本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種基于synnotch的工程化巨噬細(xì)胞及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、巨噬細(xì)胞是一類分布于全身的單核白細(xì)胞，其參與機體的眾多生命過程。巨噬細(xì)胞對多種疾病組織具有趨向性，參與疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。腫瘤內(nèi)通常含有大量的巨噬細(xì)胞，比如在乳腺癌中巨噬細(xì)胞的質(zhì)量占比可以達到70%。大多數(shù)的觀點認(rèn)為腫瘤部位的大部分巨噬細(xì)胞來源于骨髓外周血單核細(xì)胞，其在腫瘤相關(guān)的間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的趨化因子和細(xì)胞因子的作用下被招募到腫瘤部位并且被改造為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。除了原發(fā)瘤，巨噬細(xì)胞也是最早被招募到轉(zhuǎn)移小生境的免疫細(xì)胞之一，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和定植提供有利條件。

2、合成notch（synnotch）受體由天然的notch蛋白改造而來。研究者們不僅對notch蛋白的胞外部分進行改造使其能夠識別特定的抗原，還對notch蛋白的胞內(nèi)部分進行了改造，使得synnotch在識別特定抗原后的下游反應(yīng)也能被人為控制。synnotch受體通常包含三個部分：胞外抗原識別域，負(fù)責(zé)對抗原進行識別；跨膜的notch核心，其在胞外部分識別抗原后會被細(xì)胞膜上的γ-分泌酶切割并將synnotch的胞內(nèi)部分釋放到胞質(zhì)；胞內(nèi)的人造轉(zhuǎn)錄因子，在notch核心被切割后會進入細(xì)胞核從而觸發(fā)特定基因的表達。因此，工程化synnotch的細(xì)胞不僅可以令其識別特定腫瘤細(xì)胞，也能令其在識別特定腫瘤細(xì)胞后作出個性化的響應(yīng)。然而，目前synnotch受體主要應(yīng)用在t細(xì)胞等不易腫瘤浸潤的細(xì)胞中，這限制了synnotch受體在腫瘤中發(fā)揮作用。

3、免疫檢查點阻斷療法，如抗程序性死亡受體1抗體，已在某些癌癥類型的治療中取得了臨床成功。然而，由于缺乏預(yù)先存在的抗腫瘤免疫，免疫檢查點阻斷療法在免疫學(xué)上“冷”的腫瘤中效果不佳。這一局限性促使人們研發(fā)了與炎癥細(xì)胞因子聯(lián)合使用的療法。其中白細(xì)胞介素-12（il-12）可促進t輔助細(xì)胞1型（th1）細(xì)胞的極化和干擾素-γ（ifn-γ）的分泌，從而在先天免疫和適應(yīng)性免疫之間架起橋梁。盡管在臨床前研究中取得了令人鼓舞的結(jié)果，但il-12的系統(tǒng)給藥在臨床試驗中效果并不理想，原因是藥物在腫瘤內(nèi)的積聚有限，并且會刺激健康組織中的淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生不良反應(yīng)。

4、臨床上使用的免疫檢查點阻斷劑主要是以抗體的形式存在。然而，抗體由于其過大的分子量和復(fù)雜的翻譯后修飾，難以通過重組載體簡單表達，也不易與其他蛋白組成融合蛋白。而納米抗體通常只有15kda的大小，且很容易通過重組載體表達出來，也易于與其他蛋白組成融合蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明人經(jīng)長期的技術(shù)與實踐探索，提供了一種基于synnotch工程化巨噬細(xì)胞的療法。本發(fā)明的synnotch工程化巨噬細(xì)胞能夠識別特定的腫瘤抗原，然后分泌il-12與抗pd-l1納米抗體（pd-l1?nb）的融合蛋白。這一療法不僅適用于原發(fā)瘤，還適用于轉(zhuǎn)移瘤的治療，在引起強烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)的同時并不會產(chǎn)生明顯的毒副作用。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種synnotch受體，其包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中，所述胞外結(jié)構(gòu)域包含靶向腫瘤特異性抗原的單鏈可變片段。

4、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述腫瘤特異性抗原選自黑色素瘤特異性抗原酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（trp1）、cd19、cd20、cd133、her2、egfr、間皮素、il13ra2、c-met和epha2中的一種或多種。

5、優(yōu)選地，所述腫瘤特異性抗原是黑色素瘤特異性抗原酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（trp1）。

