一種普洱普魯藍(lán)菌及其培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種普洱普魯藍(lán)菌及其培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白酶是催化分解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶，與人類的生活息息相關(guān)。在所有的工業(yè)用酶制劑中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工業(yè)用酶中占據(jù)比例最大的酶類，大約占全世界每年總銷售量的60%左右。由于微生物蛋白酶均為胞外酶且微生物菌體易于培養(yǎng)，因此與動、植物蛋白酶相比，具有下游處理技術(shù)相對簡單，具有工業(yè)化大批量生產(chǎn)的優(yōu)勢。
[0003]蛋白酶在食品、釀造、醫(yī)藥、紡織、皮革、日用化學(xué)洗滌劑、飼料以及水產(chǎn)加工等多個行業(yè)有廣泛應(yīng)用，對國民經(jīng)濟的發(fā)展起著重要的作用。
[0004]目前，利用酶制劑來提高茶葉品質(zhì)的方法已被認(rèn)可。尤其是在普洱茶的加工中。普洱茶是以云南大葉種制成的曬青毛茶作為原料，經(jīng)發(fā)水、渥堆、陳化及干燥工序精制而成的后發(fā)酵茶。在普洱茶的加工和貯存中，微生物自身包含的酶及代謝產(chǎn)生的胞外酶，如纖維素酶，果膠酶，多酚氧化酶和蛋白酶等使茶的內(nèi)含物發(fā)生了變化，對普洱茶品質(zhì)的形成有及其重要的作用。與傳統(tǒng)工藝相比，在普洱茶加工中應(yīng)用外源酶制劑不僅有利于開發(fā)出品種風(fēng)味獨特、功能各異的茶葉制品。并且能緩解微生物復(fù)雜的調(diào)控難題，可縮短加工時間，節(jié)約生產(chǎn)成本。
[0005]在茶葉加工過程中外源酶的研宄中指出，蛋白酶能夠促進(jìn)茶葉蛋白質(zhì)的水解，提高茶葉氨基酸和茶黃素的含量，縮短茶葉的發(fā)酵時間。蛋白酶在將蛋白質(zhì)降解為胨、短肽的同時，還可能降解掉不溶性多酚類聚合物以及茶多糖中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致茶多酚、可溶性糖和水浸出物的含量，提升茶葉的品質(zhì)。
[0006]但目前應(yīng)用于茶葉加工的蛋白酶主要是其他來源的蛋白酶，而來源于普洱茶發(fā)酵微生物的蛋白酶還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一在于提供一種普洱普魯藍(lán)菌。
[0008]本發(fā)明的目的之二在于提供該普洱普魯藍(lán)菌的培養(yǎng)方法。
[0009]本發(fā)明所提供的細(xì)菌，被鑒定為普海普魯藍(lán)菌(/^/77w7a/?i6aci77w5.puerf)，來源于陳熟普洱茶。
[0010]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種普洱普魯藍(lán)菌YN3，該菌株的保藏號為CGMCC N0.1.12777。
[0011]一種培養(yǎng)上述的普洱普魯藍(lán)菌YN3的方法，其特征在于該方法是:將普洱普魯藍(lán)菌YN3接種于CYC培養(yǎng)基，在25-50°C，pH4.0?8.0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；所述CYC培養(yǎng)基的組成及含量為:每100mlCYC液體培養(yǎng)基含有！NaNO3 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H200.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.01 g，鹿糖 30 g，Yeast extract 2.0g 和 Casaminoacids 6.0g0
[0012]上述培養(yǎng)溫度為30?37°C。
[0013]上述pH 為 5.0 ?6.0。
[0014]一種根據(jù)上述的普洱普魯藍(lán)菌在液體發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用。
[0015]所述普海普魯藍(lán)菌/w/eri)YN3，它于2014年2月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是中國北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，保藏號為CGMCC N0.1.12777。
[0016]取普洱熟茶浸出液，將其稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落，然后劃線純化得到。
[0017]本發(fā)明所提供的普洱普魯藍(lán)菌YN3具有以下特征:
I)菌落特征:菌落直徑為3.0_，菌落呈圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊，凸起，黃色或白色。
[0018]2)細(xì)胞形態(tài)特征:細(xì)胞為短桿或彎曲狀，頂端圓鈍；革蘭氏染色陽性；細(xì)胞菌體大小為0.5-0.6 μπιΧ 1.0-2.6 μ m，單生或成簇。產(chǎn)端生芽孢，胞囊膨大。
[0019]3)生理生化特征:好氧生長；接觸酶陽性；核酸酶陰性；水解七葉靈；液化明膠；水解酪蛋白；不水解普魯藍(lán)多糖；不水解淀粉；不還原硝酸鹽；能利用葡萄糖、木糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、糖原、甘油、麥芽糖、乳糖、L-阿拉伯糖、核糖、肌醇、果糖、山梨醇、鼠李糖、海藻糖、苦杏苷作為碳源；不利用D-阿拉伯糖、木糖醇、甲酸、甲醇、乙酸鈉、酮戊二酸、延胡索酸、L-鳥氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、DL-天冬酰胺、甘氨酸、賴氨酸與組氨酸。
