一種通過流加策略提高搖瓶發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及二十二碳六烯酸的生產(chǎn)，具體涉及一種通過流 加策略提高搖瓶發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 研究發(fā)現(xiàn)，二十二碳六稀酸（22:6n_3,docosahexaenoicacid,DHA)是人腦成分中 主要組成物質(zhì)之一，其含量大約可占人腦脂質(zhì)的10%，由于其在大腦中的存在，在一定程度 上可以提高腦的柔軟性，抑制腦的老化。在胎兒時期，從受精卵在母親子宮內(nèi)分裂開始就需 要DHA，因此，孕婦應(yīng)攝入足量的DHA，以促進(jìn)胎兒大腦的發(fā)育和腦細(xì)胞的增殖?，F(xiàn)在社會， 人們越來越注重孕期DHA的補充，在正常的情況下，一位孕婦每天應(yīng)攝入0. 5~I. 5g DHA， 特別是在胎兒大腦發(fā)育最快的妊娠第4個月至嬰兒出生后1歲末未發(fā)育完成這一重要時 期，DHA的攝入尤為重要。
[0003] 攝入足量的DHA不僅對孕婦及體內(nèi)胎兒發(fā)育有好處，而且嬰幼兒、兒童及青少年 也應(yīng)該進(jìn)行DHA的補充，由于他們正處于接受大量信息的學(xué)習(xí)階段，這對腦細(xì)胞是一種刺 激，補充能保證腦細(xì)胞突觸延長，使神經(jīng)細(xì)胞之間聯(lián)系加強，信息的傳遞更為迅速，大腦功 能增強，記憶力提高。此外，DHA對老年人也有重要的保健功能，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，老年人補充適量 DHA可以延緩大腦萎縮，防止大腦功能衰退和老年性癡呆癥發(fā)生。
[0004]DHA被人譽為"心血管疾病無可比擬的特效品"，其生理保健功能還有很多，如： (1)可以降低血清中甘油三酯生成及從肝臟排出；（2)降低低密度脂蛋白、極低密度脂蛋 白、增加高密度脂蛋白，改變脂蛋白中脂肪酸的組成，從而增加其流動性；（3)增加膽固醇 的排泄，抑制內(nèi)源性膽固醇的合成；(4)可以預(yù)防和治療動脈硬化，對高血壓、心血管疾病 有一定的治療作用，被稱為"血管清道夫"。
[0005] 傳統(tǒng)的DHA來源主要來自深海魚油，現(xiàn)如今，魚油的發(fā)展受到自然環(huán)境、產(chǎn)品質(zhì) 量、生產(chǎn)成本等各方面的限制越來越大，DHA的價格高居不下，尋求廉價的DHA生物資源提 取的可替代的新途徑受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。
[0006] 真菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA是目前國際及國內(nèi)普遍認(rèn)可的生物技術(shù)，利用真菌發(fā)酵生產(chǎn) DHA的研究主要集中在裂殖壺菌Schizochytrium和破囊壺菌Thraustochytrium，裂殖壺菌 是目前工業(yè)上應(yīng)用更為廣泛的DHA生產(chǎn)菌種，該技術(shù)規(guī)?；懂a(chǎn)之后能夠通過利用真菌發(fā) 酵生產(chǎn)DHA可以克服從魚油獲取DHA的不足，能夠人為控制影響因素，保持DHA產(chǎn)量和含量 的穩(wěn)定。
[0007] 裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的研究已經(jīng)取得非常可觀的進(jìn)展，但還存在以下的問題：
[0008] (1)缺之尚廣囷株；
[0009] (2)大多研究型企業(yè)及院校還處在搖瓶及小規(guī)模實驗階段；
[0010] (3)提取工藝有待進(jìn)一步改進(jìn)；
[0011] (4)培養(yǎng)基質(zhì)的成本需要進(jìn)一步降低；
[0012] (5)發(fā)酵工藝需進(jìn)一步優(yōu)化。
[0013] 在裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的工業(yè)化進(jìn)程中，當(dāng)前最迫切的任務(wù)一是能夠篩選出高 產(chǎn)菌株，二是通過發(fā)酵工藝的改變探索最適合裂殖壺菌高產(chǎn)DHA的發(fā)酵條件，攻克此兩點 能夠為工業(yè)化生產(chǎn)的實現(xiàn)提供有力的保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種通過流加策略提高搖瓶 發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法。
[0015] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0016] -種通過流加策略提高搖瓶發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，包括如下 步驟：
[0017] (1)將裂殖壺菌菌種接種至裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，于25~35°C搖床中以 150~250rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行恒溫恒轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20~35h。
