本發(fā)明涉及催化酶，具體涉及一種催化α-酮酸偶聯(lián)反應的α-羥基-β-酮酸合酶。

背景技術(shù)：

1、α-羥基-β-酮酸合酶是一類焦磷酸硫胺素(thdp)依賴型酶，主要負責催化兩個α-酮酸間的偶聯(lián)反應?，F(xiàn)有研究中，α-羥基-β-酮酸合酶被證實是多種活性天然產(chǎn)物生物合成中碳-碳鍵形成的關(guān)鍵催化劑，例如，在furanolide類化合物藍細菌素(cyanobacterin)的生物合成途徑中，α-羥基-β-酮酸合酶cybe催化了對羥基苯丙酮酸與3-甲基-2-氧代丁酸的偶聯(lián)，形成了呋喃內(nèi)酯核心β-位和γ-位之間的碳-碳鍵(nat.chem.biol.2022,18,652-658)。而在咔唑類生物堿neocarazostatin?a和carquinostatin?a的合成中，nzsh和cqsb3通過催化吲哚-3-丙酮酸與丙酮酸的偶聯(lián)，啟動了咔唑a環(huán)的組裝(j.org.chem.2019,84,1632316328；angew.chem.int.ed.2019,58,13349-13353)。此外，在偽枝藻素(scytonemin)的生物合成中，α-羥基-β-酮酸合酶scya催化了吲哚-3-丙酮酸與對羥基苯丙酮酸的偶聯(lián)反應，為cyclopenta[b]indole骨架的組裝提供了關(guān)鍵前體(j.am.chem.soc.2008,130,15260-15261)，近期，參與酮醇類天然產(chǎn)物(如xenocyloins、sattabacins、sattazolins和clostrocyloin)合成的多個α-羥基-β-酮酸合酶(如xcla、thzk0150、cbei2730和cbeihki805_0381)也被陸續(xù)報道(chembiochem2014,15,369-372；chembiochem?2014,15,527-532；acs?chem.biol.2019,14,1490-1497)。盡管α-羥基-β-酮酸合酶在多種活性天然產(chǎn)物的生物合成中起著關(guān)鍵作用，但目前已知的此類酶存在如下缺點：

2、(一)、底物譜狹窄：目前已知的α-羥基-β-酮酸合酶通常僅能接受少數(shù)或特定的α-酮酸底物，限制了其參與催化合成的天然產(chǎn)物在種類和結(jié)構(gòu)上的多樣性。例如，迄今為止，furanolide類天然產(chǎn)物的報道數(shù)量僅為個位數(shù)(nat.chem.biol.2022,18,652-658；angew.chem.int.ed.2022,61,e202204545)，偽枝藻素類天然產(chǎn)物則更為稀少(proc.natl.acad.sci.,india,sect.b?biol.sci.2020,90,467-481)。

3、(二)、應用開發(fā)不足：雖然目前已有多種酶被成功應用于經(jīng)濟或藥用分子的合成，但α-羥基-β-酮酸合酶作為催化碳-碳鍵形成的有力工具，其潛力尚未得到充分挖掘，尤其在擴展天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性及合成新穎藥物先導化合物方面，仍有待進一步探索和開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的α-酮酸底物譜狹窄的缺陷，從而提供一種催化α-酮酸偶聯(lián)反應的α-羥基-β-酮酸合酶。

2、本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的合成藥結(jié)構(gòu)擴展不足缺陷，從而提供一種催化α-酮酸偶聯(lián)反應的α-羥基-β-酮酸合酶。

3、一方面，本發(fā)明提供一種催化α-酮酸偶聯(lián)反應的α-羥基-β-酮酸合酶，所述α-羥基-β-酮酸合酶的氨基酸序列如seq?id?no:1～seq?id?no:4所示。

4、在其中一些實施例中，所述α-羥基-β-酮酸合酶與氨基酸序列如seq?id?no:1～seq?id?no:4所示的蛋白為同源蛋白，同源性大于等于40％。

5、另一方面，本發(fā)明還提供一種編碼上述的α-羥基-β-酮酸合酶的核酸分子基因，所述基因的序列如seq?id?no:5、seq?id?no:7、seq?id?no:9、seq?id?no:11所示。

