一種構(gòu)建多位點突變重組表達質(zhì)粒的高效方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物領(lǐng)域，具體設(shè)及一種構(gòu)建多位點突變重組表達質(zhì)粒的高效方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 體外定點突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復雜關(guān)系的有力工具，也是我 們在實驗室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，二者之間的關(guān)系是 蛋白質(zhì)組研究的重點之一。對某個已知基因的特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可W 改變對應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對突變基因的表達產(chǎn)物進行研究有助于我們了解蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域。而利用定點突變技術(shù)改造基因，相信 大家也非常熟悉：比如野生型的綠色巧光蛋白（wtGF巧是在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱的 綠色巧光，經(jīng)過對其發(fā)光結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸定點改造，現(xiàn)在的GFP能在可見光的波長范 圍被激發(fā)（吸收區(qū)紅移），而且發(fā)光強度比原來強上百倍，甚至還出現(xiàn)了黃色巧光蛋白，藍 色巧光蛋白等等。定點突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣，比如研究蛋白質(zhì)相互作用位點的結(jié) 構(gòu)、改造酶的不同活性或者動力學特性，改造啟動子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性 或者是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，W及藥物研發(fā)、基因治療等等方面
[0003] 但是現(xiàn)有的突變技術(shù)效率低下，不適于推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明基于重疊延伸PGR和雙接頭PCR方法，提供了一種構(gòu)建多 位點突變重組表達質(zhì)粒的高效方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0006] 一種構(gòu)建多位點突變重組表達質(zhì)粒的高效方法，包括如下步驟：
[0007] S1、將表達質(zhì)粒PHAT2用雙酶切方法采用兩種限制性內(nèi)切酶化〇1和化〇1酶切產(chǎn) 生帶有粘性末端5' -CATG-3'和5' -AGCT-3'線性片段，回收線性化質(zhì)粒片段備用；
[000引 S2、PCR引物設(shè)計：將Fs和Rs作為目標基因的正向及反向巢氏引物；將T7和SP6 作為表達質(zhì)粒PHAT2閱讀框上下游一對引物；對Fmim2M3和Rm1M2M3引物根據(jù)目標基因突變位點 序列進行設(shè)計；
[0009] S3、進行S輪PCR反應(yīng)得到突變表達載體：第一輪PCR反應(yīng)，分別用T7/Rmim2M3和 SP6/Fmim2M3兩對引物進行擴增，得到含有突變位點基因片段；第二輪PCR反應(yīng)用Fs和Rs引 物進行擴增，W第一輪PCR反應(yīng)擴增后回收的含有突變位點基因片段為模板；第S輪PCR反 應(yīng)分別用Ftl/Rs和化2/Fs兩對引物進行擴增，回收產(chǎn)物等量（摩爾數(shù)）混合，回收線性化 基因片段備用；
[0010] S4、進行連接反應(yīng)：將線性化質(zhì)粒片段和基因片段進行連接，連接反應(yīng)的體系 如下：0. 1-0.化 mol(5yL)基因片段，0. 01-0. 0 化 mol(3yL)載體片段，lyLIOXT4DNA ligase BuffeH660mM Tris-HCl pH7. 6,66mM MgClz'lOOmM l，4-Dithiothreitol，lmM ATP)，1y LTJ)NAligase(350U/y L，TaKaRa)16°C 10-12h;
[0011] S5、構(gòu)建突變表達載體：將步驟S4所得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化40 y L E. coli JM109度iomed)，大腸桿菌懸浮液均勻平鋪含有氨節(jié)（100 y g血1化B瓊脂板上，37°C的溫度 下培養(yǎng)12-1化后，陽性克隆用PCR方法檢測驗證。
