一種生物柴油原料油的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和可再生能源技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說，涉及一種生物柴油原 料油的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物柴油又稱為生質(zhì)柴油，是用未加工過的或者使用過的植物油、動物脂肪、餐飲 垃圾油等為原料油，通過酯交換工藝制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。隨著化石 燃料的逐漸枯竭以及環(huán)境問題的不斷惡化，作為清潔環(huán)保的可再生能源，生物柴油受到越 來越多的關(guān)注。
[0003] 現(xiàn)目前，主要用來制作生物柴油的原料包括植物油下腳料，城市地溝油、泔水油， 微藻油等，植物油下腳料及城市地溝油、泔水油等廢棄油脂用作生物柴油的原料油來制取 生物柴油的方式大大減少了對環(huán)境及人類健康的危害，同時又可以變廢為寶，但是，植物油 下腳料這種作為生物柴油的原料油資源總量有限，遠遠不能滿足生物柴油產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展對 原料的需要；城市地溝油、泔水油油脂資源成分復(fù)雜，來源不穩(wěn)定，導(dǎo)致以其為原料生產(chǎn)的 生物柴油產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定；通過微藻來獲取生物柴油的方法具有較大的發(fā)展?jié)摿?，因為?清潔而又環(huán)保的生產(chǎn)技術(shù)被大家廣泛關(guān)注，但是現(xiàn)階段由于其生長周期長達5~10天，生 物量也僅能達到20-100克每升，含油量約為20%~50%，且發(fā)酵過程中需要維持光照和通 入二氧化碳，從而致使生產(chǎn)成本大大增加。因此研究、開發(fā)和利用新型生物柴油原料油資 源，是生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的核心問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種生物柴油原料油的生產(chǎn)方法，克服了 裂殖壺菌只能用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的問題。
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于，提供一種生物柴油原料油的生產(chǎn)方法，克服 了現(xiàn)有發(fā)酵工藝生產(chǎn)生物柴油原料油的周期長、產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜等缺點。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案在于：提供一種生物柴油原料油的生產(chǎn)方 法，所述方法使用裂殖壺菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)油脂，得到的所述油脂中飽和脂肪酸大于 50%〇
[0007] 在本發(fā)明的方法中，得到的所述油脂中飽和脂肪酸大于70%。
[0008] 在本發(fā)明的方法中，所述方法包括以下步驟：
[0009]S1、將裂殖壺菌的菌種使用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)成種子液；
[0010]S2、將種子液按照體積百分比3%~10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 28°C至40°C，通氣3m3/h~15m3/h并保持攪拌；
[0011] S3、發(fā)酵培養(yǎng)20h~24h后，控制發(fā)酵溫度在30°C~40°C，通氣8m3/h~16m3/h， 發(fā)酵過程中流加補充碳源、氮源；
[0012] S4、發(fā)酵培養(yǎng)80h~120h后，收集菌體。
[0013] 在本發(fā)明的方法中，所述步驟SI中使用的種子培養(yǎng)基包括：葡萄糖40.Og/L~ 60.Og/L，酵母粉 5.Og/L~10.Og/L，蛋白胨I.Og/L~5.Og/L，硫酸鎂 0. 5g/L~2.Og/L，碳 酸氫 1丐 0. 2g/L~I. 0g/L，磷酸二氫鉀I. 0g/L~3. 0g/L，氯化鈉I. 0g/L~5. 0g/L。
[0014] 在本發(fā)明的方法中，所述步驟SI中所述種子液的培養(yǎng)條件為：向種子培養(yǎng)基中 接入裂殖壺菌，接種量體積百分比為2%~5%，在搖床轉(zhuǎn)速180rpm~300rpm、培養(yǎng)溫度 32°C~35°C的條件下進行搖瓶培養(yǎng)20h~24h，獲得種子液。