6、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述單鏈可變片段是ta99單鏈抗體（ta99?scfv）。

7、優(yōu)選地，所述ta99單鏈抗體的氨基酸序列包含如seq?id?no:?1所示的氨基酸序列，或者，所述ta99單鏈抗體的氨基酸序列如seq?id?no:?1所示。

8、seq?id?no:?1：

9、mdfqvqifsfllisasvimsrqfqvkleesgaelvrpgalvklscktsgfnikdyflhwvrqrpdqglewigwinpdngntvydpklqgtasltadtssntvylqlsgltsedtavyfctrrdytyekaaldywgqgasvivssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkrsggggsggggsggggsgarhcahtdsksmsmsvgervtltckasenvvtyvswyqqkpeqspklliygasnrytgvpdrftgsgsatdftltissvqaedladyhcgqgysypytfgggtkleikradaaptyphhhhhhhlqisstvaaarv

10、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述胞外結(jié)構(gòu)域還包含膜靶向信號肽和肽標(biāo)簽。

11、優(yōu)選地，所述膜靶向信號肽選自cd8α信號肽、免疫球蛋白重鏈信號肽、免疫球蛋白輕鏈信號肽和gm-csf信號肽中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述膜靶向信號肽是cd8α信號肽。

12、進一步優(yōu)選地，所述cd8α信號肽的氨基酸序列如seq?id?no:?2所示。

13、seq?id?no:?2：malpvtalllplalllhaarp

14、優(yōu)選地，所述肽標(biāo)簽選自myc-標(biāo)簽、6×his-標(biāo)簽和flag-標(biāo)簽中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述肽標(biāo)簽是myc-標(biāo)簽。

15、進一步優(yōu)選地，所述myc-標(biāo)簽的氨基酸序列如seq?id?no:?3所示。

16、seq?id?no:?3：eqkliseedl

17、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，所述胞外結(jié)構(gòu)域包含依次可操作地連接的cd8α信號肽、myc-tag和ta99?scfv。

18、更優(yōu)選地，所述胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seq?id?no:?4所示。

19、seq?id?no:?4：

20、malpvtalllplalllhaarpeqkliseedlmdfqvqifsfllisasvimsrqfqvkleesgaelvrpgalvklscktsgfnikdyflhwvrqrpdqglewigwinpdngntvydpklqgtasltadtssntvylqlsgltsedtavyfctrrdytyekaaldywgqgasvivssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkrsggggsggggsggggsgarhcahtdsksmsmsvgervtltckasenvvtyvswyqqkpeqspklliygasnrytgvpdrftgsgsatdftltissvqaedladyhcgqgysypytfgggtkleikradaaptyphhhhhhhlqisstvaaarv

21、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述跨膜結(jié)構(gòu)域包含notch核心。所述notch核心的n端與所述胞外結(jié)構(gòu)域的c端相連，所述notch核心的c端與所述胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的n端相連。

22、優(yōu)選地，所述notch核心的氨基酸序列包含如seq?id?no:?5所示的氨基酸序列，或者，所述notch核心的氨基酸序列如seq?id?no:?5所示。

23、seq?id?no:?5：

24、pcvgsnpcynqgtceptsenpfyrclcpakfngllchildysftggagrdipppqieeacelpecqvdagnkvcnlqcnnhacgwdggdcslnfndpwknctqslqcwkyfsdghcdsqcnsagclfdgfdcqltegqcnplydqyckdhfsdghcdqgcnsaecewdgldcaehvperlaagtlvlvvllppdqlrnnsfhflrelshvlhtnvvfkrdaqgqqmifpyygheeelrkhpikrstvgwatssllpgtsggrqrreldpmdirgsivyleidnrqcvqsssqcfqsatdvaaflgalaslgslnipykieavksepvepplpsqlhlmyvaaaafvllffvgcgvllsrkrrr

25、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含轉(zhuǎn)錄因子。

26、優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄因子選自gal4-vp64、gal4-p65-gr、gal4-vpr和gal4-minivpr中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄因子是gal4-vp64。

27、進一步優(yōu)選地，所述gal4-vp64的氨基酸序列包含如seq?id?no:?6所示的氨基酸序列，或者，所述gal4-vp64的氨基酸序列如seq?id?no:?6所示。

28、seq?id?no:?6：

29、mkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvsaaaggsggsggsdalddfdldmlgsdalddfdldmlgsdalddfdldmlgsdalddfdldmlgs

