本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種可用于多基因便捷整合表達的馬克斯克魯維酵母菌株及其應用。

背景技術：

1、馬克斯克魯維酵母(kluyveromyces?marxianus)作為一種具有工業(yè)應用潛力的非常規(guī)酵母，因其所具備的多種有益特性，已逐漸成為生物學研究與工業(yè)應用的新熱點，在生物技術、食品和環(huán)境等方面開始顯現(xiàn)出巨大的應用前景。k.marxianus酵母具有良好的食品安全性，分別在美國和歐盟通過了gras和qps認證；生長迅速，在30℃的生長速率約為s.cerevisiae酵母的兩倍，是已知的生長最快的真核生物；具有較強的高溫耐受能力：k.marxianus酵母能夠在52℃條件下生長，且最高能在45℃的溫度下進行乙醇的生產與發(fā)酵。高溫下產醇不僅抑制了發(fā)酵過程中可能產生的污染，還能夠在較高溫度下同步糖化和發(fā)酵等工業(yè)步驟，減少發(fā)酵過程中降溫帶來的能量損耗，降低成本，具有重要的工業(yè)生產優(yōu)勢。k.marxianus酵母還具有多種酶的分泌表達能力，包括菊粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等；k.marxianus酵母還能夠將牛奶加工過程中產生的大量乳清作為底物，將其轉化為一種環(huán)境友好溶劑——乙酸乙酯。此外，k.marxianus酵母能夠利用廣泛的碳源，如秸稈等纖維素類物質中的半纖維——木糖作為底物進行發(fā)酵，變廢為寶，具有重要的環(huán)境意義以及工業(yè)化應用前景?？傊?，k.marxianus酵母因其食品安全性，環(huán)境友好性以及一系列優(yōu)良的特性，成為在工業(yè)、食品、飼料以及制藥等行業(yè)中極具潛力的細胞工廠。

2、酵母菌株的選擇以及改良對于工業(yè)應用至關重要，以滿足酵母菌工業(yè)應用復雜、多樣且不斷變化的性能標準。能夠獲得兼具多種優(yōu)勢的酵母是微生物改良的終極目標之一。雜交育種能夠使雜交后代的性狀發(fā)生分離，是一種常用的育種方法。出于對酵母多樣性、馴化以及工業(yè)菌株改良的迫切需求，不同酵母菌株的實驗性雜交正在迅速流行起來，成為一種菌株優(yōu)化以及產品多樣化的策略。然而在微生物中，雜交只能在同種或不同品種的品系內和同屬中較近的種間進行，不能進行較遠距離的雜交，因其雜交兼容性受到生殖屏障的限制。

3、染色體工程，是一種對染色體進行改造、移植，進而實現(xiàn)染色體雜合的菌株改良策略。由于染色體遺傳信息明確，因此能夠清晰地研究雜合子基因功能，有利于分析優(yōu)勢表型基因，常被應用于遺傳形狀的定向改變以及新型菌株的育種等等。此外，研究人員利用染色體工程進行疾病動物模型的研究，揭示基因以及蛋白質劑量改變的分子基礎以及可能引起的表型改變，為疾病基礎研究及治療開啟新道路。染色體工程主要分為目的染色體的改造以及將染色體移植到受體細胞兩部分。對染色體的改造主要目的是使其適應新的細胞環(huán)境，確保其正確的復制與分離。首先，需要測試染色體工作元件的兼容性。若著絲粒(centromere，cen)或者自主復制序列(autonomous?replicating?sequence，ars)之間不兼容，則需要在染色體上額外添加受體細胞的染色體工作元件(2010，nat?protocol)。此外，染色體的構造對于染色體工程也很重要。雖然真核生物的染色體主要以線性方式存在，但大型的環(huán)狀染色體也可以穩(wěn)定存在于酵母當中。

4、在馬克斯克魯維酵母進行多基因表達，一個主要瓶頸是缺乏具有不同行轉錄活性的順式調控元件，特別是啟動子和終止子。先前的研究已鑒定出一系列天然的啟動子，這些啟動子具有不同的轉錄活性，例如tef3(強)、pdc1(強)、gpd1(中等)、inu1(中等)、med4(弱)和srb7(弱)。然而，當將天然啟動子置于異源基因上游時，可能會與天然基因組位點發(fā)生重組，導致遺傳不穩(wěn)定。此外，天然啟動子之間可能會競爭轉錄因子，進而影響天然基因的正常功能。異源啟動子能夠降低重組風險并減少對外源調控因子的競爭。然而，目前已知在馬克斯克魯維酵母中功能正常的異源啟動子寥寥無幾，包括來自釀酒酵母的adh1、adh2、tef1、pgk1、tdh3和gal1等基因的啟動子；畢赤酵母pichia?pastoris的aft1基因啟動子；以及絲狀真菌ashbya?gossypii的tef基因啟動子。此外，這些異源啟動子均為強或中等強度，無法滿足多基因以不同水平表達的需求。

