一種鎳-極低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重金屬離子的免疫學(xué)檢測，具體涉及一種鎳-極低密度脂蛋白螯合物 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合所形成的一種脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù) 合物，按密度分為高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，簡稱HDL)、中間密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein，簡稱IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，簡稱LDL)、極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,簡稱VLDL)、 乳糜顆粒（chylomicron，CM)。血液中大約百分之三十的膽固醇是通過HDL從組織細(xì)胞中 運(yùn)輸?shù)礁闻K轉(zhuǎn)化為膽汁酸或通過膽汁排出體外的。血液中約70%的膽固醇由LDL和VLDL 所攜帶，肝臟中產(chǎn)生的內(nèi)源性甘油三酯（triglyceride，TG)也主要依靠VLDL運(yùn)輸至肝外。 VLDL的增多與高脂血癥、脂代謝紊亂息息相關(guān)，而血脂異常又是多種疾病發(fā)生的重要危險 因素，因而VLDL含量水平的穩(wěn)定對于人體各方面機(jī)能功能的穩(wěn)定起著重要作用。
[0003] VLDL含量水平及結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定對機(jī)體意義重大。其含量過高與脂肪肝、脂代謝 紊亂、心血管疾病、腎臟功能損傷等息息相關(guān)。定量檢測VLDL可以用于這些疾病的早期診 斷以及治療效果監(jiān)測，甚至作為預(yù)后好壞的評價指標(biāo)之一。而對于營養(yǎng)不良、慢性貧血、肝 功能受損者等患者，血清VLDL含量也會下降，定量檢測VLDL也可用于這些疾病的早期診 斷、治療效果監(jiān)測以及作為預(yù)后評價的指標(biāo)之一。
[0004] 鎳（Nickel，Ni)與人體的健康息息相關(guān)，首先其是人體維持健康所必需的微量元 素，其存在于多種氫化酶中，催化氫的氧化還原反應(yīng)，參與多種酶蛋白的合成和細(xì)胞激素及 色素的代謝，具有促進(jìn)鐵的吸收和紅細(xì)胞的增長、激活酶形成輔酶、增強(qiáng)胰島素、降血糖、保 護(hù)心血管等作用，因此如果人體缺乏鎳，會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。但是，事實(shí)在生活中，由于環(huán)境 污染，人體內(nèi)很少缺乏鎳，相反鎳的含量常常過量，常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至危及生命。
[0005] 然鎳螯合于極低密度脂蛋白上的機(jī)制尚不清楚，兩者之間的相互作用及對機(jī)體的 影響也尚待研究。但是可以明確的，極低密度脂蛋白和鎳對于機(jī)體的作用都至關(guān)重要，而定 量檢測極低密度脂蛋白上螯合鎳是研究兩者相互關(guān)系的第一步，其具有重要科研及臨床價 值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對鎳污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鎳-極低密度脂蛋白螯合物 及其制備方法，并建立鎳-極低密度脂蛋白螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測 鎳-極低密度脂蛋白螯合物在評價一個地區(qū)鎳污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人 群血清中鎳-極低密度脂蛋白螯合物，可以間接反映這個地區(qū)人群受鎳污染的情況，從而 間接反映這個地區(qū)鎳污染程度。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鎳-極低密度脂蛋白螯合 物，該鎳-極低密度脂蛋白螯合物是鎳離子與極低密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘 基螯合而成。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述的鎳_極低密度脂蛋白螯合物的制備方法，即體外合成 法，包括以下步驟：
[0009] A)鎳-極低密度脂蛋白螯合物的合成：在提純源于人體的極低密度脂蛋白或按照 生物學(xué)方法重組的極低密度脂蛋白中加入鎳離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0010] B)鎳-極低密度脂蛋白螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液 中未反應(yīng)的極低密度脂蛋白、特異性抗體和鎳離子，即得鎳-極低密度脂蛋白螯合物。
[0011] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括以下步驟：
[0012] (1)溶解樣品：將上述步驟A)的鎳-極低密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水中， 得鎳-極低密度脂蛋白螯合物的溶液；
[0013] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與極低 密度脂蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，使極低 密度脂蛋白與填料特異性結(jié)合；
[0015] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0016] (5)收集：收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0017] (6)透析：將步驟（5)的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透 析過夜，收集樣本；
[0018](7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鎳特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0019] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0020] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0021] (10)收集：收集步驟（9)洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0022] (11)透析：將步驟（10)的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C 透析過夜，收集樣本，即得鎳-極低密度脂蛋白螯合物。
