普魯蘭合成酶、編碼基因、載體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種普魯蘭合成酶、編碼基因、載體及在提高出芽短梗霉胞外普魯蘭 多糖產(chǎn)量中的應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 出芽短梗霉是一種重要的工業(yè)微生物，能夠分泌產(chǎn)生多種工業(yè)酶，例如淀粉酶，葡 萄糖醛酸酶，木聚糖酶和多種胞外蘭多糖，例如聚蘋果酸，葡聚糖和普魯蘭多糖，其中產(chǎn)量 最高的普魯蘭多糖具有良好的生物安全性，生物相容性和延展性，無色，無味，無接觸刺激， 可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥材料，食品包裝，化妝品和農(nóng)業(yè)環(huán)保領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用潛力。
[0003] 出芽短梗霉是普魯蘭多糖的主要工業(yè)生產(chǎn)菌株，高產(chǎn)菌株的普魯蘭多糖生產(chǎn)能力 能夠達到80g/L發(fā)酵液。出芽短梗霉具有很強的胞外普魯蘭多糖合成能力，與其合成途徑 酶基因有密切關(guān)系。但是關(guān)于出芽短梗霉多糖的合成途徑及其相關(guān)基因卻始終未有準確闡 明。根據(jù)已有的研究結(jié)果我們歸納出如下結(jié)論：在短梗霉細胞中UDPG是所有多糖合成的 共同前體分子，UDPG經(jīng)過不同的糖基轉(zhuǎn)移酶和聚合酶催化，聚合成不同種類的多糖，例如普 魯蘭多糖，然后多糖分子經(jīng)過細胞膜的運輸通道，被運輸?shù)郊毎?。但是到底哪些酶參與了 普魯蘭多糖的聚合途徑卻始終沒有詳細研究。到目前為止沒有檢索到任何分子水平的關(guān)于 短梗霉來源的普魯蘭多糖合成途徑相關(guān)酶和合成機制的研究成果。本發(fā)明首次從出芽短梗 霉中克隆得到普魯蘭多糖合成的途徑的關(guān)鍵酶-普魯蘭合成酶的編碼基因，利用大腸桿菌 系統(tǒng)重組表達蛋白，通過普魯蘭多糖體外合成實驗，驗證了該酶對于反應(yīng)體系的普魯蘭多 糖合成具有促進作用。本發(fā)明通過出芽短梗霉基因敲出實驗，證明普魯蘭合成酶在普魯蘭 多糖的生物合成是不可缺少的，該酶基因的缺失將導致短梗霉普魯蘭多糖合成能力的徹底 喪失。本發(fā)明通過代謝工程技術(shù)，在短梗霉中過表達普魯蘭合成酶，顯著提高了菌株普魯蘭 多糖的合成產(chǎn)量。本發(fā)明提供的出芽短梗霉普魯蘭合成酶的研究成果，將有助于分子水平 理解普魯蘭多糖的合成機制，開展短梗霉高產(chǎn)普魯蘭多糖的代謝工程研究具有重要參考價 值。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種能夠提高出芽短梗霉胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量的酶，即普魯蘭 合成酶，同時提供了普魯蘭合成酶編碼基因及大腸桿菌重組載體以及普魯蘭合成酶在提高 出芽短梗霉胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種普魯蘭合成酶，所述酶的氨基酸序列為SEQIDNO. 1所示。
[0007] 本發(fā)明還提供一種所述普魯蘭合成酶編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列為 SEQIDN0. 2所示，所述編碼基因的cDNA序列為SEQIDN0. 3所示。
[0008] 本發(fā)明涉及一種由所述普魯蘭合成酶編碼基因構(gòu)建的大腸桿菌重組載體。所述載 體的構(gòu)建是將SEQIDN0. 3所示cDNA序列連入pET28a載體的Ndel和Xhol酶切位點而獲 得。
[0009] 本發(fā)明涉及一種所述普魯蘭合成酶的基因敲除載體pAPK019pul。所述載體的構(gòu)建 是將SEQIDN0. 4和SEQIDN0. 5所示上下游同源臂序列融合于SEQIDN0. 6所示的潮霉 素表達盒序列兩端，組成的融合基因片段，克隆到PMD18-T而獲得。
[0010] 本發(fā)明涉及一種用于所述普魯蘭合成酶基因過表達載體，pAPE16pul。所述載體的 構(gòu)建是將3￡〇10勵.7所示188扣嫩基因序列融合于5￡〇10勵.6所示的潮霉素表達盒序 列5'端，再將SEQIDN0. 8所示18srDNA基因序列融合于SEQIDN0. 9所示的普魯蘭合成 酶基因表達盒序列3'端，最后將兩個融合基因片段，首尾相連后，克隆到pMD19-T而獲得。
