一種大規(guī)模培養(yǎng)nkt細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]NKT細(xì)胞（自然殺傷T細(xì)胞）是繼自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、T淋己細(xì)胞、B淋己細(xì) 胞之后又一類新型的T淋己細(xì)胞，屬于第4類免疫細(xì)胞。NKT細(xì)胞主要分布在骨髓、肝和胸 腺，在脾、淋己結(jié)和外周血中也有少量存在。NKT細(xì)胞絕大多數(shù)為CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞， 少數(shù)為CD4+單陽(yáng)性T細(xì)胞。NKT細(xì)胞表面TCR可識(shí)別不同祀細(xì)胞表面CDl分子提呈的共有 楠脂類和糖脂類抗原，且不受血IC限制。NKT細(xì)胞最佳刺激效應(yīng)物是a-半乳糖神經(jīng)酷胺 (a-Galcer)，是一類來(lái)源于海綿體或共生微生物的提取物。
[0003] NKT細(xì)胞的主要生物學(xué)功能是細(xì)胞毒和免疫調(diào)節(jié)作用。NKT細(xì)胞的細(xì)胞毒作用表 現(xiàn)在NKT細(xì)胞可組成性表達(dá)IL-12IL-2和IFN-丫等細(xì)胞因子的受體。在相應(yīng)抗原或細(xì)胞因 子作用下，NKT細(xì)胞活化，并通過(guò)分泌穿孔素使某些病毒感染、胞內(nèi)寄生菌感染的祀細(xì)胞和 腫瘤祀細(xì)胞發(fā)生溶解破壞；也可通過(guò)表達(dá)經(jīng)化s/化SL途徑使上述祀細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡。 而NKT細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在活化NKT細(xì)胞可分泌比-4和IFN- 丫等細(xì)胞因子。比-4 可誘導(dǎo)CD4+ThO細(xì)胞向CD4+Th2細(xì)胞分化，參與體液免疫應(yīng)答或誘導(dǎo)B細(xì)胞發(fā)生I姐類別 轉(zhuǎn)換，參與速發(fā)型超敏反應(yīng)；IFN-丫與比-12協(xié)同作用，可使CD4+ThO細(xì)胞向CD4+Thl細(xì)胞 分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外NKT細(xì)胞還可分泌多種趨化性細(xì)胞因子如MCP-Ia、MIP-e1 等參與炎癥反應(yīng)。
[0004] 近幾年在其表型特征、分布及發(fā)育、免疫學(xué)效應(yīng)及與疾病關(guān)系、腫瘤治療和自身免 疫性疾病治療等方面的研究有了很大的發(fā)展?，F(xiàn)有研究表明，NKT細(xì)胞在肝炎、脂肪肝等肝 病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，總之，NKT細(xì)胞作為一類新型的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在癌癥抗腫 瘤、抗感染、自身免疫性疾病等治療中具有遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景。 陽(yáng)〇化]目前NKT細(xì)胞的培養(yǎng)主要是直接添加細(xì)胞因子誘導(dǎo)純化刺激細(xì)胞增殖或通過(guò)篩 選特定細(xì)胞株共同培養(yǎng)刺激細(xì)胞的增殖，使分離外周血得到的PBMC中NKT細(xì)胞純化增殖。 但上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量少，操作繁瑣、效率低。而效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的多少，直接影響 了殺傷率，也就影響到各種疾病的治療效果。此外還可通過(guò)篩選癌癥細(xì)胞株福照后誘導(dǎo)培 養(yǎng)NKT細(xì)胞。但此法有具有一定的安全隱患，如福照不完全，可能給患者引入新的癌細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種大規(guī)模培養(yǎng)NKT 細(xì)胞的方法。采用本發(fā)明所述大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法能刺激NKT細(xì)胞的大量增殖，高 效簡(jiǎn)單，安全無(wú)害。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 一種大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
[0009] A、用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基重懸PBMC，加入鐵皮石解素和自體血 清；
[0010]B、將重懸后的PBMC接種到含有成熟DC細(xì)胞的誘導(dǎo)MT細(xì)胞的培養(yǎng)板中，37°C、 5%C〇2培養(yǎng)箱中解育；
[0011] C、解育5天后，將培養(yǎng)板中誘導(dǎo)的NKT細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)到第14 天收集細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法步驟A在培養(yǎng)基中添加鐵皮石解素和自 體血清。自體血清可W為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且安全性高。而鐵皮 石解素的添加不僅能促進(jìn)NKT細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，同時(shí)具有輔助治療作用，且安全無(wú)毒副 作用。
[001引其中，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法步驟A中所述 加入鐵皮石解素的終濃度為2mg/mL~12mg/血。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法步驟A中所述自體 血清的加入量為含有IL-2和IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基的lOv/v%。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)MT細(xì)胞的方法步驟A重懸后的 PBMC的細(xì)胞密度為0. 5X1〇6個(gè)/血~1X10 6個(gè)/mL。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明大規(guī)模培養(yǎng)MT細(xì)胞的方法步驟A中所述RPMI1640培 養(yǎng)基中比-2的濃度為lOOU/mL~lOOOU/mL，比-15的濃度為50ng/mL~200ng/mL。