30、第二方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其編碼根據(jù)本發(fā)明所述的synnotch受體。

31、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，編碼所述胞外結(jié)構(gòu)域的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:?7所示。

32、seq?id?no:?7：

33、atggccctgcctgttaccgccctgttgctccctcttgccctgctgcttcacgccgctcgccctgagcagaaacttatatcagaggaagatctgatggatttccaggtgcagatcttctccttcctgctgatctccgccagcgtgatcatgagcaggcagttccaggtgaagctggaggagagcggcgccgagctggtgagacccggagctctggtgaagctgtcctgcaagacaagcggcttcaacatcaaggattacttcctgcactgggtgaggcagagacccgaccagggcctggagtggatcggctggatcaaccctgataacggcaacacagtgtacgatcccaagctgcagggcaccgccagcctgaccgccgatacctccagcaacaccgtgtacctgcagctgagcggcctgaccagcgaggataccgccgtgtacttctgcaccaggagggactacacatacgagaaggccgccctggattactggggccagggcgcttctgtgatcgtgtcctccgccaagaccaccgccccttccgtgtaccctctggcccctgtgtgtggcgatacaacaggcagctccgtgaccctgggctgcctggtgaagagatccggcggcggcggcagcggaggaggaggaagcggaggaggcggctccggagctaggcactgcgctcacaccgattccaagagcatgtccatgtccgtcggtgagagagtgacactgacctgcaaggccagcgagaacgtggtgacatacgtgtcctggtaccagcagaagcctgagcagagccccaagctgctgatctacggcgccagcaacaggtacacaggcgtgcctgacaggttcaccggcagcggctccgccaccgatttcacactgacaatctccagcgtgcaggccgaggacctggccgattaccactgcggccagggctacagctacccctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagagagccgatgccgcccccacataccctcaccaccaccaccatcaccacctgcagatctcctccacagtggccgccgccagggtg

34、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，編碼所述跨膜結(jié)構(gòu)域的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:?8所示。

35、seq?id?no:?8：

36、ccatgtgtgggcagcaacccttgttacaaccagggcacatgtgagcctaccagcgagaaccctttctacagatgcctgtgtcctgccaagttcaacggcctgctgtgccacatcctggactacagcttcacaggtggcgctgggcgcgacattcccccaccgcagattgaggaggcctgtgagctgcctgagtgccaggtggatgcaggcaataaggtctgcaacctgcagtgtaataatcacgcatgtggctgggatggtggcgactgctccctcaacttcaatgacccctggaagaactgcacgcagtctctacagtgctggaagtattttagcgacggccactgtgacagccagtgcaactcggccggctgcctctttgatggcttcgactgccagctcaccgagggacagtgcaaccccctgtatgaccagtactgcaaggaccacttcagtgatggccactgcgaccagggctgtaacagtgccgaatgtgagtgggatggcctagactgtgctgagcatgtacccgagcggctggcagccggcaccctggtgctggtggtgctgcttccacccgaccagctacggaacaactccttccactttctgcgggagctcagccacgtgctgcacaccaacgtggtcttcaagcgtgatgcgcaaggccagcagatgatcttcccgtactatggccacgaggaagagctgcgcaagcacccaatcaagcgctctacagtgggttgggccacctcttcactgcttcctggtaccagtggtgggcgccagcgcagggagctggaccccatggacatccgtggctccattgtctacctggagatcgacaaccggcaatgtgtgcagtcatcctcgcagtgcttccagagtgccaccgatgtggctgccttcctaggtgctcttgcgtcacttggcagcctcaatattccttacaagattgaggccgtgaagagtgagccggtggagcctccgctgccctcgcagctgcacctcatgtacgtggcagcggccgccttcgtgctcctgttctttgtgggctgtggggtgctgctgtcccgcaagcgccggcgg

37、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，編碼所述胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:?9所示。