[001引其中，所述步驟S2中對Fmim2M3和Rm1M2M3的具體設(shè)計為：Fm1M2M35'序列15個堿基 巧雖M烏A9M跑n-3'）是用于拼接反應(yīng)的，隨后的3個堿基（5'-iee-3'）是突變位 點，F(xiàn)m1M2M33'序列15個堿基是目標基因序列；Rmim2M35'序列依次為互補突變位點（5'-雄A-3') 及15個堿基巧' -M跑n巧GAI雖IG -3'）用于拼接反應(yīng)，Rm?2M33'序列15個堿基是目 標基因序列。
[0013] 其中，所述的Ftl和化2引物分別是在巢氏引物Fs和Rs 5'加入粘性末端 5, -CATG-3,和 5, -AGCT-3，。
[0014] 其中，所述的第一輪PCR反應(yīng)和第二輪PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系均為：l-100ng模板 DNA，1 y L 引物 T7/Rmim2M3或者 SP6/FM1M2M3(20 y M)，4 y L dNTP (2. 5mM)，5 y L 10 X Pyrobest buffer II，0. 25]iL of Pyrobest DM Polymerase(5U/]iLTaKaRa)，加 d地2〇 至 50]iL 體 系。
[0015] 其中，所述的第一輪PCR反應(yīng)和第二輪PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：94°C 4min， 94°C 30s，58°C 30s，72°C 40s，25 循環(huán)，72°C延伸 lOmin。
[0016] 其中，所述的第S輪PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為：94°C變性10min，65°C復性15min， 16°C 30s〇
[0017] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0018] 本發(fā)明具有突變率高、簡單易行的特點。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實施例中S輪PCR反應(yīng)的反應(yīng)流程示意圖。
[0020] 圖中，M1M2M3代表S個突變位點（A)首輪PCR反應(yīng)分別用T7/R M1M2M3和SP6/F M1M2M3兩 對引物進行擴增；度）第二輪PCR反應(yīng)用Fs和Rs引物進行擴增；(C)第S輪PCR反應(yīng)分別 用Ftl/Rs和化2/Fs兩對引物進行擴增；值）變復性后的PCR產(chǎn)物會產(chǎn)生4種產(chǎn)物，其中只 有5'含有（5' -CATG-3')粘性末端序列是目標序列。
[0021] 圖2為本發(fā)明實施例的目標基因序列。
[0022] 圖中，堿基突變?yōu)門GC，對應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸由谷氨酷胺（曲突變?yōu)榘朊摪彼?似
[0023] 圖3為每一輪PGR產(chǎn)物電泳圖。
[0024] 圖4為引物T7和Rs檢測陽性克隆PCR擴增結(jié)果。
【具體實施方式】
[0025] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，W下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步 詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0026] -種構(gòu)建多位點突變重組表達質(zhì)粒的高效方法，包括如下步驟：
[0027] S1、將表達質(zhì)粒PHAT2用雙酶切方法采用兩種限制性內(nèi)切酶化〇1和化〇1酶切產(chǎn) 生帶有粘性末端5' -CATG-3'和5' -AGCT-3'線性片段，回收線性化質(zhì)粒片段備用；
[002引 S2、PCR引物設(shè)計：如表1所示，將Fs和Rs作為目標基因的正向及反向巢氏引 物；將T7和SP6作為表達質(zhì)粒PHAT2閱讀框上下游一對引物；對Fmim2M3和Rmim2M3引物根據(jù) 目標基因突變位點序列進行設(shè)計；Fmim2M3和Rm1M2M3的具體設(shè)計為：Fm1M2M35'序列15個堿基 巧'-.0^0的自為6心雖11-3'）是用于拼接反應(yīng)的，隨后的3個堿基（5'-1￡￡-3'）是突變位 點，F(xiàn)m1M2M33'序列15個堿基是目標基因序列；Rmim2M35'序列依次為互補突變位點（5'-雄A-3') 及15個堿基巧'-M祐.nCTGAT貨QJG-3'）用于拼接反應(yīng)，Rmim2M33'序列15個堿基是目標 基