用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器的制造方法
【專利說明】用于培養(yǎng)晡乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器
[0001] 本申請是2010年2月9日提交的發(fā)明名稱為"用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng) 器"的第201080007208. 6號中國專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物反應(yīng)器以及使用這些生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的方 法。
【背景技術(shù)】
[0003] 在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝中重要的是維持溶解氧、培養(yǎng)pH、溫度和剪切敏感性方 面的物理化學(xué)環(huán)境。營養(yǎng)環(huán)境的維持也是重要的。培養(yǎng)條件的維持限制了進(jìn)行大規(guī)模哺乳 動物細(xì)胞培養(yǎng)的可能性。特別是濃度梯度能夠抑制在大規(guī)模生物反應(yīng)器中哺乳動物細(xì)胞的 細(xì)胞生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是提供允許大規(guī)模體積培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器和方 法。此外，本發(fā)明的目的是提供生物反應(yīng)器和方法，即使大規(guī)模體積生長，其也允許在最佳 條件下培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞，并由此允許與生物反應(yīng)器的尺寸無關(guān)的工藝性能和產(chǎn)量。
[0005] 本發(fā)明的目的是提供大規(guī)模生物反應(yīng)器，其允許在諸如pH、溶氧張力（DOT)和溫 度之類的工藝參數(shù)方面的均相環(huán)境下培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞，在所述生物反應(yīng)器中保持良好的 細(xì)胞懸浮和使?fàn)I養(yǎng)補(bǔ)料（feed)混合。
[0006] 此外，本發(fā)明的目的是提供設(shè)備和方法，所述設(shè)備和方法允許以大規(guī)模的方式生 產(chǎn)哺乳動物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)物，尤其是由哺乳動物細(xì)胞合成的蛋白、肽、抗體或氨基 酸。
[0007] 通過提供如權(quán)利要求書中所述的用于培養(yǎng)真核細(xì)胞、特別是哺乳動物細(xì)胞的生物 反應(yīng)器、生物反應(yīng)器系統(tǒng)和方法，本發(fā)明解決了構(gòu)成本發(fā)明的基礎(chǔ)的技術(shù)問題。
[0008] 尤其是通過提供用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器，本發(fā)明解決構(gòu)成本發(fā)明基 礎(chǔ)的技術(shù)問題，所述生物反應(yīng)器特征在于其具有至少兩個葉輪。此外，通過提供用于培養(yǎng)和 增殖哺乳動物細(xì)胞的方法，本發(fā)明解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題，所述方法特征在于 在具有至少兩個葉輪的生物反應(yīng)器中，在合適的條件下和合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個哺 乳動物細(xì)胞。此外，通過提供用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，本發(fā)明解決了構(gòu)成 本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題，所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)特征在于：具有至少500升體積的a)第一生 物反應(yīng)器與體積大于所述第一生物反應(yīng)器并具有至少2000升體積的b)第二生物反應(yīng)器連 接，并且其中所述具有至少2000升體積的第二生物反應(yīng)器與體積大于所述第二生物反應(yīng) 器體積并具有至少兩個葉輪和至少10000升體積的c)第三生物反應(yīng)器連接。
[0009] 此外，通過提供培養(yǎng)和增殖哺乳動物細(xì)胞的方法，本發(fā)明解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ) 的技術(shù)問題，所述方法特征在于：a)在具有至少500升體積的第一生物反應(yīng)器中，在合適的 條件下和合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個哺乳動物細(xì)胞，b)將通過增殖至少一個哺乳動物細(xì) 胞獲得的含細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入具有至少2000升體積的第二生物反應(yīng)器，c)在所述具有至 少2000升體積的第二生物反應(yīng)器中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，d)將在步驟c)中獲得的含細(xì)胞培 養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入具有至少10000升體積的第三生物反應(yīng)器以及e)在所述具有至少10000升體 積的第三生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述被轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)細(xì)胞為真核細(xì)胞，優(yōu)選動物細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。所述哺 乳動物細(xì)胞可以為例如人類細(xì)胞系、小鼠骨髓瘤（NOS)細(xì)胞系，中華倉鼠卵巢（CHO)細(xì)胞系 或雜交瘤細(xì)胞系。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞為中華倉鼠卵巢（CHO)細(xì)胞系。
[0011] 培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選用于生產(chǎn)抗體，更優(yōu)選單克隆抗體，和/或重組蛋白，更優(yōu)選用于治 療應(yīng)用的重組蛋白。所述細(xì)胞當(dāng)然可以生產(chǎn)肽、氨基酸、脂肪酸或其它有用的生化中間體 或代謝產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，通過培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白的目標(biāo)濃度為大于〇.5g/l，優(yōu)選大于 2. Og/Ι，最優(yōu)選大于10.0 g/Ι。能夠以分批或補(bǔ)料分批的方式使用本發(fā)明的方法。雖然在 本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選為無蛋白培養(yǎng)基，但該設(shè)計不排除使用含蛋白流體 (stream)〇
