本發(fā)明涉及基因工程，特別涉及一種角蛋白酶突變體、其編碼基因和表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、角蛋白（keratin）是一種不溶性蛋白質(zhì)，普遍存在于動(dòng)物羽毛、毛發(fā)、羊毛、指甲、犄角、蹄和鱗片等硬質(zhì)結(jié)構(gòu)中，該類(lèi)結(jié)構(gòu)粗蛋白含量超過(guò)80%，氨基酸總量也高于70%，且必需氨基酸含量極高，是一種潛在的天然優(yōu)質(zhì)蛋白源。然而，由于角蛋白穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其難以被降解，阻礙了這些角蛋白廢棄物的資源化利用。例如羽毛，羽毛是一類(lèi)富含角蛋白的家禽加工副產(chǎn)物，除一些水禽羽毛用于羽絨制品和裝飾品等高附加值產(chǎn)品外，大量的羽毛未得到合理利用而被直接丟棄或作為垃圾填埋、焚燒處理，造成生態(tài)環(huán)境的污染與蛋白資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

2、當(dāng)前，已有研究將廢棄羽毛降解或部分降解為含有疏松角蛋白、氨基酸和肽段的混合物，作為飼料蛋白源和土壤改良劑，促進(jìn)動(dòng)植物生長(zhǎng)。此外，羽毛角蛋白中還含有豐富的谷氨酸、天冬氨酸等鮮味氨基酸，可以用來(lái)制作新型食品添加劑應(yīng)用到食品加工業(yè)中。角蛋白水解制得的氨基酸及其衍生物還可以應(yīng)用于醫(yī)藥、紡織、皮革加工、復(fù)合材料等行業(yè)。因此研究角蛋白資源的轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)廢棄資源的高值循環(huán)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，并受到越來(lái)越多的關(guān)注。

3、傳統(tǒng)分解羽毛的方法主要依靠物理化學(xué)方法，高溫高壓、酸堿處理等，但其具有耗能高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失嚴(yán)重等問(wèn)題。相比之下，酶法降解角蛋白以其低成本、溫和的處理?xiàng)l件和能夠有效保留羽毛中的蛋白質(zhì)氨基酸資源以及生產(chǎn)過(guò)程綠色環(huán)保，成為更具潛力的解決方案。角蛋白酶（keratinase）是一種可特異降解角蛋白的蛋白酶，可由細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌等多種微生物產(chǎn)生，具有廣泛的底物特異性，能在特定ph值和溫度下有效水解包括羽毛、羊毛、角質(zhì)、人發(fā)和指甲等來(lái)源的角蛋白及其相關(guān)蛋白質(zhì)，產(chǎn)生高價(jià)值的活性多肽和游離氨基酸，而且不會(huì)破壞氨基酸的天然結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是角蛋白廢棄物轉(zhuǎn)化的理想催化劑。

4、角蛋白酶產(chǎn)生菌來(lái)源與分布十分廣泛，然而野生型產(chǎn)角蛋白酶菌株的酶產(chǎn)量較低，存在角蛋白酶催化效率不高、對(duì)角蛋白水解耗時(shí)較長(zhǎng)等問(wèn)題，大大制約了角蛋白酶的開(kāi)發(fā)和運(yùn)用。因此，提高角蛋白酶的活性，助力羽毛等角蛋白廢棄物的高值化應(yīng)用，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景和深遠(yuǎn)的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的角蛋白酶酶活不高等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新型的角蛋白酶突變體及含有編碼該角蛋白酶突變體基因的核酸分子和表達(dá)載體及重組菌株，進(jìn)一步提供了該角蛋白酶突變體在處理含角蛋白物質(zhì)中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明具體通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一方面提供了一種角蛋白酶突變體，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4、本發(fā)明的第二方面提供了一種核酸分子，所述核酸分子包括編碼如上所述的角蛋白酶突變體的基因序列。

5、進(jìn)一步地，所述角蛋白酶突變體的基因序列如seq?id?no.3所示。

6、進(jìn)一步地，所述核酸分子還包括編碼信號(hào)肽、啟動(dòng)子和/或終止子的基因序列，所述角蛋白酶突變體位于所述信號(hào)肽的下游，所述啟動(dòng)子位于所述信號(hào)肽的上游，所述終止子位于所述角蛋白酶突變體的下游。

7、進(jìn)一步地，所述信號(hào)肽為vsi信號(hào)肽，其基因序列如seq?id?no.4所示，所述啟動(dòng)子為kasop*啟動(dòng)子，其基因序列如seq?id?no.5所示，所述終止子為t1終止子，其基因序列如seq?id?no.6所示。