5、終止子作為微調基因表達的另一手段也至關重要。已鑒定出一系列km終止子，但這些終止子可能與天然位點發(fā)生不良重組。只有少數(shù)異源終止子被證明在馬克斯克魯維酵母中具有功能，包括a.gossypii的tef基因終止子、釀酒酵母的adh1基因終止子以及一些短型合成終止子?？捎玫漠愒唇K止子數(shù)量有限，這阻礙了在km中進行多基因工程的能力。

6、有限的插入位點數(shù)量是多基因異源表達的另一個問題。在基因組位點插入異源基因會表現(xiàn)出位置效應，這可能干擾所插入基因的表達以及位點周圍相關基因的表達。質粒提供了基因插入的外源位點，但質粒的傳播穩(wěn)定性較低。馬克斯克魯維酵母人工染色體展現(xiàn)出與天然染色體相媲美的高穩(wěn)定性，并且可以攜帶多個基因而不影響天然基因組。然而，yac本身并不包含啟動子或終止子。因此，在將多個基因插入yac時，如何提供足夠的順式調控元件仍然是一個亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)思路

1、鑒于在馬克斯克魯維酵母中進行多基因表達技術難度高，步驟多且過程復雜這一技術難題，本發(fā)明的目的在于構建一個可裝載大量外源基因的馬克斯克魯維酵母菌株，用于多基因的便捷表達。

2、本發(fā)明提供的用于多基因便捷表達的馬克斯克魯維酵母菌株，由如下步驟構建得到：

3、(1)改造釀酒酵母i號染色體，使其變成環(huán)形染色體；

4、(2)在釀酒酵母環(huán)形i號染色體中導入馬克斯克魯維酵母的自主復制序列和著絲粒，構建得到的釀酒酵母環(huán)形染色體，記為r1；

5、(3)將釀酒酵母環(huán)形i號染色體從釀酒酵母中抽提并純化，通過原生質體轉化方法將其導入到馬克斯克魯維酵母fim-1中，構建含有一條釀酒酵母來源的環(huán)形i號染色體和八條馬克斯克魯維酵母染色體的染色體雜合菌株，記為ks-r1。

6、(4)敲除ks-r1中r1的潮霉素抗性基因hphmx4及卡那霉素抗性基因kanmx6，之后敲除ks-r1中馬克斯克魯維酵母的必需基因kmpop5(genbank登錄號：34716721)、kmprp45(genbank登錄號：34716722)以及kmmak16(genbank登錄號：34716734)，最后敲除ks-r1中r1的基因kmura3，獲得可用于大量外源基因裝載的馬克斯克魯維酵母菌株(染色體雜合菌株)，記為sl-3。

7、步驟(1)中所述釀酒酵母為w303-1a(為已公開釀酒酵母)，購于美國模式菌種收集中心(american?type?culture?collection)，菌株編號為atcc?208352。

8、步驟(3)中所述的馬克斯克魯維酵母fim-1，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心馬克斯克魯維酵母fim1菌株(保藏號：cgmcc?no.10621)

9、進一步地，步驟(1)中所述變成環(huán)形染色體，具體過程如下：分別在釀酒酵母i號染色體兩端的端粒位置設計grna序列，然后利用crispr/cas9技術將i號染色體端粒切除。構建用于同源重組的片段，包含左右臂的同源序列以及kmura3基因。利用crispr/cas9技術將同源片段同時轉化馬克斯克魯維酵母，實現(xiàn)染色體端粒的切除以及連接，同步引入kmura3基因作為篩選標記，實現(xiàn)環(huán)形染色體構建；

10、進一步地，步驟(2)中所述的自主復制序列和著絲粒，其中，酵母自主復制序列為kmars1序列，著絲粒為kmcen?5，kmura3基因，潮霉素抗性基因hphmx4和卡那霉素抗性基因kanmx6。