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，生物反應(yīng)器為具有附加設(shè)備的生物相容性罐或容器，所述附加設(shè)備 例如葉輪、擋板、分布器（sparger)和/或孔（port)，其尤其允許用于培養(yǎng)和增殖哺乳動物 細(xì)胞。優(yōu)選所述罐或容器為管道的形式，在管道的兩末端（其優(yōu)選構(gòu)建罐的頂和底）具有平 板。這些平板被稱為頂板和基板。在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選實施方案中，基板為American Society of Mechanical Engineers Flanged and Dished (ASME F&D，美國機(jī)械工程師協(xié)會 F&D)設(shè)計的基板。所述頂板設(shè)計優(yōu)選符合人孔或優(yōu)選裝凸緣的頂板以允許安裝/拆卸葉 輪。
[0013] 總罐高為從罐的底部的罐內(nèi)側(cè)至罐的頂部的罐內(nèi)側(cè)的切線。
[0014] 將自由空間（freeboard，凈空）高度定義為當(dāng)將生物反應(yīng)器填充至其操作體積 時，在液體頂部之上直線側(cè)的長度。最小自由空間高度必需考慮在操作過程中形成泡沫的 程度、在允許的最大攪拌和通氣下氣體容納以及液體測量誤差。
[0015] 本發(fā)明的生物反應(yīng)器具有的體積為優(yōu)選至少500升，更優(yōu)選至少1000升，更優(yōu)選 至少4000升，甚至更優(yōu)選至少10000升，甚至更優(yōu)選至少20000升。最優(yōu)選地，本發(fā)明的生 物反應(yīng)器具有的體積為1000升、1307升、4000升、5398升、20000升或27934升。
[0016] 優(yōu)選，生物反應(yīng)器具有最大體積100000升，更優(yōu)選，生物反應(yīng)器具有最大體積 50000升，最優(yōu)選生物反應(yīng)器具有最大體積30000升。
[0017] 本發(fā)明的生物反應(yīng)器的設(shè)計保證在所述生物反應(yīng)器中諸如pH、溶氧張力（DOT)和 溫度之類的工藝參數(shù)方面的均相環(huán)境，保持良好混合細(xì)胞懸浮和使?fàn)I養(yǎng)補(bǔ)料混合。這為最 佳的細(xì)胞生長、產(chǎn)物積累和產(chǎn)物質(zhì)量提供了必要的物理化學(xué)環(huán)境。本發(fā)明的生物反應(yīng)器的 設(shè)計進(jìn)一步保證了維持幾何相似性。這允許在12升實驗室規(guī)模和500升中試規(guī)模開發(fā)按 比例縮小的模型。
[0018] 本發(fā)明的用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器具有至少兩個葉輪。更優(yōu)選，所 述生物反應(yīng)器具有兩個葉輪，甚至更優(yōu)選頂部葉輪（top impeller)和底部葉輪（bottom impeller)〇
[0019] 本發(fā)明的用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個頂部葉輪和至 少一個底部葉輪，其中頂部葉輪優(yōu)選水翼式葉輪（hydrofoil impeller)。
[0020] 本發(fā)明的用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個頂部葉輪和至 少一個底部葉輪，其中頂部葉輪為水翼式葉輪。
[0021] 本發(fā)明的用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少1000升的體積以及 至少一個頂部葉輪和至少一個底部葉輪，其中頂部葉輪為水翼式葉輪。
[0022] 本發(fā)明用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少4000升的體積以及至 少一個頂部葉輪和至少一個底部葉輪，其中頂部葉輪優(yōu)選水翼式葉輪。
[0023] 本發(fā)明用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少4000升的體積以及至 少一個頂部葉輪和至少一個底部葉輪，其中頂部葉輪為水翼式葉輪。
[0024] 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案中，頂部葉輪為水翼式葉輪。優(yōu)選可使用頂部葉輪 以提供強(qiáng)的主體混合。
[0025] 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案中，底部葉輪為水翼式葉輪。在本發(fā)明一種優(yōu)選的 實施方案中，頂部葉輪和底部葉輪為水翼式葉輪。
[0026] 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案中，至少頂部葉輪為水翼式葉輪。在本發(fā)明的一種 優(yōu)選實施方案中，所有葉輪都為水翼式葉輪。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案，底部葉輪為大稠度斜葉式葉輪（high-solidity pitch-blade impeller)或大稠度水翼式葉輪。優(yōu)選可使用底部葉輪以分散分布的 (sparged)氣體。
[0028] 優(yōu)選地，水翼式葉輪提供大得多的液體運(yùn)動，對于給定量的功率輸入導(dǎo)致更大的 主體混合。這也可依賴于流量數(shù)（flow number，Nq)。
[0029] 優(yōu)選地，非水翼式葉輪能夠提供液體運(yùn)動，但是在更大的功率輸入下提供。這對于 剪切敏感性哺乳動物細(xì)胞的健康具有重要性。
[0030] 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案中，水翼式葉輪為向下流動葉輪或向上流動葉輪。
[0031] 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案中，頂部葉輪為向下流動葉輪。在本發(fā)明一種優(yōu)選 的實施方案中，頂部葉輪為向下流動軸向水翼式葉輪。
[0032] 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案中，使用頂部葉輪下推特性來混合充分充氣的液體 表面和液體主體。
[0033] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，水翼式葉輪為高效水翼式葉輪。在本發(fā)明的一 種優(yōu)選實施方案中，水翼式葉輪為Chemineer - SC-3型葉輪、LIGHTNIN - A310或A510型葉 輪、Promix-PHF 型系列葉輪或 Cleaveland Eastern Mixers 葉輪。
[0034] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，頂部葉輪為高效水翼式葉輪。在本發(fā)明的一種 優(yōu)選實施方案中，頂部葉輪為Chemineer-SC-3型葉輪、LIGHTNIN-A310或A510型葉輪、 Promix - PHF 型系列