[0018] 所述的種子培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖30.Og/L~50.Og/L、酵母抽提物5.Og/L~ 15. Og/L、Na2S0412.Og/L~16.Og/L、MgSO4L8g/L~2. 2g/L、K2SO4O. 60g/L~0? 70g/L、 (NH4)2SO4O. 8g/L~I. 2g/L、CaCl20. 25g/L~0? 26g/L、KH2P04l. 8g/L~2. 2g/L、微量元素溶 液I. 5mL/L~2. 5mL/L;其中，微量元素溶液的配方為：FeSO4 ? 7H20 0? 50g/L~0? 55g/L、 MnCl2 *4H20 0? 82g/L~0? 88g/L、ZnS04 *7H20I. 40g/L~I. 45g/L、CoCl2WH2O0? 005g/L~ 0? 008g/L、NiSO4 ? 6H20 0? 05g/L~0? 07g/L、CuSO4 ? 5H20 0? 5g/L~0? 7g/L、Na2MoO4 ? 2H20 0?008g/L~0? 012g/L。
[0019] (2)將步驟（I)得到的種子液轉(zhuǎn)接到裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，接種體積為培養(yǎng) 基裝液量的5~10%，于25~30°C、150~250rpm條件下進(jìn)行恒溫恒轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16~20h， 測量所得種子液的細(xì)胞干重，若得到的種子液中細(xì)胞干重達(dá)到18~22g/L，則直接進(jìn)行步 驟⑷。
[0020] (3)若步驟⑵得到的種子液中細(xì)胞干重沒達(dá)到18~22g/L，則將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)接 到裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，按照步驟（2)中的方法進(jìn)行培養(yǎng)；重復(fù)該步驟一次或多次至 培養(yǎng)得到的種子液中細(xì)胞干重達(dá)到18~22g/L。
[0021] (4)將上述細(xì)胞干重達(dá)到18~22g/L的種子液以5~10% (V/V)的接種量接種 到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，于28~32°C、125~175rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0022] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖100. 0g/L~120. 0g/L、酵母抽提物2. 5g/ L~3. 5g/L、玉米衆(zhòng)干粉 4. 0g/L~5. 0g/L、谷氨酸鈉 8. 0g/L~9. 0g/L、Na2S04 12. 0g/L~ 16. 0g/L、MgS04I. 8g/L~2. 2g/L、K2S04 0? 60g/L~0? 70g/L、（NH4)2SO4 0? 8g/L~I. 2g/L、 CaCl2 0? 25g/L~0? 26g/L、KH2P04I. 8g/L~2. 2g/L、微量元素溶液I. 5mL/L~2. 5mL/L，微 量元素溶液的配方同上所述。
[0023] (5)發(fā)酵培養(yǎng)30~40h后，待發(fā)酵液中葡萄糖含量降至30g/L以下開始分批流 加葡萄糖溶液，維持發(fā)酵液中葡萄糖含量為30~50g/L，同時在發(fā)酵培養(yǎng)30~40h期間 流加一次濃度為210. 0~320. 0g/L的混合氮源溶液，混合氮源的流加量為搖瓶裝液量的 1/5~1/4,該混合氮源含有酵母抽提物、玉米漿干粉、谷氨酸鈉中的一種或多種；發(fā)酵培養(yǎng) 至80~120h期間時，定期測定發(fā)酵過程葡萄糖消耗速率，待其降至2g/L?h以下，停止葡 萄糖溶液流加，直至剩余葡萄糖耗盡后停止發(fā)酵。
[0024] 步驟（1)中所述的裂殖壺菌菌種優(yōu)選為裂殖壺菌ATCC20888。
[0025] 步驟（1)~（3)中所述的搖瓶的體積優(yōu)選為250mL，裝液量優(yōu)選為50mL。
[0026] 步驟⑷中所述的搖瓶的體積優(yōu)選為lOOOmL，裝液量優(yōu)選為200mL。
[0027] 步驟（5)中所述的葡萄糖溶液的濃度優(yōu)選為700. 0~750.Og/L。
[0028] 步驟（5)中所述的混合氮源溶液中優(yōu)選含有酵母抽提物、玉米漿干粉和谷氨酸 鈉；優(yōu)選的，其中，玉米漿干粉濃度為125. 0~175.Og/L，酵母抽提物濃度為10. 0~20.Og/ L，谷氨酸鈉濃度為75. 0~125. 0g/L。
[0029] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點和效果：本發(fā)明通過流加混合氮源，能夠極大程度提高裂殖 壺菌在搖勻瓶中后期的發(fā)酵水平；通過流加高濃度碳源，能夠極大程度保證裂殖壺菌搖瓶 發(fā)酵中后期對碳源的需求，進(jìn)而能夠提高搖瓶中單批次發(fā)酵強度；通過以上操作，較大程度 地提高了搖瓶發(fā)酵過程中裂殖壺菌生物量的積累、促進(jìn)了菌絲體中DHA的積累。本發(fā)明為 裂殖壺菌的小試、中試及生產(chǎn)提供重要的參考數(shù)據(jù)，對裂殖壺菌的規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)DHA有 著極大的意義。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0031] 實施例1
[0032] 本實施例所用種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖濃度為40g/L、酵母抽提物濃度為 10. 0g/L、Na2S04濃度為 14. 0g/L、MgS04濃度為 2. 0g/L、K2S(V^度為 0? 65g/L、（順4)#04濃度 為I. 0g/L、CaCl2濃度為0. 255g/L、KH2P04濃度為2. 0g/L、微量元素含量為2. 0mL/L。其中， 微量元素溶液的配方為：FeSO4 ? 7H20 0? 5g/L、MnCl2 ? 4H20 0