6、同時，本發(fā)明還提供一種含有上述的α-羥基-β-酮酸合酶的基因的重組表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟，從菌株基因組dna中擴增得到目的基因，或按照目的基因的序列合成目的基因；將目的基因和質(zhì)粒重組，得到表達載體。

7、在其中一些實施例中，所述擴增目的基因的引物序列如seq?id?no:13～seq?idno:14或seq?id?no:17～seq?id?no:18所示。

8、在其中一些實施例中，質(zhì)粒與目的基因重組前，還包括對質(zhì)粒線性化的步驟，對質(zhì)粒線性化的步驟采用的引物序列如seq?id?no:15～seq?id?no:16或seq?id?no:19～seqid?no:20或seq?id?no:21～seq?id?no:22、seq?id?no:23～seq?id?no:24、seq?id?no:25～seq?id?no:26所示。

9、進一步的，本發(fā)明提供生物材料，包括如下任一項；(1)、編碼上述的α-羥基-β-酮酸合酶的核酸分子或含有權(quán)利要求3所述的α-羥基-β-酮酸合酶的基因的核酸分子；(2)、含有(1)所述的核酸分子的重組表達載體；(3)、含有(1)所述的核酸分子的重組微生物或含有(2)所述的重組表達載體的重組微生物；(4)、含有(1)所述的核酸分子的重組細胞系或含有(2)所述的重組表達載體的重組細胞系。

10、另一方面，本發(fā)明提供一種α-羥基-β-酮酸，所述α-羥基-β-酮酸在α-羥基-β-酮酸合酶催化作用下，將α-酮酸經(jīng)偶聯(lián)形成，所述α-羥基-β-酮酸合酶為上述的α-羥基-β-酮酸合酶、編碼上述的α-羥基-β-酮酸合酶的基因編碼得到的α-羥基-β-酮酸合酶、由上述的α-羥基-β-酮酸合酶的基因的重組表達載體的構(gòu)建方法得到的表達載體形成的α-羥基-β-酮酸合酶、由上述的生物材料包含的α-羥基-β-酮酸合酶中的至少一種。

11、在其中一些實施例中，所述α-酮酸包括脂肪族α-酮酸或芳香族α-酮酸中的至少一種。

12、在其中一些實施例中，所述脂肪族α-酮酸包括丙酮酸、3-甲基-2-氧代丁酸、2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、4-甲基-2-氧代戊酸、2-氧代己酸、2-環(huán)丙基-2-氧代乙酸及2-環(huán)丁基-2-氧代乙酸中的至少一種。

13、在其中一些實施例中，所述芳香族α-酮酸包括吲哚-3-丙酮酸、對羥基苯丙酮酸、苯丙酮酸、對硝基苯丙酮酸、4-羥基-3-甲氧基苯丙酮酸、2-氧代-4-苯基丁酸及3-(萘-1-基)-2-氧代丙酸中的至少一種。

14、在其中一些實施例中，所述α-羥基-β-酮酸具有式(ⅰ)所示的結(jié)構(gòu)，

15、

16、r1、r2獨立地選自-r3或-cr3，

17、r3選自取代或未取代的c6-c20的芳基、c6-c20的雜芳基、氫原子、取代或未取代的c1-c20的烷基、c3-c20的環(huán)烷基中的至少一種；取代的c1-c20的烷基的取代基選自c6-c20的芳基或c6-c20的雜芳基，取代的c6-c20的芳基的取代基選自羥基、c1-c6的烷基、甲氧基或硝基中的至少一種。

18、在其中一些實施例中，r3選自酚基、苯基、硝基苯基、芐基、萘基、吲哚基、3-甲氧基-4-羥基苯基、取代或未取代的c1-c6的烷基和c3-c4的環(huán)烷基；其中，取代的c1-c6的烷基的取代基選自苯基。