[0015] 在本發(fā)明的方法中，所述步驟S2中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括：葡萄糖80. 0g/L~ 150. 0g/L，玉米漿 10. 0g/L~30. 0g/L，谷氨酸鈉 8. 0g/L~20. 0g/L，硫酸鎂 0? 5g/L~3.Og/ L，碳酸氫|丐I. 0g/L~5. 0g/L，磷酸二氫鉀I. 0g/L~3. 0g/L，硝酸鈉 5. 0g/L~10. 0g/L。
[0016] 在本發(fā)明的方法中，所述步驟S3中流加補充的所述碳源為葡萄糖和/或糖蜜，流 加補充的所述氮源為玉米漿和/或谷氨酸鈉，維持發(fā)酵液中碳源濃度為20. 0g/L~50.Og/ L，氮源濃度為3. 0g/L~5. 0g/L。
[0017] 在本發(fā)明的方法中，所述培養(yǎng)溫度為30°C至35°C，通氣速度為IOm3A~12m3/h。
[0018] 在本發(fā)明的方法中，所述步驟S4中收集菌體的方式包括：自然沉降、離心、膜分離 中的任意一種及其組合。
[0019] 實施本發(fā)明的有益效果在于，發(fā)酵過程中不需要光照和通入二氧化碳，只需控制 發(fā)酵溫度、通氣條件并流加補料，使其在3~5天的發(fā)酵周期內(nèi)，生物量可達120g/L~ 150g/L，油脂含量超過75 %，具有效率高，生產(chǎn)成本低，且易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0020] 下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范 圍。
[0021] 生物柴油作為一種清潔環(huán)保的可再生能源，受到越來越多的關(guān)注，但是受制于原 料油的來源和價格，生物柴油的應(yīng)用推廣進度緩慢，因為植物油下腳料、地溝油、泔水油等 不僅制得的生物柴油產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，而且回收油的資源總量有限，遠遠不能滿足生物柴 油產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展對原料的需要。發(fā)酵培養(yǎng)微藻可以連續(xù)大量的提供生物柴油原料油，但是 其高昂的成本使得根本無法商業(yè)化使用。本發(fā)明的主要創(chuàng)新點在于：使用裂殖壺菌作為培 養(yǎng)菌種，通過綜合優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，能在較短的發(fā)酵周期內(nèi)獲得較高的生物量，油脂 含量高，且獲得的油脂種類以飽和脂肪酸為主，克服現(xiàn)有工藝都使用裂殖壺菌生產(chǎn)不飽和 脂肪酸的問題，裂殖壺菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程無需光照和通入二氧化碳，培養(yǎng)工藝簡單。
[0022] 本發(fā)明生物柴油原料油的生產(chǎn)方法，使用裂殖壺菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)油脂，得到 的所述油脂中飽和脂肪酸大于50%。優(yōu)選的，得到的油脂中飽和脂肪酸大于70%。裂殖 壺菌（Schizochytriumsp),為富含油脂的大型海洋真菌,被廣泛的應(yīng)用于生產(chǎn)多不飽和脂 肪酸例如二十二碳六烯酸（DHA)等，但是以生產(chǎn)多不飽和脂肪酸為目的的發(fā)酵培養(yǎng)過程其 生物量不高，一般為30-80克每升，油脂含量40 % -50 %，不飽和脂肪酸含量占所得油脂的 60%以上，目標產(chǎn)物如DHA含量占所得油脂的20-50%。這樣的發(fā)酵工藝控制過程，雖然由 于DHA的價格較高可以獲得較好的經(jīng)濟價值，但是總油脂得率不高使其無法作為生產(chǎn)生物 柴油原料油的方法。本發(fā)明通過優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)的控制條件，使得發(fā)酵周期縮短、發(fā) 酵成本降低的同時，產(chǎn)物中不飽和脂肪酸的含量大大降低，飽和脂肪酸的含量大大提高至 超過50 %，甚至提高至70 %，同時使得生物量和油脂量都顯著提高，生物量可達120-150克 每升，油脂含量在75%以上。
[0023] 優(yōu)選的，本發(fā)明的生物柴油原料油的生產(chǎn)方法包括以下步驟：
[0024]S1、將裂殖壺菌的菌種使用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)成種子液。將保藏的裂殖壺菌的活化， 例如采用傳代保藏的斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)等，使用固體培養(yǎng)基一次活化后用液體培養(yǎng)基二 次活化或者液體培養(yǎng)基活化；采用長時間冷凍干燥保藏例如液氮保藏的，使用固體培養(yǎng)基 一次活化后用液體培養(yǎng)基二次活化或者液體培養(yǎng)基一次活化甚至二次活化；采用短時間冷 凍干燥的例如冷凍甘油管保藏的，也可以直接置于常溫，甘油管融化后即活化完成。將活 化后的種子接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)成種子液備用。優(yōu)選的，使用的種子培養(yǎng)基包括：葡萄糖 40.Og/L~60.Og/L，酵母粉 5.Og/L~10.Og/L，蛋白胨I.Og/L~5.Og/L，硫酸鎂 0? 5g/L~ 2. 0g/L，碳酸氫|丐 0. 2g/L~I. 0g/L，磷酸二氫鉀I. 0g/L~3. 0g/L，氯化鈉I. 0g/L~5.Og/ L。優(yōu)選的，培養(yǎng)條件為：向種子培養(yǎng)基中接入裂殖壺菌，接種量體積百分比為2%~5%，在 搖床轉(zhuǎn)速180rpm~300rpm、培養(yǎng)溫度32°C~35°C的條件下進行搖瓶培養(yǎng)20h~24h。
