本發(fā)明涉及細(xì)胞制備，特別涉及一種豬骨髓細(xì)胞的制備方法和豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

1、通過基因缺失致弱是研制非洲豬瘟病毒(african?swine?fever?virus，asfv)疫苗的研發(fā)方向之一。asfv通過原代細(xì)胞培養(yǎng)后制備的疫苗有效性較高，可能是原代細(xì)胞某些特性，更有利于asfv的復(fù)制。

2、用于培養(yǎng)asfv的原代細(xì)胞包括豬骨髓細(xì)胞(porcine?bone?marrow，pbm)分化而成的巨噬細(xì)胞。

3、目前，制備豬骨髓細(xì)胞的常規(guī)方法為沖洗法，該方法宜用長(zhǎng)約10cm的圓柱形骨組織，適用于制備少量豬骨髓細(xì)胞，適用于實(shí)驗(yàn)室研究。然而，沖洗法存在制備量不穩(wěn)定、制備量較少、操作時(shí)間過長(zhǎng)、且污染難控制等問題，無法大量制備豬骨髓細(xì)胞用于放大生產(chǎn)使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的主要目的是提出一種豬骨髓細(xì)胞的制備方法和豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中豬骨髓細(xì)胞制備污染率較高、細(xì)胞制備量較少且制備效率較低的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種豬骨髓細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

3、s10、獲取豬骨組織，在流動(dòng)的細(xì)胞洗滌液條件下，擠壓所述豬骨組織，使得所述豬骨組織的內(nèi)容物釋放到所述流動(dòng)的細(xì)胞洗滌液中，得到豬骨髓細(xì)胞混合液；

4、s20、將所述豬骨髓細(xì)胞混合液過濾、離心，取沉淀，將所述沉淀重懸，得到重懸液；

5、s30、將所述重懸液與紅細(xì)胞裂解液混合，洗滌，離心，取沉淀進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，得到豬骨髓細(xì)胞。

6、在一實(shí)施方式中，步驟s10中，所述細(xì)胞洗滌液的溫度為2～8℃；和/或，

7、步驟s10中，所述擠壓的方式包括液壓；和/或，

8、步驟s10中，所述擠壓所述豬骨組織的步驟包括：擠壓所述豬骨組織，暫停15～30s，釋放壓力；和/或，

9、步驟s20中，所述過濾的孔徑≤100目；和/或，

10、步驟s30中，所述離心的轉(zhuǎn)速為1000～1500rpm，所述離心的時(shí)間為8～12min。

11、在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞洗滌液包括以下組分：肝素、青霉素、鏈霉素以及磷酸鹽緩沖液。

12、在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞洗滌液中：

13、所述肝素的濃度為80～150iu/ml；和/或，

14、所述青霉素的濃度為100～200u/ml；和/或，

15、所述鏈霉素的濃度0.1～0.2mg/ml；和/或，

16、所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01mol/l，所述磷酸鹽緩沖液的ph為7.2～7.4。

17、在一實(shí)施方式中，步驟s30中：

18、所述紅細(xì)胞裂解液包括以下組分：1.2～1.5mol/l?nh4cl、90～110mmol/l?khco3和8～15mmol/l?na4edta；和/或，

19、所述紅細(xì)胞裂解液的ph為7.2～7.4。

20、在一實(shí)施方式中，步驟s30中，所述細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括以下組分：78～89％rpmi?1640培養(yǎng)基、10～20％胎牛血清、以及1～2％含有青霉素和鏈霉素的溶液。

21、本發(fā)明還提供一種豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)，所述豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)包括：

22、擠壓裝置，所述擠壓裝置包括兩個(gè)擠壓部，所述兩個(gè)擠壓部具有相互靠近或遠(yuǎn)離的活動(dòng)行程；以及，

23、液體輸送裝置，所述液體輸送裝置包括第一儲(chǔ)液部，所述第一儲(chǔ)液部用于存儲(chǔ)細(xì)胞洗滌液，所述第一儲(chǔ)液部與至少一個(gè)擠壓部連通，以將所述第一儲(chǔ)液部中的液體輸送至所述擠壓部。

24、在一實(shí)施方式中，所述液體輸送裝置還包括冷凝裝置，所述冷凝裝置包括第二儲(chǔ)液部和溫度監(jiān)控裝置：

25、所述第一儲(chǔ)液部設(shè)置于所述第二儲(chǔ)液部中，所述第二儲(chǔ)液部用于儲(chǔ)存冰水混合物，以使所述第一儲(chǔ)液部中的液體溫度穩(wěn)定；