19、另一方面，本發(fā)明還提供一種α,β-羥基羧酸類化合物，所述α,β-羥基羧酸類化合物為將上述的α-羥基-β-酮酸還原得到。

20、在其中一些實施例中，所述α,β-羥基羧酸類化合物具有式(ⅱ)所示的結(jié)構(gòu)，

21、

22、r1、r2獨立地選自-r3或-cr3，

23、r3選自取代或未取代的c6-c20的芳基、c6-c60的雜芳基、氫原子、取代或未取代的c1-c20的烷基、c3-c20的環(huán)烷基中的至少一種；取代的c1-c20的烷基的取代基選自c6-c20的芳基或c6-c60的雜芳基，取代的c6-c20的芳基的取代基選自羥基、c1-c6的烷基、甲氧基或硝基中的至少一種。

24、在其中一些實施例中，r3選自酚基、苯基、硝基苯基、芐基、萘基、吲哚基、3-甲氧基-4-羥基苯基、取代或未取代的c1-c6的烷基和c3-c4的環(huán)烷基；其中，取代的c1-c6的烷基的取代基選自苯基。

25、在其中一些實施例中，所述α,β-羥基羧酸類化合物具有式1-1～式1-116所示的結(jié)構(gòu)，

26、

27、

28、

29、

30、

31、

32、

33、在其中一些實施例中，采用還原劑對α-羥基-β-酮酸進行還原，所述還原劑包括nabh4。

34、在其中一些實施例中，所述偶聯(lián)反應的溫度為16-55℃，反應時間為15-180min。

35、在其中一些實施例中，所述第一α酮酸和第二α-酮酸的摩爾比為0.8-1.2：0.8-1.2，優(yōu)選為1:1。

36、在其中一些實施例中，所述還原劑在α-羥基-β-酮酸中間體反應體系中的濃度為大于等于10mm，還原反應的時間大于等于10min。示例性的，還原劑在α-羥基-β-酮酸中間體反應體系中的濃度為10mm、15mm、20mm、30mm、45mm、50mm、100mm或任意兩種數(shù)值組成的區(qū)間；還原反應的時間為10min、15min、22min、25min、30min、50min或任意兩種數(shù)值組成的區(qū)間。

37、在其中一些實施例中，所述具有呋喃內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的化合物為在α-羥基-β-酮酸合酶存在下，以α-酮酸和α,β-不飽和羧酸為底物反應；或，在α-羥基-β-酮酸合酶的存在下，以α-氨基酸、α-酮酸和α,β-不飽和羧酸為底物反應；所述α-羥基-β-酮酸合酶為上述的α-羥基-β-酮酸合酶、編碼上述的α-羥基-β-酮酸合酶的基因編碼得到的α-羥基-β-酮酸合酶、由上述的α-羥基-β-酮酸合酶的基因的重組表達載體的構(gòu)建方法得到的表達載體形成的α-羥基-β-酮酸合酶、由上述的生物材料包含的α-羥基-β-酮酸合酶中的至少一種。

38、在其中一些實施例中，所述具有呋喃內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的化合物結(jié)構(gòu)式如式(ⅲ)所示，

39、

40、r4選自取代或未取代的c6-c30的芳基、c6-c30的雜芳基、氫原子、取代或未取代的c1-c30的烷基，取代的c6-c30的芳基的取代基選自羥基、甲氧基中的至少一種，取代的c1-c30的烷基的取代基選自c6-c30的芳基或c6-c30的雜芳基；

41、r5選自-r7或-cr7，r7選自取代或未取代的c6-c30的芳基、c6-c30的雜芳基、氫原子、取代或未取代的c1-c30的烷基、c3-c30的環(huán)烷基中的至少一種，取代的c6-c30的芳基的取代基選自羥基、甲氧基中的至少一種，取代的c1-c30的烷基的取代基選自c6-c30的芳基，c6-c30的雜芳基；