[0017] 本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)MT細(xì)胞的方法步驟B采用成熟DC細(xì)胞固定在培養(yǎng)板 上與PBMC共同培養(yǎng)誘導(dǎo)NKT細(xì)胞，提供了相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)提高了安全性。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法中步驟B所述含有 成熟DC細(xì)胞的誘導(dǎo)NKT細(xì)胞的培養(yǎng)板的制備方法為用含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培 養(yǎng)基重懸PBMC于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換一次液，第5天加入腫瘤抗原，第 6天加入TNF-a，第7天收集成熟的DC細(xì)胞，在37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中鋪板培養(yǎng)。
[0019] 其中，在一些實(shí)施方案中，所述含有成熟DC細(xì)胞的誘導(dǎo)NKT細(xì)胞的培養(yǎng)板的制備 方法中所述含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培養(yǎng)基中GM-CSF和IL-4的濃度均為200U/ 血~800U/mL。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，所述含有成熟DC細(xì)胞的誘導(dǎo)MT細(xì)胞的培養(yǎng)板的制備方法中 所述腫瘤抗原的工作濃度為20Jig/mL~80Jig/mL。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，所述含有成熟DC細(xì)胞的誘導(dǎo)MT細(xì)胞的培養(yǎng)板的制備方法中 所述TNF-a的工作濃度為200U/mL~800U/mL。
[0022] 在一些具體實(shí)施方案中，所述鋪板培養(yǎng)的時(shí)間為化。
[0023] 本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法中步驟C將培養(yǎng)板中誘導(dǎo)的NKT細(xì)胞轉(zhuǎn) 入細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)具體為每隔2天進(jìn)行補(bǔ)液，補(bǔ)液前保證細(xì)胞的 密度不大于3XIO6個(gè)/mU補(bǔ)液后保證細(xì)胞密度為0. 5X10 6個(gè)/mL~1X10 6個(gè)/mL。
[00巧]其中，所述補(bǔ)液成分與步驟A完全相同。即含有IL-2、比-15、鐵皮石解素和自體血 清的RPMI1640培養(yǎng)基，所述RPMI1640培養(yǎng)基中IL-2的濃度為lOOU/mL~lOOOU/mL，比-15 的濃度為50ng/mL~200ng/mU所述鐵皮石解素的終濃度為2mg/mL~12111旨/111以所述自體 血清的加入量為含有IL-2和IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基的lOv/v%。
[0026] 本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)MT細(xì)胞的方法還包括PBMC分離的步驟。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法采用淋己細(xì)胞分離 管分離PBMC，分離得到的PBMC更多，且紅細(xì)胞少，減少后期紅細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，所述PBMC分離的步驟具體為抽取外周血，用生理鹽水按1:1 的比例稀釋，緩慢的加到Ficoll淋己細(xì)胞分離液上，SOOg離屯、20min;離屯、結(jié)束后，抽取單 核球（PBMC)條帶層于離屯、管中，用生理鹽水定容后400g離屯、IOmin;將上述離屯、的PBMC再 次 400g離屯、lOmin。
[0029] 本發(fā)明所述大規(guī)模培養(yǎng)MT細(xì)胞的方法用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基 重懸PBMC，加入鐵皮石解素和自體血清；將重懸后的PBMC接種到含有成熟DC細(xì)胞的誘導(dǎo) NKT細(xì)胞的培養(yǎng)板中，37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中解育；解育5天后，將培養(yǎng)板中誘導(dǎo)的NKT細(xì)胞 轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)到第14天收集細(xì)胞。本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)單，安全無(wú)害。 實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明所述大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞的方法能刺激NKT細(xì)胞的大量增殖，并且培 養(yǎng)的NKT細(xì)胞細(xì)胞活率高，對(duì)K562細(xì)胞的殺傷能力明顯增強(qiáng)。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0031] 圖1示實(shí)施例3中A組培養(yǎng)方法培養(yǎng)的P2代NKT細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá) 結(jié)果圖，其中圖a為FSC及SSC表達(dá)情況圖，圖b為CD56及CD3表達(dá)情況圖；
[0032] 圖2示實(shí)施例3中B組培養(yǎng)方法