[0025]S2、將種子液按照體積百分比3%~10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 28°C至40°C，通氣3m3/h~15m3/h并保持攪拌，發(fā)酵過程中流加補充碳源、氮源。優(yōu)選的， 所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括：葡萄糖80. 0g/L~150. 0g/L，玉米漿10. 0g/L~30. 0g/L，谷氨 酸鈉8. 0g/L~20. 0g/L，硫酸鎂0. 5g/L~3. 0g/L，碳酸氫|丐I. 0g/L~5. 0g/L，磷酸二氫鉀 I. 0g/L~3. 0g/L，硝酸鈉 5. 0g/L~10. 0g/L。
[0026]S3、發(fā)酵培養(yǎng)20h~30h后，控制發(fā)酵溫度在30°C~40°C，通氣8m3/h~16m3/h，發(fā) 酵過程中流加補充碳源、氮源。20h~30h后，菌體生長進入穩(wěn)定期，規(guī)?；a(chǎn)過程中主要 表現(xiàn)為溶氧度不再明顯下降，穩(wěn)定期為富集油脂的主要時期，此時發(fā)酵已經(jīng)經(jīng)過較長時間， 需要流加補充碳源、氮源以補充油脂合成中所需要的營養(yǎng)。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)溫度為30°C至 35°C，通氣速度為IOm3A~12m3/h。優(yōu)選的，流加補充的所述碳源為葡萄糖和/或糖蜜，流 加補充的所述氮源為玉米漿和/或谷氨酸鈉，維持發(fā)酵液中碳源濃度為20. 0g/L~50.Og/ L，氮源濃度為3. 0g/L~5. 0g/L，例如，具體生產(chǎn)實踐中，從發(fā)酵進行第30小時開始，每隔8 小時補料一次，按照每次每升發(fā)酵液補充碳源25. 0g、氮源2g，基本可以維持上述碳源和單 元濃度。當然也可以采取定時取樣檢測的方式，在碳源濃度低于20. 0g/L時流加補充的碳 源，在氮源濃度低于3g/L時流加補充的氮源。
[0027]S4、發(fā)酵培養(yǎng)80h~120h后，收集菌體。培養(yǎng)時間達到80h~120h，油脂合成基 本完成，應(yīng)該菌體進入衰亡期之前停止發(fā)酵過程，收集菌體以提取油脂。收集菌體的方式包 括：自然沉降、離心、膜分離中的任意一種及其組合。
[0028] 實施例1
[0029] 生物柴油原料油的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：
[0030] (1)配制種子培養(yǎng)基，滅菌備用
[0031] 種子培養(yǎng)基包括：葡萄糖40. 0g/L，酵母粉5. 0g/L，蛋白胨I. 0g/L，硫酸鎂0. 5g/L， 碳酸氫鈣〇. 2g/L，磷酸二氫鉀I. 0g/L，氯化鈉I. 0g/L。
[0032] (2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌備用
[0033] 發(fā)酵培養(yǎng)基包括：葡萄糖80.Og/L，玉米漿10.Og/L，谷氨酸鈉8.Og/L，硫酸鎂 0. 5g/L，碳酸氫|丐I.Og/L，磷酸二氫鉀I.Og/L，硝酸鈉5.Og/L。
[0034] (3)制備種子液
[0035] 向種子培養(yǎng)基中接入裂殖壺菌，接種量體積百分比為2%，在搖床轉(zhuǎn)速300rpm、培 養(yǎng)溫度28°C的條件下進行搖瓶培養(yǎng)24h，獲得種子液。
[0036] ⑷發(fā)酵培養(yǎng)
[0037] 將種子液按照體積百分比3 %接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度40°C，通氣 15m3/h并保持攪拌，發(fā)酵培養(yǎng)24h后，控制發(fā)酵溫度在4(TC，通氣16m3/h，發(fā)酵過程中流加 補充葡萄糖作為碳源和玉米楽作為氮源，維持發(fā)酵液中碳源濃度為20. 0g/L~50. 0g/L，氮 源濃度為3. 0g/L~5. 0g/L。
[0038] (5)收集菌體、分離油脂
[0039] 發(fā)酵培養(yǎng)80h后，收集菌體，干燥菌體后采用溶劑提取的方式萃取油脂，結(jié)果如表 1所示，其中生物量是單位體積培養(yǎng)液獲得的細胞干重，油脂含量是分離所得的油脂占細胞 干重的質(zhì)量百分比，飽