一株銨離子耐受型產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株銨離子耐受型產(chǎn)丁二酸大腸桿菌及其應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物育種 及其發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 丁二酸，又名琥珀酸，是一種常見的天然有機(jī)酸，廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微 生物中。丁二酸作為TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物以及厭氧代謝的終端還原產(chǎn)物之一，在生物代謝 過程中占有非常重要的地位。近年來的研宄結(jié)果表明丁二酸還可以作為C4平臺(tái)化合物合 成1，4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯等大宗化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS)類生物 可降解聚酯。近年來，隨著化石資源的日益枯竭和環(huán)境問題的日益嚴(yán)重，采用生物法制備丁 二酸備受矚目，美國(guó)能源部將丁二酸列為未來12種最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一。
[0003] 相對(duì)于化學(xué)合成法，生物合成制備丁二酸的方法受到越來越多的關(guān)注。生物合成 丁二酸，是利用細(xì)菌，真菌等各種微生物，以葡萄糖或其他各種水解液為碳源，經(jīng)微生物發(fā) 酵生產(chǎn)丁二酸，相對(duì)于化學(xué)合成的方法，其一大優(yōu)勢(shì)是原材料為酸成為近年來研宄的熱點(diǎn)。
[0004] 發(fā)酵菌株是丁二酸生物合成的關(guān)鍵點(diǎn)之一，多數(shù)細(xì)菌和真菌都能產(chǎn)生丁二 酸，但是只有部分菌株可產(chǎn)生高濃度的丁二酸，丁二酸工業(yè)生產(chǎn)菌包括一些丙酸鹽生 產(chǎn)菌、典型的胃腸細(xì)菌以及瘤胃細(xì)菌。目前，丁二酸工業(yè)發(fā)酵菌株的研宄主要集中在 產(chǎn)丁二酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillumsucciniciproducens)，產(chǎn)丁二酸放線桿菌 (Actinobacillussuccinogenes)，谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum)和大腸桿 菌（Escherichiacoli)等。其中Escherichia coli由于遺傳背景清楚，基因操作簡(jiǎn)單，生 長(zhǎng)速度快，易調(diào)控以及所用培養(yǎng)基較為廉價(jià)，近年來成為生物法制備丁二酸的研宄熱點(diǎn)。
[0005] 發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的過程中需要加堿調(diào)節(jié)PH來維持菌體的最適生長(zhǎng)產(chǎn)酸。目前 能實(shí)現(xiàn)的工藝要求的PH調(diào)節(jié)劑主要有鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽以及濃氨水，前三者有試劑消耗量 大、價(jià)格昂貴、下游提取工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)，而采用氨水調(diào)節(jié)PH發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸工藝中，不需 要消耗大量的試劑，生產(chǎn)的副產(chǎn)物少，結(jié)晶的丁二酸是唯一產(chǎn)物，該工藝具有閉合、清潔、廉 價(jià)和尚效等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本申請(qǐng)以本實(shí)驗(yàn)室自主篩選并保藏的菌株BER208為出發(fā)菌株（保藏編號(hào)CCTCC NO :M2012351)，由于銨離子對(duì)該菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸都有抑制作用，用氨水調(diào)pH發(fā)酵效果不 理想。為了實(shí)現(xiàn)氨水調(diào)節(jié)PH的廉潔工藝，選育可以耐受高濃度銨離子產(chǎn)丁二酸的菌株的工 作顯得尤為必要。通過改良菌株，使其可以在厭氧條件下耐受高濃度銨離子并大量積累產(chǎn) 酸，在今后的丁二酸生長(zhǎng)工業(yè)中具有舉足輕重的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明一個(gè)目的是提供一株在厭氧條件下高濃度銨離子耐受型的大腸桿菌，使其 可以積累丁二酸。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] -株銨根離子耐受型產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌，其屬于埃希氏菌屬，命名為大腸埃希 氏菌BER528(Escherichia coli BER528)，已于2015年3月25日保存于中國(guó)典型微生物保 藏中心，地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏登記號(hào)為CCTCC NO :M2015160。
[0010] 本發(fā)明所述的耐受高濃度銨離子、純厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的大腸埃希氏菌 Escherichia coli BER528的篩選方法：將大腸桿菌的出發(fā)菌株BER208經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)后，利 用高濃度銨離子合成培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)初篩和平板復(fù)篩得到能夠在厭氧條件下生長(zhǎng)的菌株， 在經(jīng)過厭氧搖瓶發(fā)酵篩選獲得可以高產(chǎn)產(chǎn)丁二酸的菌株為目標(biāo)菌株。其具體步驟如下：
[0011] (1)連續(xù)培養(yǎng)：將大腸桿菌原始菌株BER208在試管中活化，37°C，200r/min，過夜 培養(yǎng)。將試管中活化過的菌株接入到搖瓶中，37°C，200r/min培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)，作為二級(jí)種子。
[0012] ⑵連續(xù)培養(yǎng)裝置初篩：將步驟⑴所述的二級(jí)種子以10%接種量接入到含有高 濃度銨離子合成培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng)裝置中，對(duì)菌株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)裝置中的菌體密度上 升并達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，則提高稀釋速率，并根據(jù)反應(yīng)器中菌體密度和糖濃度的變化，不斷調(diào)節(jié)稀 釋速率。當(dāng)裝置中菌體密度和耗糖保持3個(gè)保留時(shí)間不變時(shí)，則表示突變菌株可能出現(xiàn)，從 反應(yīng)器中取樣檢測(cè)并涂布到含有高濃度銨離子合成培養(yǎng)基的固體平板上；