38、seq?id?no:?9：

39、atgaagctgctgagcagcatcgagcaggcctgtgacatctgccggctgaagaaactgaagtgcagcaaagaaaagcccaagtgcgccaagtgcctgaagaacaactgggagtgccggtacagccccaagaccaagagaagccccctgaccagagcccacctgaccgaggtggaaagccggctggaaagactggaacagctgtttctgctgatcttcccacgcgaggacctggacatgatcctgaagatggacagcctgcaggacatcaaggccctgctgaccggcctgttcgtgcaggacaacgtgaacaaggacgccgtgaccgacagactggccagcgtggaaaccgacatgcccctgaccctgcggcagcacagaatcagcgccaccagcagcagcgaggaaagcagcaacaagggccagcggcagctgacagtgtctgctgctgcaggcggaagcggaggctctggcggatctgatgccctggacgacttcgacctggatatgctgggcagcgacgccctggatgattttgatctggacatgctgggatctgacgctctggacgatttcgatctcgacatgttgggatcagatgcactggatgactttgacctggacatgctcggatca

40、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，編碼根據(jù)本發(fā)明所述的synnotch受體的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:?10所示。

41、seq?id?no:?10：

42、atggccctgcctgttaccgccctgttgctccctcttgccctgctgcttcacgccgctcgccctgagcagaaacttatatcagaggaagatctgatggatttccaggtgcagatcttctccttcctgctgatctccgccagcgtgatcatgagcaggcagttccaggtgaagctggaggagagcggcgccgagctggtgagacccggagctctggtgaagctgtcctgcaagacaagcggcttcaacatcaaggattacttcctgcactgggtgaggcagagacccgaccagggcctggagtggatcggctggatcaaccctgataacggcaacacagtgtacgatcccaagctgcagggcaccgccagcctgaccgccgatacctccagcaacaccgtgtacctgcagctgagcggcctgaccagcgaggataccgccgtgtacttctgcaccaggagggactacacatacgagaaggccgccctggattactggggccagggcgcttctgtgatcgtgtcctccgccaagaccaccgccccttccgtgtaccctctggcccctgtgtgtggcgatacaacaggcagctccgtgaccctgggctgcctggtgaagagatccggcggcggcggcagcggaggaggaggaagcggaggaggcggctccggagctaggcactgcgctcacaccgattccaagagcatgtccatgtccgtcggtgagagagtgacactgacctgcaaggccagcgagaacgtggtgacatacgtgtcctggtaccagcagaagcctgagcagagccccaagctgctgatctacggcgccagcaacaggtacacaggcgtgcctgacaggttcaccggcagcggctccgccaccgatttcacactgacaatctccagcgtgcaggccgaggacctggccgattaccactgcggccagggctacagctacccctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagagagccgatgccgcccccacataccctcaccaccaccaccatcaccacctgcagatctcctccacagtggccgccgccagggtgccatgtgtgggcagcaacccttgttacaaccagggcacatgtgagcctaccagcgagaaccctttctacagatgcctgtgtcctgccaagttcaacggcctgctgtgccacatcctggactacagcttcacaggtggcgctgggcgcgacattcccccaccgcagattgaggaggcctgtgagctgcctgagtgccaggtggatgcaggcaataaggtctgcaacctgcagtgtaataatcacgcatgtggctgggatggtggcgactgctccctcaacttcaatgacccctggaagaactgcacgcagtctctacagtgctggaagtattttagcgacggccactgtgacagccagtgcaactcggccggctgcctctttgatggcttcgactgccagctcaccgagggacagtgcaaccccctgtatgaccagtactgcaaggaccacttcagtgatggccactgcgaccagggctgtaacagtgccgaatgtgagtgggatggcctagactgtgctgagcatgtacccgagcggctggcagccggcaccctggtgctggtggtgctgcttccacccgaccagctacggaacaactccttccactttctgcgggagctcagccacgtgctgcacaccaacgtggtcttcaagcgtgatgcgcaaggccagcagatgatcttcccgtactatggccacgaggaagagctgcgcaagcacccaatcaagcgctctacagtgggttgggccacctcttcactgcttcctggtaccagtggtgggcgccagcgcagggagctggaccccatggacatccgtggctccattgtctacctggagatcgacaaccggcaatgtgtgcagtcatcctcgcagtgcttccagagtgccaccgatgtggctgccttcctaggtgctcttgcgtcacttggcagcctcaatattccttacaagattgaggccgtgaagagtgagccggtggagcctccgctgccctcgcagctgcacctcatgtacgtggcagcggccgccttcgtgctcctgttctttgtgggctgtggggtgctgctgtcccgcaagcgccggcggatgaagctgctgagcagcatcgagcaggcctgtgacatctgccggctgaagaaactgaagtgcagcaaagaaaagcccaagtgcgccaagtgcctgaagaacaactgggagtgccggtacagccccaagaccaagagaagccccctgaccagagcccacctgaccgaggtggaaagccggctggaaagactggaacagctgtttctgctgatcttcccacgcgaggacctggacatgatcctgaagatggacagcctgcaggacatcaaggccctgctgaccggcctgttcgtgcaggacaacgtgaacaaggacgccgtgaccgacagactggccagcgtggaaaccgacatgcccctgaccctgcggcagcacagaatcagcgccaccagcagcagcgaggaaagcagcaacaagggccagcggcagctgacagtgtctgctgctgcaggcggaagcggaggctctggcggatctgatgccctggacgacttcgacctggatatgctgggcagcgacgccctggatgattttgatctggacatgctgggatctgacgctctggacgatttcgatctcgacatgttgggatcagatgcactggatgactttgacctggacatgctcggatca

