本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種?；D(zhuǎn)移酶cshct、編碼基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、cyp3a4是一種藥物代謝酶，山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷對(duì)其表現(xiàn)出顯著的抑制作用，而山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷對(duì)其活性的抑制，能夠在研究藥物代謝、藥物相互作用等方面具有重要意義。

2、但現(xiàn)有技術(shù)中，一般還是采取分離純化的方法從樣品中進(jìn)行提取山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷，方法復(fù)雜，流程繁瑣，導(dǎo)致其產(chǎn)量低，對(duì)其研究也較少，難以對(duì)此物質(zhì)的充分研究與利用，同時(shí)由于山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)尚未有較為簡(jiǎn)單地合成山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷的方法。

3、故現(xiàn)急需新的技術(shù)來為體外合成山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷提供新的思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種?；D(zhuǎn)移酶cshct、編碼基因及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷難以體外合成的技術(shù)問題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明具體提供下述技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種酰基轉(zhuǎn)移酶cshct，所述?；D(zhuǎn)移酶cshct的氨基酸序列如seqid?no：1所示。

4、本發(fā)明提供了一種用于表達(dá)?；D(zhuǎn)移酶cshct的編碼基因。

5、本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增?；D(zhuǎn)移酶cshct的編碼基因引物對(duì)，所述引物對(duì)的核苷酸序列的上游引物如seq?id?no：2所示；

6、所述引物對(duì)的核苷酸序列的下游引物如seq?id?no：3所示。

7、本發(fā)明提供了一種?；D(zhuǎn)移酶cshct的應(yīng)用，通過所述?；D(zhuǎn)移酶cshct催化山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷的體外合成。

8、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，利用所述?；D(zhuǎn)移酶cshct催化香豆酰基輔酶a與山奈酚-3-o-葡萄糖苷體外合成制備山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷。

9、本發(fā)明提供了一種體外合成山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷的方法，包括以下步驟：

10、以對(duì)香豆酰基輔酶a為?；w，以山奈酚-3-o-葡萄糖苷為酰基受體，以酰基轉(zhuǎn)移酶cshct為催化酶，進(jìn)行酶催化反應(yīng)，得到山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷；

11、所述?；D(zhuǎn)移酶cshct的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

12、本發(fā)明提供了一種酰基轉(zhuǎn)移酶cshct的編碼基因的應(yīng)用，通過所述?；D(zhuǎn)移酶cshct的編碼基因的原核表達(dá)實(shí)現(xiàn)山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷的體外合成。

13、本發(fā)明提供了一種體外合成制備?；D(zhuǎn)移酶cshct的方法，包括如下步驟：

14、以測(cè)序正確的測(cè)序的cshct-peasy-blunt-zero載體為模板克隆，將回收產(chǎn)物連接至經(jīng)限制性內(nèi)切酶ndei與bamhi雙酶切過的pmal-c5x載體上，熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α，獲得cshct-pmal重組質(zhì)粒；

15、利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將cshct-pmal重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)中，使用超聲破碎儀將菌體進(jìn)行破碎。破碎時(shí)間10min，功率30w，超聲2s，停歇5s，破碎完成后用低溫冷凍離心機(jī)5000r/min，4℃，離心15min，收集上層清液，純化后獲得?；D(zhuǎn)移酶cshct。

16、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有如下有益效果：

17、本發(fā)明提供了一種?；D(zhuǎn)移酶cshct，此酰基轉(zhuǎn)移酶具有催化黃酮醇糖苷的功能，其氨基酸序列為seq?id?no：1所示，能夠通過體外酶法高效合成山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷；

18、本發(fā)明基于?；D(zhuǎn)移酶cshct，建立了山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷體外酶活反應(yīng)體系，在體外條件下能以對(duì)香豆?；o酶a為?；w，催化山奈酚-3-o-葡萄糖苷合成山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷，產(chǎn)物可通過高效液相色譜(hplc)檢測(cè)及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)鑒定，為未來通過體外酶法高效合成山奈酚-3-o-(6’-香豆酰基)-葡萄糖苷提供了思路；

19、本發(fā)明提供了編碼?；D(zhuǎn)移酶cshct的基因，通過原核表達(dá)的方式進(jìn)行表達(dá)并純化得到cshct重組蛋白，從而進(jìn)一步公開了此編碼基因在體外合成山奈酚-3-o-(6’-香豆?；?-葡萄糖苷中的應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.一種?；D(zhuǎn)移酶cshct，其特征在于，所述酰基轉(zhuǎn)移酶cshct的氨基酸序列如seq?idno：1所示。

2.一種如權(quán)利要求1所述的?；D(zhuǎn)移酶cshct的應(yīng)用，其特征在于，通過所述?；D(zhuǎn)移酶cshct催化山奈酚-3-o-(6’-香豆酰基)-葡萄糖苷的體外合成。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酰基轉(zhuǎn)移酶cshct的應(yīng)用，其特征在于，利用所述?；D(zhuǎn)移酶cshct催化香豆?；o酶a與山奈酚-3-o-葡萄糖苷體外合成制備山奈酚-3-o-(6’-香豆酰基)-葡萄糖苷。

4.一種體外合成山奈酚-3-o-(6’-香豆酰基)-葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.一種用于表達(dá)所述權(quán)利要求1所述?；D(zhuǎn)移酶cshct的編碼基因。

6.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求2所述的?；D(zhuǎn)移酶cshct的編碼基因引物對(duì)，其特征在于，

7.一種如權(quán)利要求5所述酰基轉(zhuǎn)移酶cshct的編碼基因的應(yīng)用，其特征在于，通過所述?；D(zhuǎn)移酶cshct的編碼基因的原核表達(dá)實(shí)現(xiàn)山奈酚-3-o-(6’-香豆酰基)-葡萄糖苷的體外合成。

8.一種體外合成制備酰基轉(zhuǎn)移酶cshct的方法，根據(jù)權(quán)利要求7所述，其特征在于，包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，公開了一種?；D(zhuǎn)移酶CsHCT，所述?；D(zhuǎn)移酶CsHCT的氨基酸序列如SEQ?ID?No：1所示；還包括所述酰基轉(zhuǎn)移酶CsHCT的編碼基因；以及?；D(zhuǎn)移酶CsHCT及其編碼基因在體外合成山奈酚?3?O?(6’?香豆?；??葡萄糖苷上的應(yīng)用。發(fā)明實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)山奈酚?3?O?(6’?香豆?；??葡萄糖苷的體外酶催化合成，同時(shí)公開了一種基因編輯手段，從而獲得能夠催化合成山奈酚?3?O?(6’?香豆?；??葡萄糖苷的酶，在?；侥畏?3?O?葡萄糖苷的生物合成領(lǐng)域展現(xiàn)出一定的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：張梁,柳旭陽
受保護(hù)的技術(shù)使用者：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/22