一種檢測(cè)癌癥標(biāo)志物微小核糖核酸的試劑盒的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及脫氧核糖核酸(簡(jiǎn)稱DNA)循環(huán)放大技術(shù)，具體地說(shuō)是利用四螺旋結(jié)構(gòu)DNA的循環(huán)放大技術(shù)對(duì)癌癥標(biāo)志物微小核糖核酸(以下簡(jiǎn)稱MicroRNA)和癌細(xì)胞內(nèi)MicroRNA進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)識(shí)別和免疫檢測(cè)的試劑盒及測(cè)試方法。
[0002]【背景技術(shù)】MicroRNA是動(dòng)物和植物中普遍存在的一類最小的功能性編碼RNA，內(nèi)生的、長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的單鏈小分子，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。它對(duì)于深入探討疾病發(fā)生機(jī)制及疾病診斷、基因治療藥物的開(kāi)發(fā)都具有重大意義。MicroRNA研究連續(xù)被《Science》雜志評(píng)為年度十大科技之一、年度重大突破。MicroRNA通過(guò)基因沉默機(jī)制，調(diào)控細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化及凋亡等關(guān)鍵的生命過(guò)程，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)microRNA的表達(dá)水平與人類重大疾病，尤其是癌癥，密切相關(guān)。因此，對(duì)動(dòng)物和人體內(nèi)MicroRNA的檢測(cè)在癌癥診斷中起著非常重要的作用。
[0003]癌癥早期患者血清中腫瘤標(biāo)志物MicroRNA濃度僅為10 11 Μ - 10 15 Μ，目前的臨床免疫測(cè)定法能測(cè)定的最低濃度僅為10 12 Μ，無(wú)法滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)早期診斷的要求。目前科研工作者重點(diǎn)研發(fā)了基于熒光、電化學(xué)和表面等離子共振的生物傳感器，已經(jīng)取得了一些的進(jìn)展。而SERS檢測(cè)技術(shù)以高靈敏度、光譜選擇性、測(cè)定快、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)成為癌癥疾病分析檢測(cè)的一個(gè)非常有前景的研究領(lǐng)域。此外，表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)技術(shù)具有制樣簡(jiǎn)單、非入侵和無(wú)損等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。拉曼信號(hào)分子標(biāo)記物不會(huì)自猝滅和光漂白，這樣就可以通過(guò)增加探針上染料分子的個(gè)數(shù)和提高光譜累積時(shí)間來(lái)增強(qiáng)拉曼信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度。SERS檢測(cè)手段具有背景低、有效避免光致褪色、有效增強(qiáng)分子的拉曼強(qiáng)度、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到了科學(xué)界的關(guān)注，在癌癥疾病分析檢測(cè)領(lǐng)域中具有很好的應(yīng)用潛力。
[0004]作為一種納米級(jí)別的分子，DNA以其自身的可編程性、結(jié)構(gòu)的多樣性和變化的可控性等諸多優(yōu)點(diǎn)而活躍于納米科學(xué)、生物科學(xué)和材料科學(xué)。利用堿基的精確配對(duì)和序列可設(shè)計(jì)的特性，可以設(shè)計(jì)具有信號(hào)放大功能的DNA循環(huán)網(wǎng)絡(luò)，將DNA循環(huán)放大方法引入試劑盒生物傳感分析中，具有消耗樣品量少、快速、靈敏的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于DNA、細(xì)胞、生物分子和胚胎的檢測(cè)。將DNA反應(yīng)設(shè)計(jì)成可以自發(fā)循環(huán)的過(guò)程，從而能夠?qū)z測(cè)信號(hào)的放大，有效提高了對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)限，同時(shí)減少對(duì)被樣品的消耗量。因此，選擇設(shè)計(jì)合適的信號(hào)探針、循環(huán)放大反應(yīng)、信號(hào)源是關(guān)鍵。自從2000年發(fā)現(xiàn)癌癥疾病MicroRNA突變以來(lái)，對(duì)體內(nèi)MicroRNA的檢測(cè)在不斷的開(kāi)展，并取得了一定的進(jìn)展。然而，操作簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏性高地檢測(cè)體內(nèi)MicroRNA的方法一直是人們所關(guān)注并不斷追求的。