26、所述溫度監(jiān)控裝置與冰水混合物接觸，用以檢測(cè)所述冰水混合物的溫度。

27、在一實(shí)施方式中，所述擠壓裝置包括第一擠壓部和第二擠壓部：

28、所述第一擠壓部設(shè)置有凹槽以及與所述凹槽連通的導(dǎo)出管，所述凹槽用以盛放豬骨組織和細(xì)胞洗滌液；

29、所述第二擠壓部設(shè)置有凸起，所述凸起用以與所述凹槽配合擠壓豬骨組織。

30、在一實(shí)施方式中，所述豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)還包括液體收集裝置，所述液體收集裝置包括第三儲(chǔ)液部，所述第三儲(chǔ)液部通過所述導(dǎo)出管與所述凹槽連通，用以收集凹槽中的豬骨髓細(xì)胞混合液。

31、本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟s10中，在流動(dòng)的細(xì)胞洗滌液條件下，也即可以使細(xì)胞洗滌液沿一定方向定向流動(dòng)，將所述豬骨組織被擠壓而釋放出的組織內(nèi)容物及時(shí)沖走，避免豬骨髓細(xì)胞擠出后堆積于豬骨周圍而凝固，也減少了擠壓結(jié)束時(shí)壓力去除過程中被壓碎的豬骨髓組織將擠出的豬骨髓內(nèi)容物回吸的概率，提高了pbm的制備量。具體的，本發(fā)明對(duì)豬骨組織進(jìn)行物理性擠壓破碎，且可不限于豬骨組織形狀，讓其中的組織內(nèi)容物流入細(xì)胞洗滌液中，有效規(guī)避因用注射器反復(fù)注入洗滌液時(shí)可能引起的污染，且操作過程省時(shí)，省力，安全且效率較高。步驟s20中，將豬骨髓細(xì)胞混合液過濾并離心，較好地除去了豬骨髓組織混合液中的碎骨組織、油脂和雜質(zhì)。步驟s30中，將含有豬骨髓細(xì)胞的重懸液與紅細(xì)胞裂解液混合，將重懸液中的紅細(xì)胞去除，得到純化后的豬骨髓細(xì)胞沉淀，將沉淀進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，得到豬骨髓細(xì)胞。本發(fā)明中的制備方法操作方法較簡(jiǎn)單，細(xì)胞污染率較低，細(xì)胞制備量較穩(wěn)定，且細(xì)胞制備量較高，操作時(shí)間較短，制備效率較高。

技術(shù)特征：

1.一種豬骨髓細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的豬骨髓細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟s10中，所述細(xì)胞洗滌液的溫度為2～8℃；和/或，

3.如權(quán)利要求1所述的豬骨髓細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述細(xì)胞洗滌液包括以下組分：肝素、青霉素、鏈霉素以及磷酸鹽緩沖液。

4.如權(quán)利要求3所述的豬骨髓細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述細(xì)胞洗滌液中：

5.如權(quán)利要求1所述的豬骨髓細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟s30中：

6.如權(quán)利要求1所述的豬骨髓細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟s30中，所述細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括以下組分：78～89％rpmi?1640培養(yǎng)基、10～20％胎牛血清、以及1～2％含有青霉素和鏈霉素的溶液。

7.一種豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)，用于從豬骨組織中提取豬骨髓細(xì)胞，其特征在于，所述豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)包括：

8.如權(quán)利要求7所述的豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)，其特征在于，所述液體輸送裝置還包括冷凝裝置，所述冷凝裝置包括第二儲(chǔ)液部和溫度監(jiān)控裝置：

9.如權(quán)利要求7所述的豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)，其特征在于，所述擠壓裝置包括第一擠壓部和第二擠壓部：

10.如權(quán)利要求9所述的豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)，其特征在于，所述豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)還包括液體收集裝置，所述液體收集裝置包括第三儲(chǔ)液部，所述第三儲(chǔ)液部通過所述導(dǎo)出管與所述凹槽連通，用以收集凹槽中的豬骨髓細(xì)胞混合液。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種豬骨髓細(xì)胞的制備方法和豬骨髓細(xì)胞制備系統(tǒng)，涉及細(xì)胞制備技術(shù)領(lǐng)域，所述豬骨髓細(xì)胞的制備方法包括以下步驟：獲取豬骨組織，在流動(dòng)的細(xì)胞洗滌液條件下，擠壓所述豬骨組織，使得所述豬骨組織的內(nèi)容物釋放到所述流動(dòng)的細(xì)胞洗滌液中，得到豬骨髓細(xì)胞混合液；將所述豬骨髓細(xì)胞混合液過濾、離心，取沉淀；將所述沉淀重懸，得到重懸液；將所述重懸液與紅細(xì)胞裂解液混合，洗滌，離心，取沉淀進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，得到豬骨髓細(xì)胞。本發(fā)明中的制備方法操作方法較簡(jiǎn)單，細(xì)胞污染率較低，細(xì)胞制備量較穩(wěn)定，且細(xì)胞制備量較高，操作時(shí)間較短，制備效率較高。

技術(shù)研發(fā)人員：秦濤,張飛雁,秦偉,胡楊,何珊,韓燕,秦紅剛,張棟梁,鄧永歡,侯林靜,柏姣,謝紅玲,周平,張冶中
受保護(hù)的技術(shù)使用者：國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15