[0013] (3)高濃度銨離子合成培養(yǎng)基平板復(fù)篩：將步驟2)中篩選到的菌株在平板上反復(fù) 轉(zhuǎn)點(diǎn)培養(yǎng)，37°C厭氧培養(yǎng)24h，挑選生長(zhǎng)較大，較為飽滿的菌落；
[0014] (4)厭氧搖瓶發(fā)酵篩選：將步驟3)中篩選出的菌株接種到種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大培 養(yǎng)，37°C，200r/min，培養(yǎng)48h，然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量為2% (v/v)，37°C，200r/ min，培養(yǎng)72h ;考察步驟3)中篩選出的菌落中篩選出生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)酸量高的菌株。
[0015] 在上述篩選方法中，步驟2)中所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置中，水浴加熱維持裝置37°C， 200r/min磁力攪拌，0· 5L/min通入無菌二氧化碳?xì)怏w，20% Na2CO3控制pH為6. 8。通過懦 動(dòng)泵不斷泵入新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)反應(yīng)器中菌液體積超出200mL時(shí)，將自動(dòng)被氣體壓出。
[0016] 在上述篩選方法中：
[0017] 種子培養(yǎng)基為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC15g/L。
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)基為：檸檬酸 3g/L，Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P048g/L，MgSO4 · 7H201g/ L，CaCl2 · 2Η2010· Omg/L，ZnSO4 · 7Η200· 5mg/L，CuCl2 · 2Η200· 25mg/L，MnSO4 · Η202· 5mg/L， CoCl2 · 6H20L 75mg/L，H3BO3O. 12mg/L，Al2 (S04) 31· 77mg/L，Na2MoO4 · 2Η200· 5mg/L，檸檬酸鐵 16. lmg/L，維生素 BjOmg/L，生物素2mg/L，葡萄糖30~40g/L，以（NH4) 2即04提供按離子并 使NH4+濃度為0· 6mol/L，添加量為40g/L〇
[0019] 固體平板培養(yǎng)基為：發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2%瓊脂，葡萄糖10g/L。
[0020] 本發(fā)明還提供上述的銨離子耐受型產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的應(yīng) 用。
[0021] 該應(yīng)用的具體步驟為：
[0022] (1)平板培養(yǎng)：將大腸埃希氏菌（Eshcherichia coli)BER528接種在平板培養(yǎng)基 上厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為24h ;
[0023] (2)種子培養(yǎng)：將平板培養(yǎng)的大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BER528接種到種 子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37°C，200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48h ;
[0024] (3)發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸：將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量2% (v/v)， IOOmL厭氧搖瓶裝液量為30mL，堿式碳酸鎂作為pH調(diào)節(jié)劑，充二氧化碳2min ;培養(yǎng)溫度為 37°C，200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為 72h。
[0025]所述平板培養(yǎng)基配方為：檸檬酸 3g/L，Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P048g/L， MgSO4 · 7H201g/L，CaCl2 · 2Η2010· Omg/L，ZnSO4 · 7Η200· 5mg/L，CuCl2 · 2Η200· 25mg/ L，MnSO4 · Η202· 5mg/L，CoCl2 · 6Η201· 75mg/L，H3BO3O. 12mg/L，Al2(SCM) 31· 77mg/L， Na2MoO4 ·2Η200· 5mg/L，檸檬酸鐵 16. lmg/L，瓊脂 20g/L，葡萄糖 10g/L，以（NH4)2HPO4提供銨 離子并使NH 4+濃度為0· 6mol/L，添加量為40g/L〇
[0026] 所述種子培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC15g/L。
[0027] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：檸檬酸3g/L，Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P048g/L， MgSO4 · 7H201g/L，CaCl2 · 2Η2010· Omg/L，ZnSO4 · 7Η200· 5mg/L，CuCl2 · 2Η200· 25mg/ L，MnSO4 · Η202· 5mg/L，CoCl2 · 6Η201· 75mg/L，H3BO3O. 12mg/L，Al2(SCM) 31· 77mg/L， Na2MoO4 ·2Η200· 5mg/L，梓檬酸鐵16. lmg/L，堿式碳酸鎂24~42g/L，葡萄糖30~40g/L，以 (順4)2即0 4提供銨離子并使NH 4+濃度為0. 6mol/L，添加量為40g/L。
[0028] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0029] 本發(fā)明采用連續(xù)培養(yǎng)方式培養(yǎng)大腸桿菌，利用含有高濃度銨離子的合成培養(yǎng)基平 板，篩選出在厭氧條件下能夠耐受高濃度銨離子，并高產(chǎn)丁二酸的菌株。本發(fā)明的菌株可以 在厭氧條件下，耐受高濃度的銨離子，并積累丁二酸。在外源添加〇. 53mol/LNH4+的厭氧搖 瓶發(fā)酵中，72h菌體DCW為I. 82g/L，丁二酸產(chǎn)量為11. 72g/L，而原始出發(fā)菌株在該條件生長(zhǎng) 極其緩慢，72h菌體DCW僅為I. 14g/L，丁二酸產(chǎn)量為2.56g/L。相對(duì)于出發(fā)菌株，丁二酸產(chǎn) 量提高4. 57倍。在5L發(fā)酵罐中利用氨水調(diào)節(jié)pH，