43、第三方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，其包含根據(jù)本發(fā)明所述的核酸分子。

44、本發(fā)明的重組載體可以采用本領(lǐng)域已知的表達載體，通過攜帶根據(jù)本發(fā)明所述的核酸分子而獲得。本領(lǐng)域已知的表達載體例如是真核表達載體、原核表達載體、病毒或噬菌體等，優(yōu)選是質(zhì)粒表達載體。

45、第四方面，本發(fā)明提供了一種工程化巨噬細(xì)胞，其包含第一核酸分子或第一重組載體，其中，所述第一核酸分子是根據(jù)本發(fā)明所述的編碼synnotch受體的核酸分子，所述第一重組載體是包含根據(jù)本發(fā)明所述的編碼synnotch受體的核酸分子的重組載體。

46、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述工程化巨噬細(xì)胞源自raw264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞、thp-1細(xì)胞、j774a.1細(xì)胞、小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞。優(yōu)選地，所述工程化巨噬細(xì)胞源自raw264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞。

47、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述工程化巨噬細(xì)胞還包含第二核酸分子或第二重組載體，其中，所述第二核酸分子包含編碼細(xì)胞因子與抗pd-l1納米抗體的融合蛋白的核酸分子；所述第二重組載體包含所述第二核酸分子。

48、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述細(xì)胞因子選自il-12、il-2、tnf-α和inf-γ中的一種或多種。

49、優(yōu)選地，所述細(xì)胞因子是il-12，即所述第二核酸分子包含編碼il-12（白細(xì)胞介素-12）與抗pd-l1納米抗體的融合蛋白（il-12-pd-l1?nb融合蛋白）的核酸分子。

50、更優(yōu)選地，所述il-12包含il-12p40和il-12p35以及連接二者的第一連接肽。

51、進一步優(yōu)選地，所述il-12p40的氨基酸序列如seq?id?no:?11所示，編碼所述il-12p40的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:?12所示。

52、seq?id?no:?11：

53、mcpqkltiswfaivllvsplmamwelekdvyvvevdwtpdapgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshshlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfnikssssspdsravtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnkyenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqrkkekmketeegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacvpcrvrs

54、seq?id?no:?12：

55、atgtgtcctcagaagctaaccatctcctggtttgccatcgttttgctggtgtctccactcatggccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttctagatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaaaatttcaaaaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatcc

56、優(yōu)選地，所述il-12p35的氨基酸序列如seq?id?no:?13所示，編碼所述il-12p35的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:?14所示。

57、seq?id?no:?13：

58、mvsvptaspsasssssqcrssmcqsryllflatlallnhlslarvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssa

59、seq?id?no:?14：

60、atggtcagcgttccaacagcctcaccctcggcatccagcagctcctctcagtgccggtccagcatgtgtcaatcacgctacctcctctttttggccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctagacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgcc

61、在本發(fā)明中，所述第一連接肽可以采用本領(lǐng)域常用的柔性接頭。優(yōu)選地，所述第一連接肽的氨基酸序列如seq?id?no:?15所示，編碼所述第一連接肽的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:?16所示。

62、seq?id?no:?15：ggggsggggsggglasggs

63、seq?id?no:?16：

64、ggcggcggcgggagtggcggcgggggttctggcggaggcctcgctagcggtggctcc

65、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，所述il-12的氨基酸序列如seq?id?no:?17所示，編碼所述il-12的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:?18所示。

