本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種酶活性提高的蘇氨酸醛縮酶突變體構(gòu)建及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、過去十余年，生物催化在天然藥物和精細(xì)化學(xué)品工業(yè)合成領(lǐng)域嶄露頭角，成為極具潛力的前沿技術(shù)。相比傳統(tǒng)方法，它憑借高度精準(zhǔn)的立體選擇性，能精準(zhǔn)調(diào)控產(chǎn)物立體構(gòu)型，契合復(fù)雜化合物對(duì)構(gòu)型的嚴(yán)格要求，且操作簡便，大幅降低工藝復(fù)雜度與成本，是傳統(tǒng)手段極具競爭力的替代方案。c-c?鍵的構(gòu)建在化學(xué)品合成體系里始終占據(jù)著基石性地位，除了化學(xué)合成路徑外，學(xué)界已成功發(fā)掘出諸多能夠特異性催化?c-c?鍵生成的生物酶類，諸如醛縮酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶以及醇腈裂解酶等。其中，醛縮酶憑借其寬泛的底物適應(yīng)性和卓越的立體選擇性，在酶促?c-c?鍵合成領(lǐng)域備受矚目。醛縮酶能夠催化可逆縮合反應(yīng)，促使親核供體（如酮、烯醇類化合物及其類似物）與親電受體（醛或酮）發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而構(gòu)建形成c-c?鍵。值得注意的是，醛縮酶對(duì)底物供體呈現(xiàn)出嚴(yán)格的結(jié)構(gòu)特異性，而對(duì)底物受體則具有多樣性，能夠適配多種不同結(jié)構(gòu)的醛或酮類底物，這一特性賦予了醛縮酶在催化合成中極大的靈活性，可用于合成結(jié)構(gòu)豐富多樣的產(chǎn)物。

2、蘇氨酸醛縮酶（threonine?aldolase,?tas，ec?4.1.2.5）是一類依賴磷酸吡哆醛（pyridoxal?5′-phosphate,?plp）作為輔因子的酶類，能以甘氨酸為供體底物，催化一系列可逆的醇醛縮合反應(yīng)。在正向反應(yīng)中，tas可催化l-蘇氨酸裂解為乙醛和甘氨酸；而在逆反應(yīng)方向，tas能夠可以甘氨酸為供體，以脂肪族醛或芳香族醛為受體，發(fā)生醇醛縮合反應(yīng)催化合成β-羥基-a-氨基酸。根據(jù)其對(duì)蘇氨酸α-碳手性中心的立體特異性，tas可分為l-ta和d-ta兩大類。其中，l-ta可進(jìn)一步劃分為三類：（i）特異性識(shí)別l-蘇氨酸的l-ta；（ii）特異性識(shí)別l-別蘇氨酸（l-allo-threonine）的l-allo-ta；（iii）能同時(shí)識(shí)別l-蘇氨酸和l-別蘇氨酸的低特異性l-ta。盡管這三類酶在一級(jí)結(jié)構(gòu)上高度保守，但在底物識(shí)別和催化特性方面存在顯著差異。

3、蘇氨酸醛縮酶能夠特異性形成?c-c?鍵，在有機(jī)化學(xué)合成中有著重要的應(yīng)用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化工等領(lǐng)域，用來催化合成藥物中間體和精細(xì)化學(xué)品的關(guān)鍵前體物質(zhì)。近年來，隨著合成生物學(xué)與代謝工程的發(fā)展，tas在氨基酸尤其是l-絲氨酸的工業(yè)化合成中顯示出重要應(yīng)用潛力。在微生物細(xì)胞工廠中，通過引入或改造tas，可實(shí)現(xiàn)甘氨酸和醛類中間體向l-絲氨酸的高效合成，繞開傳統(tǒng)合成路徑中對(duì)能量和中間代謝物的依賴，從而提升產(chǎn)率并降低副產(chǎn)物的積累。此外，tas的立體選擇性和底物適應(yīng)性也為高值非天然氨基酸的定向合成提供了有力工具。因此，tas正成為構(gòu)建高效生物合成通路、拓展氨基酸類產(chǎn)品結(jié)構(gòu)多樣性的重要酶工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述需求，本發(fā)明的首要目的在于提供一種蘇氨酸醛縮酶突變體，以使得其催化活性和熱穩(wěn)定性得到提升，有利于催化生產(chǎn)l-絲氨酸及其衍生物等代謝產(chǎn)物。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)思路實(shí)現(xiàn)：根據(jù)氣單胞菌 aeromonas?sp.?cu5的野生型蘇氨酸醛縮酶編碼基因序列，經(jīng)過蘇州金唯智公司密碼子優(yōu)化后，采用全基因合成技術(shù)獲得，并將其克隆至pet21b表達(dá)載體 ndei/ xhoi位點(diǎn),獲得相應(yīng)重組質(zhì)粒，命名為pet21b-asta?[基因序列如seq?id?no.2所示]。利用易錯(cuò)pcr隨機(jī)突變方法，獲得氣單胞菌蘇氨酸醛縮酶編碼基因asta突變文庫，利用經(jīng)典酶切連接構(gòu)建策略將其亞克隆至pet21b表達(dá)載體 ndei/ xhoi位點(diǎn)，獲得含有氣單胞菌蘇氨酸醛縮酶突變體編碼基因的重組質(zhì)粒文庫。隨后將重組質(zhì)粒文庫導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)中，通過96孔板初篩和搖瓶復(fù)篩，最終篩選獲得酶活性和熱穩(wěn)定性提高的突變體，由此完成本發(fā)明。