[0023] 作為優(yōu)選，上述鎳-極低密度脂蛋白螯合物的制備方法，還包括以下對鎳-極低密 度脂蛋白螯合物的鑒定步驟，具體包括以下步驟：
[0024] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0025] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎳-極低密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩 沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0026] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0027] (4)檢測：在膠床上找出含有鎳的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS檢測是否含有鎳以及檢測鎳的含量。
[0028] 本發(fā)明還提供一種如上述的鎳-極低密度脂蛋白螯合物在制備檢測人體內(nèi)鎳-極 低密度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鎳-極低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的 試劑盒。
[0030] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲極低密度脂蛋白的物質(zhì)或 捕獲金屬鎳的物質(zhì)。
[0031] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鎳-極低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上 述的鎳_極低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免 疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 鎳-極低密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鎳-極低密度脂蛋白螯合物與原子吸 收光譜結(jié)合法、提純鎳-極低密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與 酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0032] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0033] 1.本發(fā)明首次合成了鎳-極低密度脂蛋白螯合物；
[0034] 2.本發(fā)明首次提出鎳-極低密度脂蛋白螯合物可用于制備檢測血樣中鎳_極低密 度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用；
[0035] 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了鎳-極低密度脂蛋白螯合物的特異性識別和定量檢測，以便定量 檢測人群血清中鎳-極低密度脂蛋白螯合物的含量，以評價一個地區(qū)鎳污染程度的應(yīng)用， 為工業(yè)地區(qū)的鎳污染水平提供間接指標(biāo)。本發(fā)明建立的鎳-極低密度脂蛋白螯合物定量檢 測方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0036] 圖1為本發(fā)明所述的鎳-極低密度脂蛋白螯合物的非變性電泳蛋白條帶圖；
[0037] 圖2為本發(fā)明所述的鎳-極低密度脂蛋白螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光 分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0039] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說明，均視為可從市購方式購得：
[0040] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0041] 捕獲極低密度脂蛋白的物質(zhì)為抗極低密度脂蛋白抗體，可通過市售獲得，以下實(shí) 施例中，使用的抗極低密度脂蛋白抗體為"Genetexgtxl6419"的VLDLantibody，所述與極 低密度脂蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗極低密度脂蛋白抗體、抗VLDL抗體均為捕獲極低密度 脂蛋白的物質(zhì)；
[0042] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0043] 稀釋緩沖液為pH9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，配制方法示例：取I. 5g的Na2COjP 2. 93g的NaHCO3溶解加CldH2O定容至1000 mL;
[0044] 洗滌緩沖液為pH7. 4的0? 15MPBS溶液，配制方法示例：取0? 2g的KH2P04、2. 90g 的Na2HPO4 ? 12H20、8.Og的NaCl、0. 2g的KC1、0. 5mLTween-20,溶解加ddH20 定容至1000 mL;
[0045] 封閉液為牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.Ig牛血清白蛋白，加入洗滌緩 沖液稀釋定容至IOOmL;
[0046] 終止液為2MH2SO4,配制方法示例：取178. 3mL的ddH20,加濃H2SO4定容至200mL;
[0047] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液，配制方法示例：取0. 5mL濃度為2g/L的甲基聯(lián)苯 胺乙醇溶液，加底物稀釋液稀釋至IOmL;
[0048]底物緩沖液pH為5. 0，其中Na2HPO4的摩爾濃度為0. 2M、檸檬酸的摩爾濃度為 0. 1M，配制方法示例：取I. 42gNa2HP04、0. 96g檸檬酸，然后加入CldH2O至50mL，即得；
[0049] 洗脫液的配制方法示例：將木瓜蛋白酶用pH8. 0, 0.lmol/LTris-HCI緩沖液配 制成l-2mg/mL，再加入lmmol/L二硫蘇糖醇（DTT)37°C孵育30min，得洗脫液；