[0005]本發(fā)明的試劑盒設(shè)計(jì)成以癌癥標(biāo)志物MicroRNA的適體識(shí)別引發(fā)，通過(guò)與四螺旋結(jié)構(gòu)DNA的雜交以及DNA剪切-聚合反應(yīng)循環(huán)實(shí)現(xiàn)對(duì)SERS檢測(cè)信號(hào)的放大，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥標(biāo)志物MicroRNA及癌細(xì)胞內(nèi)MicroRNA高靈敏和高特異選擇性的識(shí)別和檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)癌癥標(biāo)志物MicroRNA及癌細(xì)胞內(nèi)MicroRNA的試劑盒，該試劑盒操作程序簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異選擇性好，可大大地減少假陽(yáng)性的誤診，適用于各種動(dòng)物和人體內(nèi)的MicroRNA的快速檢測(cè)。
[0007]本發(fā)明中試劑盒的組成為:四螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子探針、聚合酶、切刻內(nèi)切酶、緩沖液，SERS信號(hào)探針。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:1.合成四螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子探針:它包含三個(gè)功能部分:負(fù)載特殊設(shè)計(jì)的目標(biāo)物識(shí)別區(qū)域，引發(fā)循環(huán)放大反應(yīng)的觸發(fā)區(qū)域，聚合-剪切放大反應(yīng)的模板區(qū)域。設(shè)計(jì)三條DNA序列(序列一、二、三)，序列一為含有MicroRNA的雜交互補(bǔ)DNA序列；序列二為與序列三部分互補(bǔ)的序列，為聚合-剪切放大反應(yīng)的模板；序列三為一端修飾氨基，使其共軛連接在羧基修飾的磁珠上，并且其序列部分可以與序列一和序列二互補(bǔ)；三條DNA序列通過(guò)雜交結(jié)合在一起，并通過(guò)序列三上的氨基與羧基修飾的磁珠結(jié)合從而形成四螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子探針。
[0009]2.SERS信號(hào)探針:設(shè)計(jì)了兩條DNA序列(序列四、五)，序列四為一端修飾巰基基團(tuán)，用來(lái)連接金納米粒子；序列五為一端修飾巰基基團(tuán)，另一端修飾羅丹明基團(tuán)(R0X)，連接在金納米粒子上用作SERS檢測(cè)信號(hào)。適量配比的序列四和序列五連接在金納米粒子上組成了 SERS信號(hào)探針。
[0010]3.MicroRNA檢測(cè):把癌癥標(biāo)志物MicroRNA (或癌細(xì)胞粉碎后提取的MicroRNA)和引物1加入到上述合成的探針中，首先MicroRNA通過(guò)與四螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子探針1上的互補(bǔ)DNA雜交引發(fā)，導(dǎo)致四螺旋探針1的構(gòu)型發(fā)生變化，四螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子探針的部分序列片段被暴露出來(lái)；通過(guò)引物，在聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸(以下簡(jiǎn)稱dNTPs)作用下引發(fā)DNA聚合反應(yīng)，反應(yīng)延伸的新鏈將MicroRNA與序列一雜交的復(fù)合體以及序列二替換下來(lái)，釋放到溶液中；在引物2、聚合酶和dNTPs作用下引發(fā)第二個(gè)聚合反應(yīng)，此時(shí)MicroRNA被釋放下來(lái)，可以形成一個(gè)DNA循環(huán)反應(yīng)。被替換下來(lái)的序列二遇到切刻內(nèi)切酶、聚合酶和dNTPs,生成大量的DNA-a可以進(jìn)入下一個(gè)反應(yīng)形成一個(gè)循環(huán)。DNA-a與連接磁珠的發(fā)夾DNA發(fā)生雜交反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)型變化，形成雙鏈DNA-b并暴露出可以結(jié)合SERS信號(hào)探針的序列片段，產(chǎn)生放大的檢測(cè)信號(hào)。
[0011]4.SERS強(qiáng)度測(cè)試:通過(guò)磁性分離，去除反應(yīng)后的上清液，得到連有SERS信號(hào)探針的磁珠進(jìn)行SERS測(cè)試。
[0012]本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新性和優(yōu)越性為:1.本發(fā)明采用四螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子探針為識(shí)別探針，采用“二步法”，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。
[0013]2.本發(fā)明以特定DNA序列的四螺旋結(jié)構(gòu)分子為識(shí)別探針，可以高特異選擇性的檢測(cè)癌癥標(biāo)志物MicroRNA和癌細(xì)胞內(nèi)MicroRNA。
[0014]3.通過(guò)兩個(gè)DNA循環(huán)放大SERS信號(hào)，可以高靈敏的檢測(cè)癌癥標(biāo)志物MicroRNA和癌細(xì)胞內(nèi)MicroRNA。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為本發(fā)明所使用的四螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子探針。
[0016]圖2為本發(fā)明用于SERS檢測(cè)癌癥標(biāo)志物MicroRNA和癌細(xì)胞內(nèi)MicroRNA的示意圖。<