3、本發(fā)明提供一種來源于氣單胞菌 aeromonas?sp.?cu5的蘇氨酸醛縮酶突變體，相對(duì)于seq?id?no.1所示野生型氨基酸序列而言，僅第141位由蘇氨酸t(yī)突變?yōu)楸彼醓，或者僅存在141位由蘇氨酸t(yī)突變?yōu)楸彼醓和第119位由異亮氨酸i突變?yōu)槔i氨酸v的組合突變。

4、本發(fā)明進(jìn)一步提供所述氣單胞菌蘇氨酸醛縮酶突變體的編碼基因。優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述氣單胞菌蘇氨酸醛縮酶突變體編碼基因的核苷酸序列是在seq?id?no.2所示核苷酸酸序列的基礎(chǔ)進(jìn)行突變獲得的。

5、本發(fā)明還提供含有所述的編碼基因的表達(dá)載體。具體地，其是原核表達(dá)載體。

6、優(yōu)選地，其是大腸桿菌表達(dá)載體pet21b和谷氨酸棒桿菌表達(dá)載體pxmj19。

7、本發(fā)明含有如所述的表達(dá)載體的重組菌。

8、具體地，其是重組大腸桿菌工程菌或重組谷氨酸棒桿菌工程菌。

9、本發(fā)明還提供所述的蘇氨酸醛縮酶突變體，或其編碼基因，或含有所述的表達(dá)載體，或所述的重組菌在催化合成l-絲氨酸或其衍生物中的應(yīng)用。

10、具體地，以甲醛和甘氨酸為底物，催化生成l-絲氨酸。

11、本發(fā)明提供的蘇氨酸醛縮酶突變體在催化合成l-絲氨酸及衍生物中的應(yīng)用具有明顯優(yōu)勢(shì)。在已報(bào)道的l-絲氨酸合成路徑中，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serinehydroxymethyltransferase，shmt）是關(guān)鍵催化酶之一，但是該酶依賴plp作為輔因子，并需四氫葉酸參與，作用機(jī)制復(fù)雜，且在實(shí)際生產(chǎn)中增加了反應(yīng)體系的復(fù)雜性及分離純化成本。

12、本發(fā)明有益效果在于，通過對(duì)氣單胞菌來源蘇氨酸醛縮酶進(jìn)行突變和篩選，獲得了催化性能不同程度提升的蘇氨酸醛縮酶突變體，該酶能夠有效催化甲醛和甘氨酸生成l-絲氨酸，且不需要添加四氫葉酸，具有原子經(jīng)濟(jì)性高、催化過程簡單、反應(yīng)條件溫和、無反應(yīng)副產(chǎn)物等優(yōu)勢(shì)，在l-絲氨酸及衍生物的合成中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種來源于氣單胞菌的蘇氨酸醛縮酶突變體，其特征在于，相對(duì)于seq?id?no.1所示野生型氨基酸序列而言，僅存在第141位由蘇氨酸t(yī)突變?yōu)楸彼醓，或者僅存在141位由蘇氨酸t(yī)突變?yōu)楸彼醓和第119位由異亮氨酸i突變?yōu)槔i氨酸v的組合突變。

2.如權(quán)利要求1所述的蘇氨酸醛縮酶突變體的編碼基因。

3.如權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于，其核苷酸序列是在seq?id?no.2所示核苷酸酸序列的基礎(chǔ)進(jìn)行突變獲得的。

4.含有如權(quán)利要求2所述的編碼基因的表達(dá)載體。

5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，其是原核表達(dá)載體。

6.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，其是大腸桿菌表達(dá)載體pet21b和谷氨酸棒桿菌表達(dá)載體pxmj19。

7.含有如權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體的重組菌。

8.如權(quán)利要求7所述的重組菌，其特征在于，其是重組大腸桿菌工程菌或重組谷氨酸棒桿菌工程菌。

9.如權(quán)利要求1所述的蘇氨酸醛縮酶突變體，如權(quán)利要求2或3所述的編碼基因，或含有如權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，或如權(quán)利要求7或8所述的重組菌在催化合成l-絲氨酸或其衍生物中的應(yīng)用。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，以甲醛和甘氨酸為底物，催化生成l-絲氨酸。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體公開一種酶活性提高的蘇氨酸醛縮酶突變體及在生產(chǎn)L?絲氨酸中應(yīng)用。所述突變體的氨基酸序列相較于氣單胞菌來源的野生型蘇氨酸醛縮酶，存在T140A或T140A/I118V的突變。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)純化的酶活性測(cè)定分析，所述突變體的酶活性比野生型分別提高了1.6和2.9倍，熱穩(wěn)定性顯著提升。本發(fā)明提供的有益突變體可以為工業(yè)化生產(chǎn)L?絲氨酸及下游L?半胱氨酸等衍生產(chǎn)物奠定良好的基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：劉君,魏亮,馬振平,黃新燕,徐寧
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/22