一種用于鑒定前胡的引物對及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，涉及中藥及中藥材鑒定領域，特別涉及一種用 于鑒定前胡的引物對及其應用。
【背景技術】
[0002] 前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根。由于歷 史上各地區(qū)用藥習慣不同，前胡的植物來源比較復雜，混偽品較多，目前市場上主要的混偽 品為濱海前胡、碎葉山芹、紫花前胡、蕨葉藁本、異葉茴芹、石防風、短片藁本等。
[0003] 前胡藥材與同科或同屬混偽品的形態(tài)特征比較相近，外形鑒別比較困難，采用傳 統(tǒng)的鑒定方法有一定的局限。因此，亟需尋找一種快速、準確的鑒定方法，以確保前胡藥材 鑒定的準確性。熊永興等采用的DNA條形碼技術對前胡及其混偽品進行鑒定（熊永興、鄔 蘭，劉義梅，陳科力，前胡及其混偽品的DNA條形碼鑒定研宄，中藥材，2013, 36 (11) :1762)， 但該方法耗時較長，且使用大型儀器，不利于實現(xiàn)快速、現(xiàn)場檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定前胡的引物對。
[0005] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定前胡的引物對為由序列表中序列1和序列2 所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。
[0006] 所述引物對中，兩條單鏈DNA分子既可以分別單獨包裝，也可以按照摩爾比為1:1 的比例混合后包裝在一起。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定前胡的試劑盒。
[0008] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定前胡的試劑盒，具體可含有所述引物對、 dNTP和DNA聚合酶。
[0009] 制備所述引物對的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0010] 制備所述引物對的方法，具體可包括將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別 單獨包裝的步驟。
[0011] 制備所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0012] 制備所述試劑盒的方法，具體可包括如下步驟：將組成所述引物對的兩條單鏈 DNA分子分別單獨包裝后，與分別單獨包裝的dNTP和DNA聚合酶包裝于同一個試劑盒內(nèi)。
[0013] 所述引物對或所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定前胡中的應用也屬于本發(fā)明的保護 范圍。
[0014] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種利用所述引物對或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測樣品中是否含有前胡的方法。
[0015] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否 含有前胡的方法，具體可包括如下步驟：
[0016] (a)從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對進行PCR擴增；
[0017] (b)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測樣品中是否含 有前胡：若PCR產(chǎn)物中含有400-500bp (如485bp)的DNA片段，則所述待測樣品中含有或候 選含有前胡；若PCR產(chǎn)物中不含有400-500bp (如485bp)的DNA片段，則所述待測樣品中不 含有或候選不含有前胡。
[0018] 在所述方法中，所述前胡為中藥材。當然所述方法也可以用于檢測前胡的基原植 物--白花前胡（Peucedanum praeruptorum)。相應的，所述待測樣品既可為單一或混合的 中藥材成品，也可以為植株或取自所述植株的組織或器官。
[0019] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種利用所述引物對或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測樣品為前胡還是紫花前胡的方法。
[0020] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測樣品為前胡， 還是紫花前胡、濱海前胡、華中前胡、石防風、短片藁本、碎葉山芹、蕨葉藁本和異葉茴芹中 的任一種的方法，具體可包括如下步驟：
[0021] (a)從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對進行PCR擴增；
[0022] (b)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測樣品為前胡， 還是紫花前胡、濱海前胡、華中前胡、石防風、短片藁本、碎葉山芹、蕨葉藁本和異葉茴芹中 的任一種：若PCR產(chǎn)物中含有400-500bp的DNA片段，則所述待測樣品為或候選為前胡；若 PCR產(chǎn)物中不含有400-500bp的DNA片段，則所述待測樣品為或候選為紫花前胡、濱海前胡、 華中前胡、石防風、短片藁本、碎葉山芹、蕨葉藁本和異葉茴芹中的任一種；
[0023] 所述待測樣品為前胡、紫花前胡、濱海前胡、華中前胡、石防風、短片藁本、碎葉山 芹、蕨葉藁本和異葉茴芹中的任一種（既可為中藥材也可為基原植物）。
[0024] 在上述兩方法的步驟（a)中，進行所述PCR擴增時采用的退火溫度可為55°C。
[0025] 在本發(fā)明中，進行所述PCR擴增時采用的具體反應條件如下：95°C 5min ; 95°〇3〇8,55°〇3〇8,72°〇3〇8,25個循環(huán)；72°〇1〇11^11。
[0026] 在上述兩方法的步驟（a)中，在進行所述PCR擴增的反應體系中，所述引物對中每 條單鏈DNA分子的終濃度均為400nM。