[0011] 本發(fā)明還涉及一種所述普魯蘭合成酶在提高出芽短梗霉胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量中 的應(yīng)用，所述應(yīng)用是將普魯蘭合成酶編碼基因轉(zhuǎn)化入出芽短梗霉中，從而提高出芽短梗霉 胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量，具體所述的應(yīng)用是將普魯蘭合成酶整合型過表達載體pAPE16pul， 使用PCR的方法獲得線性化片段后電擊轉(zhuǎn)化入出芽短梗霉中，從而獲得胞外多糖產(chǎn)量顯著 提高的出芽短梗霉工程菌。優(yōu)選所述出芽短梗霉為出芽短梗霉NRRLY-2311-l(出芽短梗 霉NRRLY-2311-1 公開文南犬信息Optimizationofhighmolecularweightpullulan productionbyAureobasidiumpullulansinbatchfermentations.Biotechnology Progress. 2002May-Jun； 18 (3):675-8.)〇
[0012] 本發(fā)明的意義在于首次從出芽短梗霉中克隆了參與胞外普魯蘭多糖合成的普魯 蘭合成酶編碼基因的cDNA和核苷酸序列。普魯蘭合成酶經(jīng)過大腸桿菌重組表達純化后的 重組蛋白，經(jīng)過活性測定，能夠在添加了UDPG，蔗糖，ATP和短梗霉細胞裂解液的體外合成 體系中促進普魯蘭多糖的合成。上述性質(zhì)這說明這個酶是一個全新的酶。首次使用基因工 程技術(shù)敲除了出芽短梗霉中的普魯蘭合成酶，敲除菌株合成普魯蘭多糖的能力全部消除， 說明普魯蘭合成酶在普魯蘭多糖合成過程中具有不可替代的作用。首次利用基因工程技術(shù) 在出芽短梗霉原始菌中過表達普魯蘭合成酶，重組短梗霉搖瓶發(fā)酵普魯蘭多糖的產(chǎn)量能夠 提高44%。本發(fā)明為利用代謝工程技術(shù)改造出芽短梗霉的胞外普魯蘭多糖合成途徑提供技 術(shù)基礎(chǔ)和方法指導。 (四）【附圖說明】
[0013] 圖1普魯蘭合成酶的大腸桿菌重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖和Western 圖，M:TAKARA蛋白分子量標準（low)，l:BL21(DE3)-28aO.ImMIPTG25°C誘導， 2:8121(0￡3)-?皿-28&未誘導破碎后全細胞，3:8121(0￡3)-卩皿-28&0.111111?丁6 251€ 誘導破碎后全細胞，4 :BL21 (DE3) -PUL-28a0.ImMIPTG25 °C誘導破碎后上清，5 : BL21 (DE3) -PUL-28a0?ImMIPTG25°C誘導破碎后沉淀，6 :BL21 (DE3) -PUL-28a0?ImM IPTG25°C誘導純化；上樣量5yL;7 :Western蛋白marker，8 :純化蛋白的western。
[0014] 圖2普魯蘭合成酶的活性測定體系催化產(chǎn)物的TLC圖譜，1是標準葡萄糖樣品，2 是標準麥芽三糖樣品，3是標準普魯蘭多糖樣品，4是反應(yīng)體系產(chǎn)物。
[0015] 圖3帶有普魯蘭合成酶基因組同源臂序列的短梗霉基因敲除載體pAPK019-pul示 意圖。
[0016] 圖4帶有普魯蘭合成酶cDNA基因片段的短梗霉整合表達載體pAPE16-pul示意 圖。
[0017] 圖5敲除菌株，原始菌株，過表達菌株普魯蘭產(chǎn)量比較柱狀圖。 (五）【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0019] 實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指 南（第三版，J.薩姆布魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0020] 本發(fā)明按照SMARTcDNA文庫構(gòu)建方法，成功克隆到了普魯蘭合成酶全長基因，構(gòu) 建該蛋白的原核表達載體，并純化重組蛋白研究其酶學特性及功能驗證。
[0021] 實施例1、普魯蘭合成酶編碼基因的克隆
[0022] 出芽短梗霉高產(chǎn)多糖期cDNA文庫構(gòu)建，完全按照ClontechSMARTcDNA文庫構(gòu)建 試劑盒說明書所述方法，獲得1XK^pfu/ml滴度的cDNA文庫。
[0023] 從文庫中隨機挑選2000個克隆，送測序，測序引物Ml3pucF和Ml3pucR。
[0024] M13pucF:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'（SEQIDNO. 10)
[0025] M13pucR:5,-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'（SEQIDNO. 11)
[0026] 通過序列分析，篩選豐度在10個以上的克隆，獲得8個新基因，編號為1-8。其中 通過Blast同源序列和結(jié)構(gòu)域比對，其中7個基因都可以歸入相關(guān)蛋白家族，6號基因沒有 明確保守結(jié)構(gòu)域，我們將其編號為pul基因，預(yù)測為普魯蘭合成酶基因，核苷酸序列為SEQ IDN0. 2所示，編碼的氨基酸序列為SEQIDNO. 1所示。
[0027] (2)構(gòu)建普魯蘭合成酶（pul基因）的大腸桿菌重組表達載體
[0028] 用酵母總RNA提取試劑盒（購自BI0SCI公司，貨號為RT001)提取出芽短梗霉NRRL