42、r6選自取代或未取代的c6-c30的芳基，c6-c30的雜芳基，取代的c6-c30的芳基的取代基選自羥基、鹵原子、氰基或c1-c6的烷基中的至少一種。

43、在其中一些實施例中，r4選自取代或未取代的c6-c15的芳基、c6-c15的雜芳基、氫原子、取代或未取代的c1-c15的烷基，取代的c6-c15的芳基的取代基選自羥基、甲氧基中的至少一種，取代的c1-c15的烷基的取代基選自c6-c15的芳基，c6-c15的雜芳基。

44、在其中一些實施例中，r5選自-r7或-cr7，r7選自取代或未取代的c6-c15的芳基、c6-c30的雜芳基、氫原子、取代或未取代的c1-c15的烷基、c3-c15的環(huán)烷基中的至少一種，取代的c6-c15的芳基的取代基選自羥基、甲氧基中的至少一種，取代的c1-c15的烷基的取代基選自c6-c15的芳基或c6-c15的雜芳基。

45、在其中一些實施例中，r6選自取代或未取代的c6-c15的芳基，c6-c15的雜芳基，取代的c6-c15的芳基的取代基選自羥基、鹵原子、氰基或c1-c6的烷基中的至少一種。

46、在其中一些實施例中，r4選自酚基、苯基、鄰苯酚基、3-甲氧基-4-羥基苯基、3,5-二甲氧基-4-羥基苯基、c1-c6的烷基中的至少一種。

47、在其中一些實施例中，所述r5選自酚基、苯基、硝基苯基、芐基、萘基、吲哚基、3-甲氧基-4-羥基苯基、對氰基苯基、苯并噻吩基、取代或位取代的c1-c6的烷基和c3-c4的環(huán)烷基中的至少一種，取代的c1-c6的烷基的取代基選自苯基。

48、在其中一些實施例中，r7選自酚基、苯基、硝基苯基、芐基、萘基、吲哚基、3-甲氧基-4-羥基苯基、對甲基苯基、對氰基苯基、苯并噻吩基、3,5-二氯-4-羥基苯基、3-氯-4-羥基苯基、對氟苯基中的至少一種。

49、在其中一些實施例中，r4選自異丙基、正丁基或乙基中的至少一種。

50、在其中一些實施例中，r5選自正丙基、異丙基、正丁基、甲基、或乙基中的至少一種。

51、在其中一些實施例中，所述具有呋喃內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的化合物具有式2-1～式2-36所示的結(jié)構(gòu)，

52、

53、

54、

55、在其中一些實施例中，以α-酮酸和α,β-不飽和羧酸為底物和/或以α-氨基酸、α-酮酸和α,β-不飽和羧酸為底物時，反應體系還包括，輔酶a、硫胺素焦磷酸、腺嘌呤核苷三磷酸、催化酶、鎂鹽、緩沖液。

56、在其中一些實施例中，所述反應體系中α-羥基-β-酮酸合酶的終濃度為0.01-0.025mm。

57、在其中一些實施例中，催化酶包括4-香豆酸輔酶a連接酶、呋喃內(nèi)酯合酶和轉(zhuǎn)氨酶中的至少一種。

58、在其中一些實施例中，所述鎂鹽包括氯化鎂、硫酸鎂或硝酸鎂中的至少一種。

59、在其中一些實施例中，所述緩沖液包括氯化鈉緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液或磷酸緩沖液中的至少一種。

60、本發(fā)明技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點：

61、本發(fā)明提供的一種催化α-酮酸偶聯(lián)反應的α-羥基-β-酮酸合酶，所述α-羥基-β-酮酸合酶的氨基酸序列如seq?id?no:1～seq?id?no:4所示。本發(fā)明提供的α-羥基-β-酮酸合酶能夠催化多種α-酮酸底物之間的碳-碳進行偶聯(lián)反應，擴展了底物適應性，為多樣化的化學合成途徑提供了更多可能性，顯著提升了其在復雜分子合成中的應用前景，為相關(guān)天然產(chǎn)物和藥物先導化合物的開發(fā)提供了強有力的催化工具。