭p5（接頭p5的3’和5’末端為羥基）和dna的連接位置為微量修飾的前一位。在處理實際樣品時，首先將dna進行片段化，經末端修復和接頭連接處理之后，使基因組dna的末端都為游離的羥基，然后對照組使用dna聚合酶延伸微量修飾未被切割的dna樣品，由于對照組無法與接頭p5連接，此時對照組中無pcr產物生成，無法展示原始dna序列（如需對本發(fā)明方法進行驗證，可使用5’末端為磷酸根的接頭p5-1連接對照組dna，通過pcr擴增和測序即可獲得特定位點dna的序列）；實驗組使用dna聚合酶延伸微量修飾被切割后的dna樣品，并連接羥基末端的接頭p5（dna樣品5’端與接頭p5的3’端連接），通過pcr和測序獲得微量修飾的位點信息?；诖?，實驗過程中將樣品均等分為兩份，一份對微量修飾進行切割處理（利用糖苷酶特異性切割尿嘧啶或8og，或者利用ape1酶特異性切割內源性ap位點），另一份不進行切割處理，再同時利用dna聚合酶延伸，將延伸產物通過pcr擴增和測序獲得對應dna序列，羥基末端的接頭p5和基因組dna連接序列的差異確定微量修飾的位置。

4、為實現上述目的，本發(fā)明的具體技術方案如下：

5、第一方面，本發(fā)明提供一種糖苷酶輔助的dna中微量修飾堿基的單堿基分辨率測序方法，包含如下步驟：

6、（1）將dna進行片段化處理，然后進行末端修復和接頭1（adaptor?1）連接，使dna末端為游離的羥基；

7、（2）將經步驟（1）處理的dna樣品均等分為兩份，將至少一份dna樣品用糖苷酶和/或ape1酶進行處理；

8、（3）在兩份dna樣品中分別加入相同的dna探針，用dna聚合酶進行延伸反應；所使用的dna探針一部分與接頭1完全互補配對，另一部分與接頭1不配對，用于后續(xù)的pcr擴增；

9、（4）回收延伸產物，并連接3’和5’末端為羥基的接頭p5，并根據pcr擴增和測序定位分析微量修飾。含微量修飾的dna延伸得到終止于微量修飾前一位且5’端為磷酸根的截短dna，而不包含微量修飾的dna延伸得到5’端為羥基的全長dna；在dna連接酶的作用下，僅微量修飾所在dna的延伸產物可以與末端為羥基的接頭p5連接；使用與p5接頭相對應的引物進行pcr擴增，此時僅微量修飾所在dna的延伸產物可以被擴增，即實現了特異性擴增含微量修飾dna的目標，且擴增產物中與p5連接的位置即為修飾核苷前一位的位置；最終通過測序實現單堿基分辨率測序微量修飾。

10、進一步地，步驟（2）中對所述dna樣品進行處理，根據所要測序的微量修飾堿基選擇相應的處理方法；當所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，步驟（2）具體如下：將經步驟（1）處理的dna樣品均等分為兩份，一份不用糖苷酶處理（添加對應的蛋白緩沖液，不加蛋白），另一份用糖苷酶處理，兩份dna樣品再使用ape1酶處理；當所要測序的微量修飾為ap位點（內源性ap位點）時，步驟（2）具體如下：將經步驟（1）處理的dna樣品均等分為兩份，一份不用ape1酶處理（添加對應的蛋白緩沖液，不加蛋白），另一份用ape1酶處理。

11、當所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，步驟（2）中，若都不加入糖苷酶，dna中微量修飾未被切割，則含微量修飾和不含微量修飾的dna都延伸產生5’端末端為羥基的全長dna，此時無連接產物和pcr產物生成；若添加有活性的糖苷酶，dna上的微量修飾被切割，形成5’末端為磷酸根的單堿基缺口，則含有微量修飾的dna延伸產生終止于微量修飾前一位且5’端為磷酸根的截短dna，不含微量修飾的dna未被切割且延伸產生5’端末端為羥基的全長dna，此時只有截短dna可以連接末端為羥基的接頭，所以pcr產物中只包括來自含微量修飾的截短dna，且與接頭p5連接的位置即為微量修飾的位置。后續(xù)通過特定位點微量修飾的位點信息：接頭p5和dna連接位置為微量修飾前一位。當所要測序的微量修飾為ap位點時，步驟（2）中，采用ape1酶對其中一份dna樣品進行處理的原理同上。