66、seq?id?no:?17：

67、mcpqkltiswfaivllvsplmamwelekdvyvvevdwtpdapgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshshlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfnikssssspdsravtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnkyenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqrkkekmketeegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacvpcrvrsggggsggggsggglasggsmvsvptaspsasssssqcrssmcqsryllflatlallnhlslarvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssa

68、seq?id?no:?18：

69、atgtgtcctcagaagctaaccatctcctggtttgccatcgttttgctggtgtctccactcatggccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttctagatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaaaatttcaaaaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatccggcggcggcgggagtggcggcgggggttctggcggaggcctcgctagcggtggctccatggtcagcgttccaacagcctcaccctcggcatccagcagctcctctcagtgccggtccagcatgtgtcaatcacgctacctcctctttttggccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctagacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgcctga

70、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述抗pd-l1納米抗體（pd-l1?nb）的氨基酸序列包含如seq?id?no:?19所示的氨基酸序列，或者，所述抗pd-l1納米抗體的氨基酸序列如seqid?no:?19所示。編碼所述抗pd-l1納米抗體的核酸分子的核苷酸序列包含如seq?id?no:20所示的核苷酸序列，或者，編碼所述抗pd-l1納米抗體的核酸分子的核苷酸序列如seq?idno:?20所示的核苷酸序列。

71、seq?id?no:?19：

72、maqvqlvetggglvqpggslrlsctasgftfsmhamtwyrqapgkqrelvavitshgdranytdsvrgrftisrdntknmvylqmnslkpedtavyycnvprydswgqgtqvtvssgglpetgghhhhhh

73、seq?id?no:?20：

74、atggcccaggtgcagctggtggagaccggcggaggcctggtgcagccaggaggaagcctgaggctgagctgcacagcctccggcttcaccttcagcatgcacgccatgacctggtacagacaggcccccggcaagcagagggagctggtggctgtgatcacctcccacggcgacagagccaactacaccgatagcgtgagaggcaggttcaccatctccagggacaacacaaagaacatggtgtacctgcagatgaactccctgaagcccgaggataccgccgtgtactactgcaacgtgcccaggtacgacagctggggccagggcacccaggtgacagtgtcctccggcggcctgcccgagacaggaggacaccaccaccaccatcac

75、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述抗pd-l1納米抗體通過第二連接肽與所述il-12的il-12p35結(jié)構(gòu)域相連。

76、在本發(fā)明中，所述第二連接肽可以采用本領(lǐng)域常用的柔性接頭。優(yōu)選地，所述第二連接肽的氨基酸序列由n個如seq?id?no:?21所示的氨基酸序列（ggggs）組成，其中，n是1至5的整數(shù)。更優(yōu)選地，所述第二連接肽的氨基酸序列如seq?id?no:?22所示，編碼所述第二連接肽的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:23所示。

77、seq?id?no:?22：ggggsggggsggggs

78、seq?id?no:?23：ggaggaggaggctccggaggaggcggatctggcggaggaggctct

79、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，所述編碼il-12-pd-l1?nb融合蛋白的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:?24所示。

80、seq?id?no:?24：

81、atgtgtcctcagaagctaaccatctcctggtttgccatcgttttgctggtgtctccactcatggccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttctagatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaaaatttcaaaaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatccggcggcggcgggagtggcggcgggggttctggcggaggcctcgctagcggtggctccatggtcagcgttccaacagcctcaccctcggcatccagcagctcctctcagtgccggtccagcatgtgtcaatcacgctacctcctctttttggccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctagacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgccggaggaggaggctccggaggaggcggatctggcggaggaggctctatggcccaggtgcagctggtggagaccggcggaggcctggtgcagccaggaggaagcctgaggctgagctgcacagcctccggcttcaccttcagcatgcacgccatgacctggtacagacaggcccccggcaagcagagggagctggtggctgtgatcacctcccacggcgacagagccaactacaccgatagcgtgagaggcaggttcaccatctccagggacaacacaaagaacatggtgtacctgcagatgaactccctgaagcccgaggataccgccgtgtactactgcaacgtgcccaggtacgacagctggggccagggcacccaggtgacagtgtcctccggcggcctgcccgagacaggaggacaccaccaccaccatcac

82、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述第二核酸分子在所述編碼il-12-pd-l1?nb融合蛋白的核酸分子的5’端還包含上游激活序列（uas）和啟動子。所述第二核酸分子在所述編碼il-12-pd-l1?nb融合蛋白的核酸分子的3’端還包含polya序列。