[0027] 在本發(fā)明中，進行所述PCR擴增時采用的具體反應體系如下：0. 5yL模板 0嫩，1.04 1^序列1所示的引物（10?111〇1)，1.(^1^序列2所示的引物（10?111〇1)，2.54 1^ IOXbuffer 緩沖液，I. 5yL 濃度為 25mM 的 MgCljK溶液，0. 5yL 濃度為 IOmM 的 dNTPs， 0· 5 μ L Taq DNA聚合酶（5U/ μ L)，無菌雙蒸水補足至25 μ L。
[0028] 在上述兩方法中，所述400-500bp (如485bp)的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳圖譜 上位于DNA分子量標準400和500bp之間。
[0029] 在實際應用中，判斷所述PCR產(chǎn)物中是否含有400-500bp (如485bp)的DNA片段， 可通過將所述PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，若電泳結果顯示含有400-500bp (如 485bp)目的條帶，則所述PCR產(chǎn)物中含有400-500bp (如485bp)的DNA片段；反之，則不含 有400-500bp (如485bp)的DNA片段。當然也通過測序的方法判定所述PCR產(chǎn)物中是否含 有 400-500bp (如 485bp)的 DNA 片段。
[0030] 在本發(fā)明中，所述400-500bp (如485bp)的DNA片段為485bp的DNA片段，具體為 序列3所示的DNA片段。
[0031] 實驗證明，采用本發(fā)明所提供的引物，通過快速PCR方法實現(xiàn)了前胡與紫花前胡 等混偽品的快速、準確鑒別，實現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用提供技術支撐。
【附圖說明】
[0032] 圖1為前胡及混淆品的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，譜系分支節(jié)點上方為BI樹的后驗概率 PP和MP樹的自舉支持度BS，在斜線的左邊為PP值，斜線的右邊為BS值。
[0033] 圖2為通用引物擴增凝膠電泳圖。M :DNA分子標準（DNA Marker，從上到下依次為 600、500、400、300、200 和10(^?);1:前胡；2:紫花前胡。
[0034] 圖3為特異性PCR引物對QH-CP19 (上下游引物分別為QH-CP19S和QH-CP19a)擴 增凝膠電泳圖。M:DNA分子標準（DNA Marker，從上到下依次為600、500、400、300、200和 IOObp) ;1到4 :用特異性PCR引物對QH-CP19擴增4個前胡（白花前胡）樣本的結果；5到 8 :用特異性PCR引物對QH-CP19擴增4個紫花前胡樣本的結果。
[0035] 圖4為特異性PCR引物對QH-CP19 (上下游引物分別為QH-CP19S和QH-CP19a)擴 增凝膠電泳圖。M:DNA分子標準（DNA Marker，從上到下依次為600、500、400、300、200和 IOObp) ;1 到 7 :前胡 DNA 模板濃度依次為 42ng/ μ l、21ng/ μ l、llng/ μ l、5ng/ μ 1、2· 5ng/ μ 1、L 25ng/ μ I 和 0· 625ng/ μ I ;8 到 14 :紫花前胡 DNA 模板濃度依次為 42ng/ μ l、21ng/ μ l、llng/ μ l、5ng/ μ 1、2· 5ng/ μ 1、L 25ng/ μ 1 和 0· 625ng/ μ I。
【具體實施方式】
[0036] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038] 實施例1、用于鑒定前胡的試劑盒的制備及使用方法
[0039] -、用于鑒定前胡的引物對的設計與合成
[0040] 從GenBank查找前胡及混淆品的ITS序列，詳見下表1。
[0041] 表1前胡及混淆品的ITS序列
[0042]
[0043]
[0044] 分別用貝葉斯法（Bayesian inference, BI)和簡約法（maximum parsimony, MP) 進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構建BI和MP兩種系統(tǒng)樹。其中BI樹用MrBayes version 3. I. 2軟件 構建，MP 樹用 PAUP*version 4. Obeta 10 軟件構建。構建 BI 樹時，用 MrModeltest version 2. 3軟件根據(jù)AIC(Akaike Information Criterion)檢驗標準選擇數(shù)據(jù)的最適模型，所選 最適模型是（GTR+I+G)。馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（Markov Chains Monte Carlo, MCMC) 設置為四條鏈并運行500000代。為了確定其收斂情況，MCMC分別運行兩次。每100代抽 取一個樣本，共形成10002個樣本。經(jīng)過分析得知，整個運行在20000代后達到平穩(wěn)，這樣， 總共剩余的樣本數(shù)為9602,用剩余樣本重建系統(tǒng)樹并估計其后驗概率值。構建MP樹時，設 置自舉重復次數(shù)bootstrap nr印s為1000次，使用啟發(fā)式搜索分析自舉重復數(shù)據(jù)集，啟發(fā) 式搜索設置為由隨機逐步添加法產(chǎn)生起始樹，重復10次，采用TBR分支交換。通過BI法 和MP法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，2種方法構建的系統(tǒng)樹完全一致（圖1)。圖1中各譜系分 支的節(jié)點處標有BI樹的后驗概率（posterior probability, PP)值和MP樹的自舉支持度 (Bootstrap, BS)。結果表明，前胡所有序列的單倍型形成單系（PP = L 00, BS = 99)。
[0045] 在確定前胡為單系群的前提下，用軟件Clustal X 1. 81對表1中所有ITS序列進 行對位排序和比較，找到差異片段，設計前胡檢測特異性PCR引物，如下：
[0046] QH-CP19S :5' -TGGCCACTCCCGGaTT-3'（序列 1);
[0047] QH