12、更進一步的，當所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，采用所述糖苷酶處理dna樣品的條件為糖苷酶對應的適宜條件；當所要測序的微量修飾為尿嘧啶時，條件如下：將udgx-h109s糖苷酶在udgx-h109s緩沖液（50?mm?tris-hcl?ph?8.0，1?mm?na2edta，1?mmdtt，25?μg/ml?bsa）中與dna樣品在37?℃反應0.3-12?h；當所要測序的微量修飾為8og時，條件如下：將pab-agog糖苷酶在糖苷酶緩沖液（20?mm?tris-hcl,?5?mm?dtt,?8%glycerol,?ph?8.0）中與dna樣品在37?℃反應5?min-12?h。

13、更進一步地，當所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，經糖苷酶處理之后，采用所述ape1酶處理dna樣品的的條件為：向反應體系中加入ape1酶和ape1?buffer，于37?℃反應1-16?h。

14、更進一步地，當所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，采用所述糖苷酶，以及經糖苷酶處理之后，采用ape1酶處理dna樣品的具體步驟如下：

15、1）當所要測序的微量修飾為尿嘧啶時，采用如下反應體系（20?μl）：50?mm?tris-hcl?ph?8.0，1?mm?na2edta，1?mm?dtt，25?μg/ml?bsa，8?pmol?udgx-h109s，1-10?μg?dna樣品，加水補至10?μl；將反應體系置于37?℃反應0.3-12?h；當所要測序的微量修飾為8og時，采用如下反應體系（20?μl）：20?mm?tris-hcl,?5?mm?dtt,?8%?glycerol,?ph?8.0，0.2?μmpab-agog，1-10?μgdna樣品，加水補至20?μl；將反應體系置于37?℃反應5?min-12?h。

16、2）步驟1）反應結束后，添加1?μl?10?u/μl?ape1酶，2?μl?10?×?ape1?buffer，將反應體系置于37?℃反應1-16?h。

17、更進一步地，當所要測序的微量修飾為ap位點時，采用所述ape1酶處理dna樣品的條件為：將ape1酶在ape1酶緩沖液（50?mm?potassium?acetate，20?mm?tris-acetate，10mm?magnesium?acetate，1?mm?dtt，ph?7.9）中與dna樣品在37?℃反應1-12?h。

18、更進一步地，當所要測序的微量修飾為ap位點時，采用所述ape1酶處理dna樣品的反應體系如下（20?μl）：50?mm?potassium?acetate，20?mm?tris-acetate，10?mmmagnesium?acetate，1?mm?dtt，ph?7.9，1?u?ape1，1-10?μgdna樣品，加水補至20?μl；反應體系置于37?℃反應1-12?h。

19、進一步的，步驟（3）中所述的dna聚合酶為taq?dna聚合酶。

20、第二方面，本發(fā)明提供一種定位檢測dna中微量修飾的試劑盒，包含糖苷酶、ape1酶、dna聚合酶。

21、進一步地，所述試劑盒還包含相應蛋白或酶的反應緩沖液。

22、第三方面，本發(fā)明提供糖苷酶或ape1酶在定位檢測dna中微量修飾的應用。

23、第四方面，本發(fā)明提供糖苷酶或ape1酶在制備定位檢測dna中微量修飾的試劑盒中的應用。

24、與現有技術相比，本發(fā)明的有益之處在于：

25、（1）簡便易行：本發(fā)明提供的方法設計簡潔，易于理解和執(zhí)行，整個實驗流程成本低廉，對儀器要求低，極大地便于在各種實驗室環(huán)境中推廣應用。

26、（2）精準定位：本發(fā)明提供的方法能夠精確測序dna中的微量修飾，為研究提供了可靠的數據支持。

27、（3）快速評估：本發(fā)明提供的方法無需復雜的優(yōu)化步驟，通過qpcr擴增，即可快速定位基因組上不同位點的微量修飾，提高了研究效率。

28、（4）疾病研究工具：本發(fā)明提供的方法可用于分析生物樣品中關鍵微量修飾位點的變化，為深入探究微量修飾在多種疾病中的作用提供了強有力的工具，具有重要的科學和臨床價值。

29、（5）本發(fā)明提供的方法靈敏度高，特異性好，操作簡單，效率高，不僅可以用于豐度低的生物樣品中微量修飾的單堿基分辨率測序，同時為微量修飾在生物體中的功能研究提供了新方法。