83、優(yōu)選地，所述上游激活序列的核苷酸序列包含如seq?id?no:?25所示的核苷酸序列，或者所述上游激活序列的核苷酸序列如seq?id?no:?25所示。

84、seq?id?no:?25：

85、ggagcactgtcctccgaacgtcggagcactgtcctccgaacgtcggagcactgtcctccgaacgtcggagcactgtcctccgaacg

86、優(yōu)選地，所述啟動子是最小cmv啟動（minicmv）。更優(yōu)選地，最小cmv啟動的核苷酸序列如seq?id?no:?26所示。

87、seq?id?no:?26：

88、taggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagc

89、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，所述第二核酸分子從5’端到3’端依次包含上游激活序列（uas）、最小cmv啟動（minicmv）、編碼il-12-pd-l1?nb融合蛋白的核酸分子和polya序列。

90、根據(jù)本發(fā)明的一個最優(yōu)選實施方案，所述第二核酸分子的核苷酸序列如seq?idno:?27所示。

91、seq?id?no:?27：

92、ggagcactgtcctccgaacgtcggagcactgtcctccgaacgtcggagcactgtcctccgaacgtcggagcactgtcctccgaacggagcatgtcctccgaacgtcggagcactgtcctccgaacgactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctctcgacattcgttggatcgccaccatgtgtcctcagaagctaaccatctcctggtttgccatcgttttgctggtgtctccactcatggccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttctagatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaaaatttcaaaaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatccggcggcggcgggagtggcggcgggggttctggcggaggcctcgctagcggtggctccatggtcagcgttccaacagcctcaccctcggcatccagcagctcctctcagtgccggtccagcatgtgtcaatcacgctacctcctctttttggccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctagacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgccggaggaggaggctccggaggaggcggatctggcggaggaggctctatggcccaggtgcagctggtggagaccggcggaggcctggtgcagccaggaggaagcctgaggctgagctgcacagcctccggcttcaccttcagcatgcacgccatgacctggtacagacaggcccccggcaagcagagggagctggtggctgtgatcacctcccacggcgacagagccaactacaccgatagcgtgagaggcaggttcaccatctccagggacaacacaaagaacatggtgtacctgcagatgaactccctgaagcccgaggataccgccgtgtactactgcaacgtgcccaggtacgacagctggggccagggcacccaggtgacagtgtcctccggcggcctgcccgagacaggaggacaccaccaccaccatcactga

93、第五方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和/或治療癌癥的藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明所述的工程化巨噬細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的輔料。

94、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述癌癥選自黑色素瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、腦癌、乳腺癌和卵巢癌中的一種或多種。優(yōu)選地，所述癌癥是黑色素瘤。

95、第六方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明所述的工程化巨噬細(xì)胞在制備用于預(yù)防和/或治療癌癥的藥物中的用途。

96、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述癌癥選自黑色素瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、腦癌、乳腺癌和卵巢癌中的一種或多種。優(yōu)選地，所述癌癥是黑色素瘤。

97、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下有益效果：

98、本發(fā)明提供的工程化巨噬細(xì)胞在保留巨噬細(xì)胞靶向腫瘤的能力的同時，通過synnotch受體能夠特異性地識別trp1陽性細(xì)胞。并且，在synnotch受體的胞外結(jié)構(gòu)域識別對應(yīng)抗原（trp1）后，synnotch受體的跨膜結(jié)構(gòu)域被切割，synnotch受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域脫落并與第二核酸分子的上游激活序列結(jié)合，從而啟動il-12-pd-l1?nb融合蛋白的表達，借此，將il-12-pd-l1?nb融合蛋白特異性地分泌到腫瘤內(nèi)。此外，pd-l1?nb不僅僅作為免疫檢查點阻斷劑，還能夠與腫瘤內(nèi)pd-l1陽性的細(xì)胞結(jié)合，從而避免il-12-pd-l1?nb融合蛋白擴散脫離腫瘤部位。

99、經(jīng)過實驗驗證，本發(fā)明提供的工程化巨噬細(xì)胞的歸巢能力不受影響，對皮下瘤和轉(zhuǎn)移瘤都均有很好的特異性靶向作用。此外，本發(fā)明提供的工程化巨噬細(xì)胞能夠有效抑制皮下瘤和轉(zhuǎn)移瘤的生長并且不會產(chǎn)生明顯的副作用。