8、本發(fā)明的第三方面提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括如上所述的核酸分子。

9、進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為鏈霉菌整合型載體pset152。

10、本發(fā)明第四方面提供了一種重組菌株，所述重組菌株包括如上所述的表達(dá)載體。

11、進(jìn)一步地，所述重組菌株為變鉛青鏈霉菌tk24。

12、本發(fā)明第五方面提供了如上所述的角蛋白酶突變體在處理含角蛋白物質(zhì)中的應(yīng)用。

13、進(jìn)一步的，所述含角蛋白物質(zhì)選自羽毛、毛發(fā)或羊毛，更進(jìn)一步地，選自禽類(lèi)羽毛。

14、進(jìn)一步地，所述角蛋白酶突變體處理含角蛋白物質(zhì)的方法包括：將角蛋白酶突變體或其粗酶液與含角蛋白物質(zhì)混合，加入還原劑，在50-60℃進(jìn)行催化反應(yīng)。

15、進(jìn)一步地，所述角蛋白酶突變體的粗酶液制備方法包括：培養(yǎng)如上所述的重組菌株，將發(fā)酵培養(yǎng)液離心，取上清液過(guò)濾，收集濾液，獲得含所述角蛋白酶突變體的粗酶液。

16、進(jìn)一步地，所述還原劑為二硫蘇糖醇。

17、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：

18、本發(fā)明提供的角蛋白酶突變體能夠有效降解角蛋白底物，對(duì)角蛋白具有良好的催化降解活性，相比于野生型蛋白的酶活力大大提高。而且，該角蛋白酶突變體能夠以羽毛等角蛋白廢棄物為直接底物，在還原劑二硫蘇糖醇（dtt）的配合下，在24h內(nèi)基本能夠分解整支羽毛，顯著提高對(duì)羽毛等含角蛋白廢棄物的降解效率，顯著降低角蛋白酶的生產(chǎn)成本和角蛋白廢棄物的降解成本，在促進(jìn)羽毛廢棄物的降解和角蛋白資源的轉(zhuǎn)化、回收、利用等方面有著廣泛的市場(chǎng)前景和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種角蛋白酶突變體，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

2.一種核酸分子，其特征在于，包括編碼如權(quán)利要求1所述的角蛋白酶突變體的基因序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述角蛋白酶突變體的基因序列如seq?id?no.3所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子還包括編碼信號(hào)肽、啟動(dòng)子和/或終止子的基因序列，所述角蛋白酶突變體位于所述信號(hào)肽的下游，所述啟動(dòng)子位于所述信號(hào)肽的上游，所述終止子位于所述角蛋白酶突變體的下游。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述信號(hào)肽為vsi信號(hào)肽，所述vsi信號(hào)肽的基因序列如seq?id?no.4所示，所述啟動(dòng)子為kasop*啟動(dòng)子，所述kasop*啟動(dòng)子的基因序列如seq?id?no.5所示，所述終止子為t1終止子，所述t1終止子的基因序列如seq?idno.6所示。

6.一種表達(dá)載體或重組菌株，其特征在于，所述重組菌株包含所述表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的核酸分子。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體或重組菌株，其特征在于，所述表達(dá)載體為鏈霉菌整合型載體pset152，所述重組菌株為變鉛青鏈霉菌tk24。

8.如權(quán)利要求1所述的角蛋白酶突變體在處理含角蛋白物質(zhì)中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的角蛋白酶突變體在處理含角蛋白物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于，所述含角蛋白物質(zhì)選自羽毛、毛發(fā)或羊毛。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的角蛋白酶突變體在處理含角蛋白物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于，所述角蛋白酶突變體處理含角蛋白物質(zhì)的方法包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種角蛋白酶突變體、其編碼基因和表達(dá)載體及其應(yīng)用。所述角蛋白酶突變體氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明提供的角蛋白酶突變體能夠有效降解角蛋白底物，對(duì)角蛋白具有良好的催化降解活性，相比于野生型蛋白的酶活力大大提高。而且，該角蛋白酶突變體能夠以羽毛等角蛋白廢棄物為直接底物，在還原劑DTT的配合下，在24h內(nèi)基本能夠分解整支羽毛，顯著提高對(duì)羽毛等含角蛋白廢棄物的降解效率，顯著降低角蛋白酶的生產(chǎn)成本和角蛋白廢棄物的降解成本，在促進(jìn)羽毛廢棄物的降解和角蛋白資源的轉(zhuǎn)化、回收、利用等方面有著廣泛的市場(chǎng)前景和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：鮑鍇,周亞偉,吳若昆,吳澤輝,方昕
受保護(hù)的技術(shù)使用者：湖北大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/22