11、所述kmars1基因，其核苷酸序列為seq?id?no.1所示。

12、所述kmcen5基因，其核苷酸序列為seq?id?no.2所示。

13、所述kmura3基因，其核苷酸序列為seq?id?no.3所示。

14、所述hphmx4基因，其核苷酸序列為seq?id?no.4所示。

15、所述kanmx6基因，其核苷酸序列為seq?id?no.5所示。

16、步驟(2)所述的在釀酒酵母環(huán)形染色體中導入自主復制序列和著絲粒，其步驟如下：利用crispr/cas9技術，在環(huán)形染色體左臂位置天然的自主復制序列旁引入馬克斯克魯維酵母來源的自主復制序列kmars1，以及潮霉素抗性基因hphmx4。在環(huán)形染色體右臂位置i號染色體著絲粒旁引入馬克斯克魯維酵母來源的自主復制序列kmars1和著絲粒kmcen5，以及卡那霉素抗性基因kanmx6。

17、進一步地，步驟(3)中所述釀酒酵母環(huán)形染色體r1的抽提與純化，具體步驟如下：在含山梨醇的緩沖液中，對細胞進行溶壁酶zymolyase和β-巰基乙醇處理，制備原生質體；使用sds破菌，并用酚氯仿異戊醇抽提總基因組；乙酸鈉和異戊醇醇沉總基因組后，用te溶解基因組，rnasea處理去除基因組中的總rna；之后使用atp依賴的核酸外切酶消化所有線性dna，再通過大型環(huán)形染色體抽提試劑盒qiagen?large-construct?kit對環(huán)形染色體進行純化；洗脫下的dna溶液中加入glycoblue和trna促進dna聚集，并加入乙酸鈉和異戊醇沉淀dna，獲得純化的環(huán)形染色體。

18、步驟(3)中所述將釀酒酵母環(huán)形染色體r1移植到馬克斯克魯維酵母中構建染色體雜合菌株ks-r1，具體步驟如下：在含山梨醇的緩沖液中，對fim-1細胞進行溶壁酶zymolyase和β-巰基乙醇處理，制備原生質體。使用含cacl2和山梨醇的緩沖液重懸原生質體，同步加入5-15μl純化得到的環(huán)形染色體r1和takara?carrier?dna，冰上放置10-20分鐘。在懸液中加入含cacl2的15-25％聚乙二醇peg8000，充分混勻后冰上放置10-20min。離心重懸原生質體，將其與融化的細胞壁再生培養(yǎng)基混合，倒到細胞壁再生平板上培養(yǎng)，獲得染色體雜合菌株ks-r1。

19、進一步地，步驟(4)中所述染色體雜合酵母sl-3，是利用crispr/cas9技術，敲除染色體雜合酵母ks-r1環(huán)形染色體r1上的篩選標記kmura3，潮霉素抗性基因hphmx4和卡那霉素抗性基因kanmx6敲除，并刪除馬克斯克魯維酵母的必需基因kmpop5、kmprp45以及kmmak16構建獲得。

20、本發(fā)明提供的馬克斯克魯維酵母染色體雜合菌株，可用多基因的便捷表達。

21、具體地，是將表達的單個或多個基因，通過基因orf置換的方式，逐一替換馬克斯克魯維酵母雜合菌株sl-3染色體r1上的對應基因。

22、進一步地，例如，利用crispr/cas9技術，將綠色熒光蛋白gfp基因，分別置換馬克斯克魯維酵母sl-3菌株r1染色體的pau7、lds1、cys3、erv46、flc2以及ade1基因，分別構建獲得sl-3/pau7δ::gfp、sl-3/lds1δ::gfp、sl-3/cys3δ::gfp、sl-3/erv46δ::gfp、sl-3/flc2δ::gfp、ks-r1/ade1δ::gfp菌株。

23、更進一步地，為證實染色體雜合菌株可用于多位點基因的表達，獲得的sl-3/pau7δ::gfp、sl-3/lds1δ::gfp、sl-3/cys3δ::gfp、sl-3/erv46δ::gfp、sl-3/flc2δ::gfp、sl-3/ade1δ::gfp，在含有0.2μg/ml衣霉素的sc培養(yǎng)基中，30℃、220rpm培養(yǎng)24h，然后通過熒光酶標儀測定菌株的gfp熒光強度，分光光度儀測定菌體密度od600，獲得gfp/od600值分別為88.15、83.99、65.46、62.57、58.30和47.31。

24、本發(fā)明提供的馬克斯克魯維酵母雜合菌株，其中釀酒酵母環(huán)形染色體上的基因全部活躍轉錄，各個表達框的基因均能正常表達，并且該環(huán)形染色體在馬克斯克魯維酵母fim-1穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明提供的馬克斯克魯維酵母重組工程菌株，可作為外源基因的儲存庫，應用于多基因、整條通路及途徑基因的穩(wěn)定裝載與表達。