[0020]普洱普魯藍(lán)菌YN3的16S rRNA基因序列長度為1553bp。其16S rRNA基因的核苷酸序列間SEQ ID N0.1所示的堿基序列。
[0021]本發(fā)明的普洱普魯藍(lán)菌YN3是從陳熟普洱茶中分離得到的，是一種能夠分解蛋白質(zhì)的微生物，該微生物的蛋白酶活為U/mg，文獻(xiàn)中未見關(guān)于從普洱茶中分離產(chǎn)蛋白酶微生物的報道。通過本發(fā)明普洱普魯藍(lán)菌YN3參與茶葉中蛋白質(zhì)的分解，提升普洱茶的品質(zhì)，并為工業(yè)廣泛應(yīng)用蛋白酶制劑提供菌種資源。
[0022]本發(fā)明則從陳熟普洱茶中分離到分解酪蛋白、產(chǎn)生蛋白酶的微生物，從食品安全和原位酶活激發(fā)的角度出發(fā)，為普洱茶的加工及蛋白酶的其他工業(yè)化應(yīng)用提供菌種資源，具有較好的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0023]下述實驗例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。
[0024]實施例1、菌株YN3的分離制備:取普洱熟茶浸出液，將其稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落，然后劃線純化得到。
[0025]將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號為 CGMCC N0.1.12777。
[0026]實施例2、菌株鑒定一、形態(tài)及生理生化特征
將菌株YN3 (CGMCC N0.1.12777)接種于蔗糖為底物的CYC固體培養(yǎng)基(含質(zhì)量百分含量為1.5%的瓊脂)，在pH為6.0，溫度為30°C的條件下固體培養(yǎng)2天。
[0027]觀察菌落及細(xì)胞的形態(tài)特征，并進(jìn)行如下生理生化實驗:1革蘭氏染色試驗，2接觸酶試驗，3水解七葉靈試驗，4液化明膠試驗，5還原硝酸鹽試驗，6底物利用試驗，7DNAase試驗8酪蛋白水解試驗9普魯藍(lán)多糖水解試驗10淀粉水解試驗
觀察結(jié)果及實驗結(jié)果如下:
I)菌落特征:菌落直徑為3.0_，菌落呈圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊，凸起，黃色或白色。
[0028]2)細(xì)胞形態(tài)特征:細(xì)胞為短桿或彎曲狀，頂端圓鈍；革蘭氏染色陽性；細(xì)胞菌體大小為0.5-0.6 μπιΧ 1.0-2.6 μ m，單生或成簇。產(chǎn)端生芽孢，胞囊膨大。
[0029]3)生理生化特征:好氧生長；接觸酶陽性；核酸酶陰性；水解七葉靈；液化明膠；水解酪蛋白；不水解普魯藍(lán)多糖；不水解淀粉；不還原硝酸鹽；能利用葡萄糖、木糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、糖原、麥芽糖、乳糖、L-阿拉伯糖、核糖、肌醇、果糖、山梨醇、鼠李糖、海藻糖、苦杏苷作為碳源；不利用D-阿拉伯糖、木糖醇、甲酸、甲醇、乙酸鈉、酮戊二酸、延胡索酸、L-鳥氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、DL-天冬酰胺、甘氨酸、賴氨酸與組氨酸。
[0030]二、菌株YN3 (CGMCC N0.1.12777)的16S rRNA基因的PCR擴增和序列測定 O提取DNA
將普洱普魯藍(lán)菌YN3 (CGMCC N0.1.12777)接種于CYC液體培養(yǎng)基，將生長至對數(shù)晚期的發(fā)酵液，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心I分鐘，去除上清液；用TES (50 mM Tris, 50 mM EDTA-Na2,50mM NaCl，pH 8.0-8.2)溶液洗3遍；用0.4mL TES溶液將菌體混勻，加入適量溶菌酶，37°C保溫I小時；加入0.04 mL20%SDS，60°C保溫30分鐘；加入0.18 mL 5M NaClO4,混勻；加入等體積氯仿-異戊醇(24:1)，輕輕搖勻I分鐘左右，離心(12000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)，吸取上清液；上清液加入20 μ I 0.2 % RNA酶37°C保溫30分鐘，氯仿-異戊醇(24:1, v/v)處理一遍；上清液加入20 μ I蛋白酶K (50-70 yg/mL)，37°C保溫I小時，氯仿-異戊醇(24:1，v/v)處理一遍；上清液用2倍體積冰乙醇沉淀，70%冰乙醇溶液浸泡5分鐘，12000/分鐘離心5分鐘。晾干后溶于無菌水中作為模板DNA。
[0031]2) 16S rRNA基因的PCR擴增及測序
用于PCR擴增的正向引物為5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (nt 8-27)，反向引物為5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’ (nt 1541-1557)，分別對應(yīng)于大腸桿菌的 16S rRNA基因的8-27和 1541-1557 堿基。PCR 反應(yīng)體系(20 μ I)為:10Xbuffer 2 μ 1,25 mmol/L MgCl22 μ I,10 mmol/L dNTPs 1.5 μ 1,30 pmol/L 引物各 lyl、ddH20 13.4 μ l.Taq DNA 酶 I μ 1、模板I μ I。PCR反應(yīng)條件為:95°C 10 min，95°C I min，55°C I min，72°C I min30s，30 個循環(huán)；72°C 10 m